Name: Immunoprecipitazione con un gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Scopri l'immunoprecipitazione con gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina nelle cellule HEK-293. Questo metodo riduce la degradazione proteica e conferma l'associazione tra DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) e MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).

La Figura 1 presenta una panoramica del protocollo.
1. Preparazione di soluzioni e tamponi
<ol><li>Tampone di lisi proteica: preparare il tampone di lisi proteica seguendo un rapporto precedentemente pubblicato7 (Tabella 1).</li>
	<li>Tampone di lisi proteica + inibitore della proteasi (PI): aggiungere l'inibitore della proteasi (vedere la tabella dei materiali) al tampone sopra preparato (passaggio 1.1). Conservare a -20 °C.</li>
	<li>Tampone campione: Miscelare 900 μL di 4x tampone campione Laemmli (vedere Tabella dei materiali) e 100 μL di 2-mercaptoetanolo. Conservare a -20 °C.</li>
	<li>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con monolaurato di poliossietilene (20) sorbitano (PBS-P): miscelare 1,998 L di PBS e 2 mL di monolaurato di poliossietilene (20) sorbitano (vedere la tabella dei materiali). Conservare a temperatura ambiente.</li>
	<li>1x tampone Tris/Glycine/SDS: Miscelare 450 mL di DDW e 50 mL di 10x Tris/Glycine/SDS. Preparare a temperatura ambiente il giorno dell'uso.</li>
</ol>2. Trasfezione plasmidica
<ol><li>Coltivare le cellule HEK-293 in un piatto rivestito di collagene di 10 cm fino alla subconfluenza (80%-95%) utilizzando il terreno di coltura dell'aquila modificato di Dulbecco contenente il 10% di siero fetale bovino e l'1% di penicillina-streptomicina (10.000 unità/mL di penicillina G e 10.000 μg/mL di streptomicina) (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare 1-10 μg di plasmide7 da trasfettare per piatto e preparare una miscela di trasfezione. Aggiungere 150 mM di NaCl a un volume finale di 250 μl per piatto. Vorticare e centrifugare il composto.</li>
	<li>Aggiungere 60 μl di polietilenimmina (PEI, vedere Tabella dei materiali) da 1 mg/mL per piatto, seguiti da 150 mM di NaCl fino a un volume finale di 250 μl di soluzione di PEI.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di PEI alla miscela di trasfezione per ottenere una soluzione miscelata. Immediatamente vortice (alla massima velocità per 3-5 s, eseguire lo stesso in seguito) e girare verso il basso.</li>
	<li>Incubare a temperatura ambiente per 15-30 min. Durante questo periodo, cambia il mezzo delle cellule HEK-293.</li>
	<li>Cospargere 500 μL/piatto di soluzione mista su tutto il piatto di cellule HEK-293 e incubare per una notte (13-14 h).</li>
	<li>Eseguire lo scambio medio il giorno successivo.</li>
</ol>3. Lisi cellulare e preparazione del campione
NOTA: Per evitare la degradazione delle proteine, i passaggi successivi devono essere eseguiti il più possibile senza conservare o congelare il campione in modo da congelarlo.
<ol><li>Circa 48 ore dopo la trasfezione, lavare le cellule tre volte con PBS ghiacciato, aggiungere 500 μL/piatto di tampone di lisi proteica + PI e raccogliere le cellule con raschietto cellulare e pipetta in una provetta a basso adsorbimento proteico su ghiaccio.</li>
	<li>Vorticare ogni 5 minuti e incubare i campioni su ghiaccio per 10 minuti.</li>
	<li>Centrifugare a 16.400 x g per 10 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una provetta fresca da 1,5 ml a basso adsorbimento proteico. I campioni possono essere conservati a -80 °C.</li>
	<li>Determinare la concentrazione proteica dei campioni con un kit di misurazione della concentrazione proteica secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Separare 200-1000 μg della stessa quantità di proteine in ciascun campione, quindi aggiungere tampone di lisi proteica + PI per regolare il volume totale a 500-1000 μL. NOTA: I seguenti passaggi vengono eseguiti sul ghiaccio.</li>
</ol>4. Preparazione del liquame
NOTA: Preparare un impasto 1:1 di gel proteico G e gel di affinità per etichette epitopiche il giorno prima o il giorno dell'immunoprecipitazione.
<ol><li>Preparazione di un gel proteico G<ol><li>Utilizzando una punta con l'estremità tagliata, mescolare bene e quindi separare il gel proteico G (vedi Tabella dei materiali) in modo da preparare 20 μl di microsfere per campione.</li>
		<li>Centrifugare a 12.000 x g per 20 s a 4 °C e mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lisi proteica + PI al gel di proteina G preparato al punto 4.1.2 e mescolare picchiettando e capovolgendo. Centrifugare a 12.000 x g per 20 s a 4 °C, mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi e scartare il surnatante.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.1.3 tre volte.</li>
		<li>Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi proteica al gel proteico G per ottenere un impasto di gel proteico G 1:1. L'impasto di gel proteico G può essere conservato a 4 °C per circa 1 giorno.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di un gel di affinità per etichette epitopiche<ol><li>Utilizzando una punta con l'estremità tagliata, agitare bene e quindi separare il gel di affinità per etichette epitopiche (vedi Tabella dei materiali) in modo da preparare 10-15 μl di microsfere per campione.</li>
		<li>Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C e attendere 1 minuto sul ghiaccio per consentire alle perle di stabilizzarsi. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lisi proteica + PI al gel di affinità per etichette epitopiche preparato al punto 4.2.2 e mescolare picchiettando e capovolgendo. Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C, mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi e gettare il surnatante con una pipetta.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.2.3 due volte.</li>
		<li>Aggiungere 500 μl di glicina 0,1 M (pH 3,5) al gel di affinità per etichette epitopiche preparato al punto 4.2.4 e mescolare picchiettando e capovolgendo. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere gli anticorpi liberi del tag epitopo. Entro 20 minuti dall'aggiunta di glicina, centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C, porre le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi e scartare il surnatante.</li>
		<li>Aggiungere 500 μl di tampone di lisi proteica + PI al gel di affinità per etichette epitopiche preparato al punto 4.2.5 e mescolare picchiettando e invertendo. Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C, mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi e scartare il surnatante.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 4.2.6 tre volte.</li>
		<li>Aggiungere un volume uguale di tampone di lisi proteica al gel di affinità per etichette epitopiche per preparare un impasto di gel di affinità per etichette epitopiche 1:1. L'impasto gel di affinità dell'etichetta epitopica può essere conservato a 4 °C per circa 1 giorno.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Preclearing con il gel proteico G e cattura dei complessi proteici con il gel di affinità per tag epitopo
<ol><li>Miscelare l'impasto proteico G 1:1 (preparato nella fase 4) con una pipetta dotata di puntale tagliato e aggiungere 40 μl alla volta al campione.</li>
	<li>Ruotare il campione per 1 ora su un rotatore (vedi Tabella dei materiali) in circa 30 s per ciclo in una camera refrigerata (4 °C).</li>
	<li>Centrifugare a 12.000 x g per 20 s a 4 °C e mettere le perle sul ghiaccio per 1 minuto per consentire alle perle di livellarsi.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 ml a basso adsorbimento proteico.</li>
	<li>Separare il campione per l'input dal campione al punto 5.4 e trasferirlo in una nuova provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere al campione 20-30 μl di impasto in gel per etichette di epitopi 1:1.</li>
	<li>Ruotare su un rotatore per circa 30 s per ciclo in una camera refrigerata (4 °C) per 2 h.</li>
	<li>Aggiungere il tampone campione all'ingresso preparato al punto 5.5 per diluirlo a 4 volte e riscaldare a 98 °C per 10 minuti. L'ingresso può essere memorizzato a -80 °C. NOTA: A causa della possibilità di degradazione delle proteine dovuta al congelamento e allo scongelamento, i passaggi successivi devono essere eseguiti senza preservare il più possibile le proteine.</li>
</ol>6. Lavaggio ed eluizione delle proteine precipitate
<ol><li>Impostare la temperatura del blocco termico a 98 °C.</li>
	<li>Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C e attendere 1 minuto sul ghiaccio per consentire alle perle di stabilizzarsi. Eliminare il surnatante utilizzando una pipetta.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lisi proteica + PI e mescolare picchiettando e invertendo. Ruotare su un rotatore per circa 30 s per ciclo in una camera refrigerata (4 °C) per 5 min. Centrifugare a 5.000 x g per 30 s a 4 °C, attendere 1 minuto sul ghiaccio per consentire alle perle di stabilizzarsi e scartare il surnatante.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 6.3 5-10 volte.</li>
	<li>Aggiungere 10 μl di tampone campione al campione preparato al punto 6.4. Far bollire a 98 °C per 10 min.</li>
	<li>Centrifugare a 5.000 x g a 4 °C per 30 s.</li>
	<li>Posizionare una colonna in una nuova provetta a basso adsorbimento proteico e trasferire il gel nella colonna utilizzando una pipetta con punta tagliata. Viene utilizzata una colonna per evitare la contaminazione del gel.</li>
	<li>Centrifugare a 9.730 x g per 1 min a 4 °C. Raccogli il flusso. Il campione può essere conservato a -80 °C. NOTA: Se la degradazione del campione è un problema, è necessario eseguire il seguente immunoblotting senza congelamento.</li>
</ol>7. Immunoblotting
NOTA: Le procedure di immunoblotting si basano su rapporti precedenti 7,8.
<ol><li>Caricare campioni interi su un gel di poliacrilammide dodecilsolfato di sodio (SDS-PAGE, vedere Tabella dei materiali). NOTA: Se necessario, utilizzare gel a pozzetti grandi in modo che l'intero campione possa essere trasferito. Qui sono stati utilizzati gel con pozzetti da 50 μL.</li>
	<li>Posizionare i gel nella camera di elettroforesi e aggiungere 1x tampone Tris/Glicina/SDS (vedi Tabella dei materiali) fino al volume appropriato intorno ai gel.</li>
	<li>Gel elettroforesi a 100 V e 400 mA.</li>
	<li>Trasferire su membrane in fluoruro di polivinilidene (PVDF, vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Bloccare le macchie di membrana in PVDF con latte scremato al 5% in PBS-P per 1 ora a temperatura ambiente.</li>
	<li>Lavare la membrana tre volte con PBS-P su uno shaker alla massima velocità per 5 minuti. Eseguire la stessa procedura successivamente durante il lavaggio.</li>
	<li>Incubare per una notte su uno shaker con l'anticorpo primario (vedere la tabella dei materiali) a 4 °C.</li>
	<li>Lavare la membrana tre volte con PBS-P il giorno successivo.</li>
	<li>Incubare per 1 ora con l'anticorpo secondario su un agitatore a temperatura ambiente. NOTA: Se il peso molecolare della proteina bersaglio è vicino alla catena pesante IgG, che ha un peso molecolare di circa 50 kDa, è possibile utilizzare un anticorpo secondario specifico per la catena leggera per evitare la sovrapposizione della banda bersaglio con la catena pesante IgG. Questo studio ha utilizzatoanticorpi 7 specifici per la catena leggera o Veriblot come reagente per la rilevazione della proprietà intellettuale (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Identificare bande di proteine con substrati luminescenti di perossidasi. La membrana può essere salvata in PBS dopo averla lavata due volte con PBS-P.</li>
	<li>Spelare per 10 minuti con una soluzione di strippaggio (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Lavare tre volte e bloccare con il 5% di latte scremato in PBS-P. Il protocollo successivo è lo stesso del passaggio 7.6 in poi.</li>
</ol>

Analisi dell'interazione proteica in cellule HEK-293 mediante co-immunoprecipitazione

<ol><li>Braun, P., Gingras, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+protein-protein+interactions%3A+from+egg-white+to+complex+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks.</a> Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).</li>
<li>Yanagida, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+proteomics%3B+current+achievements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B-Analytical+Technologies+in+the+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Functional proteomics; current achievements.</a> Journal of Chromatography B-Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 771 (1-2), 89-106 (2002).</li>
<li>Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interaction+detection%3A+methods+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interaction detection: methods and analysis.</a> International Journal of Proteomics. 2014, 147648(2014).</li>
<li>Hopp, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+short+polypeptide+marker+sequence+useful+for+recombinant+protein+identification+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification.</a> Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).</li>
<li>Gerace, E., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+pull-down+of+proteins+using+anti-FLAG+M2+agarose+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads.</a> Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).</li>
<li>Einhauer, A., Jungbauer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLAG+peptide%2C+a+versatile+fusion+tag+for+the+purification+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biochemical+and+biophysical+methods%22%5BJournal%5D)">The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins.</a> Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).</li>
<li>Egusa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+activation+of+PPAR%CE%B1+maintains+thermogenic+capacity+of+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes.</a> iScience. 26 (7), 107143(2023).</li>
<li>Nagano, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+classical+brown+adipocytes+in+the+adult+human+perirenal+depot+is+highly+correlated+with+PRDM16-EHMT1+complex+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression.</a> PLoS One. 10 (3), e0122584(2015).</li>
<li>Seale, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+brown+fat+determination+by+PRDM16%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16.</a> Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).</li>
<li>Kajimura, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+brown+and+white+fat+gene+programs+through+a+PRDM16%2FCtBP+transcriptional+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex.</a> Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).</li>
<li>Shinkai, Y., Tachibana, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H3K9+methyltransferase+G9a+and+the+related+molecule+GLP%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP.</a> Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).</li>
<li>Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF%CE%B1+effects+on+adipocytes+are+influenced+by+the+presence+of+lysine+methyltransferases%2C+G9a+%28EHMT2%29+and+GLP+%28EHMT1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biology%22%5BJournal%5D)">TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1).</a> Biology. 12 (5), 674(2023).</li>
<li>Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT1+controls+brown+adipose+cell+fate+and+thermogenesis+through+the+PRDM16+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex.</a> Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).</li>
<li>Bian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+establishing+a+protein-protein+interaction+network+using+tandem+affinity+purification+followed+by+mass+spectrometry+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101569(2022).</li>
<li>Cristea, I. M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity+purification+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity purification of protein complexes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+control+of+beige+fat+biogenesis+by+PRDM16+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization.</a> Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).</li>
<li>Holden, P., Horton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crude+subcellular+fractionation+of+cultured+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines.</a> BMC Research Notes. 2, 243(2009).</li>
<li>Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+the+detergent+concentration+conditions+for+immunoprecipitation+%28IP%29+coupled+with+LC-MS%2FMS+identification+of+interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins.</a> Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).</li>
<li>Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+salt+fractionation+of+nuclei+to+analyze+chromatin-associated+proteins+from+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BIO-PROTOCOL%22%5BJournal%5D)">Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells.</a> BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175(2017).</li>
</ol>

Dichiariamo che nessuno degli autori ha conflitti di interesse relativi a questo studio.

Questo protocollo è quasi come i protocolli 5,7,14,15 precedentemente riportati. Il punto importante di questo protocollo è che non interrompiamo mai l'esperimento dalla fase di lisi cellulare alla fase di immunoprecipitazione. La degradazione delle proteine ostacola il rilevamento dei PPI. Il decorso prolungato e i ripetuti cicli di gelo-disgelo degradano le proteine. L'elettroforesi in SDS-PAGE dovrebbe essere eseguita anche lo stesso giorno dell'immunoprecipitazione, non solo per ridurre al minimo la degradazione delle proteine, ma anche per massimizzare il rilevamento dei PPI.
Negli adipociti termogenici, l'interazione tra EHMT1 e PRDM16 è stata riportata in uno studio precedente13. Il complesso EHMT1 - PRDM16 regola il destino e la termogenesi delle cellule adipocitarie brune13. EHMT1 fa stabilizzare PRDM16 interrompendo l'interazione tra PRDM16 e proteina legante la proteina amiloide (APPBP) 216. Questa stabilizzazione PRDM16 è regolata da cullin(CUL) 2-APPBP2 e EHMT116.
In questo studio, sono state utilizzate cellule HEK-293 perché le cellule HEK-293 sono ampiamente utilizzate nella produzione di proteine ricombinanti17. Possono essere utilizzate altre linee cellulari facili da trasfettare con i plasmidi, come le cellule Cos-7 e le cellule Hela. Il PEI è stato utilizzato per la trasfezione perché il PEI è più economico e più semplice rispetto alla lipofezione convenzionale.
La preclearing, la rotazione in un gel di affinità per etichette epitopo e il lavaggio sono passaggi particolarmente importanti in questo metodo. Il preclearing può rimuovere le proteine che si legano in modo non specifico al gel. Inoltre, il tempo di rotazione con il gel di affinità del tag epitopo è importante perché un tempo eccessivo può comportare il rilevamento di proteine non specifiche e un tempo insufficiente può ostacolare il rilevamento delle proteine bersaglio.
Vanno osservati i seguenti punti. Le cellule HEK-293 si staccano facilmente; pertanto, durante la preparazione dei campioni devono essere utilizzati piatti rivestiti di collagene. La soluzione di PEI è citotossica; pertanto, il terreno deve essere sostituito dopo la trasfezione senza lasciare le cellule per un periodo prolungato. Se non si osservano PPI, la quantità di plasmidi trasfettati può essere insufficiente e/o la quantità di proteine immesse nell'IP può essere bassa. Inoltre, se il numero di lavaggi è eccessivo, le interazioni potrebbero non essere rilevate. Per affrontarli, si può prendere in considerazione quanto segue: aumentare la quantità di plasmide introdotto nelle cellule HEK-293, aumentare la quantità di proteine utilizzate per l'IP e ridurre il numero di lavaggi. Inoltre, se rimane troppo surnatante nel lavaggio finale, traboccherà dai pozzetti del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide. Se si osservano bande aspecifiche, la quantità di plasmide/proteina utilizzata per l'IP potrebbe essere troppo elevata o il numero o l'intensità dei lavaggi potrebbero essere insufficienti. Questi possono essere affrontati riducendo la quantità di plasmide/proteina utilizzata per l'IP, aumentando il numero di lavaggi o aumentando il potere di lavaggio aumentando la concentrazione di sale nel tampone di lavaggio.
I detergenti di uso comune come l'etere di ottilfenile di poliossietilene (10) possono alterare gli IPP funzionalmente significativi18. I detergenti più delicati possono aumentare il recupero di complessi funzionalmente importanti, mentre possono produrre un livello inaccettabile di interazioni aspecifiche a causa di una solubilizzazione incompleta. Il tampone di lisi proteica utilizzato nel presente studio contiene l'1% di poliossietilene (10) ottilfeniletere. Questo tampone lisa le proteine citoplasmatiche con elevate quantità di proteine sovraespresse dai plasmidi trasfettati. Quando l'immunoprecipitazione viene eseguita su campioni preparati separando nuclei e citoplasma, il fondo è ridotto rispetto ai campioni preparati mediante lisi di cellule intere e possono essere identificate chiare bande bersaglio17. Se l'immunoprecipitazione viene eseguita con proteine nel nucleo, le proteine nucleari possono essere estratte utilizzando un kit di estrazione nucleare commerciale o distruggendo e rimuovendo il citoplasma con un tampone a basso contenuto di sale contenente detergente e successivamente estraendo proteine nucleari con tampone ad alto contenuto di sale19. Il tempo di sviluppo dell'immunoblotting deve essere regolato non solo per evitare il fondo, ma anche per rilevare determinate bande.
Questo metodo aveva diverse limitazioni. In primo luogo, abbiamo utilizzato un PPI che ci si aspetta altamente di rilevare. In secondo luogo, poiché l'espressione di ciascun gene dipende dalla combinazione di plasmidi, si può ottenere una proteina insufficiente e l'interazione può, quindi, non essere rilevata.
In sintesi, utilizzando questo metodo, i PPI possono essere confermati in modo economico e semplice rispetto alla spettrometria di massa. Il PPI tra le varie proteine fuse con tag epitopo può anche essere confermato utilizzando anticorpi di affinità contro ciascun tag invece del gel di affinità tag epitopo. Metodi di immunoprecipitazione simili possono essere eseguiti in altri tipi di cellule introducendo un plasmide che esprime qualsiasi proteina fusa al tag DYKDDDDK. Inoltre, l'utilizzo di anticorpi endogeni al posto di un gel di affinità per tag epitopo consente di confermare i PPI endogeni in vari tipi di cellule.

Le proteine svolgono un ruolo importante in tutte le funzioni cellulari, tra cui l'elaborazione delle informazioni, il metabolismo, il trasporto, il processo decisionale e l'organizzazione strutturale. Le proteine mediano le loro funzioni interagendo fisicamente con altre molecole. Le interazioni proteina-proteina (PPI) sono importanti per mediare le funzioni cellulari, come la mediazione della trasduzione del segnale, il rilevamento dell'ambiente, la conversione dell'energia in movimento fisico, la regolazione dell'attività degli enzimi metabolici e di segnalazione e il mantenimento dell'organizzazione cellulare1. Pertanto, i PPI possono essere utilizzati per chiarire funzioni sconosciute2. I metodi per rilevare gli IPP possono essere classificati in tre tipi: in vitro, in vivo e in silico. Per la rilevazione in vitro di PPI sono state utilizzate la co-immunoprecipitazione (co-IP), la cromatografia di affinità, la purificazione di affinità tandem, gli array proteici, il phage display, la complementazione di frammenti proteici, la cristallografia a raggi X e la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare3. Tra questi metodi, il co-IP è ampiamente utilizzato per la sua semplicità.
Il tag di fusione FLAG è costituito da otto amminoacidi (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDDK), incluso un sito di scissione dell'enterochinasi, ed è stato specificamente progettato per la cromatografia di immunoaffinità4. Le proteine marcate con DYKDDDDK vengono riconosciute e catturate utilizzando un anticorpo anti-DYKDDDDK. Pertanto, vengono efficacemente abbattuti utilizzando le perle di agarosio leganti DYKDDDDK5 per confermare il loro legame a proteine specifiche in modo semplice. L'immunoprecipitazione può essere eseguita in una varietà di cellule e un'ampia gamma di PPI può essere confermata utilizzando anticorpi contro la proteina di interesse. L'immunoprecipitazione e l'eluizione di peptidi con perle di agarosio anti-DYKDDDDK sono state precedentemente riportate5.
Qui, forniamo un semplice metodo di immunoprecipitazione in cui un plasmide che codifica per una proteina marcata con DYKDDDDK viene introdotto transitoriamente nelle cellule HEK-293 per confermare l'associazione di due proteine di interesse. Alcuni anticorpi DYKDDDDK possono legarsi sia all'N-terminale che al C-terminale delle proteine di fusione, ma non ad altri6. Pertanto, per evitare confusione, dovrebbe essere scelto l'anticorpo che riconosce il tag fuso sia con l'estremità N che con quella C. Quando si inserisce un tag epitopo, può essere possibile evitare cambiamenti conformazionali nella proteina inserendo da 3 a 12 coppie di basi tra il tag epitopo e la proteina bersaglio. Tuttavia, la sequenza inserita dovrebbe essere una coppia di basi in multipli di 3 per evitare lo spostamento dei fotogrammi.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA (pH8.0)</td><td>Nippon gene</td><td>311-90075</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti, 50 e micro; L</td><td>Biorad</td><td>4561034</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glicina/SDS</td><td>Biorad</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Topo IgG, Pecora Addominale intera collegata a HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td></td></tr><tr><td>IgG anti-coniglio, Asino addominale intero collegato a HRP</td><td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Raschietto cellulare M</td><td>Sumitomo Bachelite</td><td>MS-93170</td><td></td></tr><tr><td>Collagene I Coat Dish 100 mm</td><td>IWAKI</td><td>4020-010</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, senza EDTA Inibitore della proteasi Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, integratore GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (-)</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>072-00626</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>077-00735</td><td></td></tr><tr><td>HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>C29F4</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Tampone per campioni</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Colonne per cromatografia Micro Bio-Spin Biorad</td><td></td><td>7326204</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell per mini gel prefabbricati</td><td>Biorad</td><td>1658004JA</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale ANTI-FLAG M2 prodotto nel topo</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-FLAG-PRDM16</td><td>Questo documento</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-EHMT1</td><td>Questo documento</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-vector</td><td>Questo documento</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Grado di trasfezione lineare Polietilenimina cloridrato</td><td>PSI</td><td>24765</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina-streptomicina</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine BCA Pierce</td><td>Thermo scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene(10) Etere ottilfenilico</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>168-11805</td><td></td></tr><tr><td>Poliossietilene(20) Monolaurato di sorbitano</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>167-11515</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Sepharose 4 confezioni da laboratorio a flusso rapido</td><td>Cytiva</td><td>17061801</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubes</td><td>eppendorf</td><td>30108442</td><td></td></tr><tr><td>ROTATOR RT-5</td><td>TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>latte scremato</td><td>Morinaga</td><td>0652842&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di strippaggio</td><td>FUJIFILM Wako</td><td>193-16375</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack</td><td>Biorad</td><td>1704156B03</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo System</td><td>Biorad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino testato USDA (FBS)</td><td>HyClone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Veriblot</td><td>Abcam</td><td>ab131366</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-actina (13E5) mAb di coniglio&nbsp;#4970</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>4970S</td><td></td></tr></tbody></table>

immunoprecipitazione con un gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina

Immunoprecipitation with an Anti-Epitope Tag Affinity Gel to Study Protein-Protein Interactions

Le interazioni proteina-proteina (PPI) svolgono un ruolo fondamentale nei fenomeni biologici, come l'organizzazione cellulare, la trasduzione del segnale intracellulare e la regolazione trascrizionale. Pertanto, la comprensione dei PPI è un importante punto di partenza per ulteriori indagini sulla funzione della proteina bersaglio. In questo studio, proponiamo un metodo semplice per determinare il legame di due proteine bersaglio introducendo vettori di espressione di mammiferi nelle cellule HEK-293 utilizzando il metodo della polietilenimmina, lisando le cellule in un tampone di lisi proteica fatto in casa e abbassando le proteine bersaglio su un gel di affinità per tag epitopo. Inoltre, il PPI tra le varie proteine fuse con tag epitopo può essere confermato utilizzando anticorpi di affinità contro ciascun tag invece del gel di affinità tag epitopo. Questo protocollo potrebbe anche essere utilizzato per verificare vari PPI, compresi gli estratti nucleari, da altre linee cellulari. Pertanto, può essere utilizzato come metodo di base in una varietà di esperimenti PPI. Le proteine si degradano con un decorso temporale prolungato e ripetuti cicli di gelo-disgelo. Pertanto, la lisi cellulare, l'immunoprecipitazione e l'immunoblotting devono essere eseguite nel modo più fluido possibile.

Gli adipociti termogenici, noti anche come adipociti marroni e beige, hanno potenziali effetti anti-obesità e anti-intolleranza al glucosio. PR (PRD1-BF1-RIZ1 omologo) contenente il dominio 16 (PRDM16) è un cofattore di trascrizione che svolge un ruolo importante nel determinare l'identità degli adipociti termogenici 9,10.
L'EHMT1 (istone-lisina N-metiltransferasi 1 eucromatica), nota anche come GLP, catalizza principalmente la mono- e dimetilazione della lisina 9 dell'istone H3 (H3K9) utilizzando il cofattore S-adenosil metionina 11. Un precedente rapporto ha indicato che EHMT1 è una metiltransferasi essenziale nel complesso PRDM16 che controlla il destino delle cellule adipose termogeniche attraverso la metilazione degli istoni12,13. Inoltre, abbiamo precedentemente riportato che i livelli di espressione di PRDM16 e EHMT1 sono significativamente correlati con quelli dei geni termogenici nel tessuto adiposo bruno perirenale umano (BAT), suggerendo che sia PRDM16 che EHMT1 svolgono un ruolo importante nello sviluppo della BAT umana8.
Per dimostrare l'efficienza di questo protocollo come metodo per confermare i PPI, abbiamo trasfettato DYKDDDDK-PRDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1 in cellule HEK-293 e immunoprecipitato DYKDDDDK-PRDDM16 utilizzando il protocollo di cui sopra. PRDM16 marcato con DYKDDDDK e EHMT1 marcato con HA sono stati inseriti nei siti di clonazione del vettore di espressione dei mammiferi pcDNA3.1 (vedi Tabella dei materiali). L'immunoblotting ha confermato l'associazione tra DYKDDDDK-PRDDM16 e HA-EHMT1 in gruppi trasfettati con DYKDDDDK-PRDDM16 e HA-EHMT1 (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica della co-immunoprecipitazione. Lo schema del protocollo è mostrato qui. Il lato destro mostra il flusso di lavoro del protocollo; Il lato sinistro mostra una rappresentazione grafica delle reazioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66085/66085fig02.jpg"> Figura 2: PRDM16 associato a EHMT1. Le cellule HEK-293 sono state trasfettate con vettore (controllo negativo), DYKDDDDK-PRDM16 o DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1. La co-immunoprecipitazione è stata successivamente eseguita utilizzando un gel di affinità per tag DYKDDDDK, seguita da immunoblotting. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66085/66085fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">Tampone di lisi proteica 250 mL (filtrazione 0,22 μm, conservare a 4 °C)</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Ml</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
		</tr><tr><td>1 M Tris pH 8.0</td>
			<td>12.5</td>
			<td>50 mM</td>
		</tr><tr><td>5 M NaCl</td>
			<td>7.5</td>
			<td>150 mM</td>
		</tr><tr><td>0,5 M Acido etilendiamminotetraacetico</td>
			<td>0.5</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr><tr><td>Glicerolo</td>
			<td>25</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>Poliossietilene(10) Etere ottilfenile</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>DDW</td>
			<td>202</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Totale</td>
			<td>250</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione del tampone di lisi proteica.

Le interazioni proteina-proteina sono importanti per chiarire la funzione delle proteine bersaglio e la co-immunoprecipitazione (co-IP) può facilmente confermare i PPI. Abbiamo trasfettato transitoriamente un plasmide codificante una proteina marcata con epitopo in cellule HEK-293 e sviluppato un metodo di immunoprecipitazione per confermare facilmente il legame di due proteine bersaglio.

Immunoprecipitazione con un gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina

Protein-protein interactions (PPIs) play a pivotal role in biological phenomena, such as cellular organization, intracellular signal transduction, and ...

Lo scopo della nostra ricerca comprende l'esplorazione dei meccanismi molecolari che regolano lo sviluppo e la funzione del grasso bruno e beige. I tronchi, i fattori di attrito e i cofattori come il complesso PRDM 16, NFIA e il complesso PPR alfa ELK-1 che abbiamo trovato più di recente controllano il destino e la funzione delle cellule adipose marroni e beige. Inoltre, il crosstalk degli adipociti delle cellule immunitarie è stato identificato come attori chiave.Per far progredire la ricerca nel tuo campo, impieghiamo diverse tecnologie all'avanguardia. Questi includono la PCR quantitativa e l'immunoprecipitazione della cromatina per analizzare i cambiamenti nell'espressione genica, nonché l'immunoprecipitazione e la spettrometria di massa per studiare le alterazioni delle interazioni proteina-proteina, PPI, associate alla differenziazione in adipociti beige. Nonostante si segua il protocollo standard per l'immunoprecipitazione, la rilevazione dei PPI si rivela spesso impegnativa.La degradazione delle proteine è la causa principale di questo problema, che dobbiamo evitare con cura. Questo protocollo è più semplice e meno costoso di altre tecniche per l'esame dei PPI e non include il congelamento nel processo, riducendo così il più possibile la degradazione delle proteine.

immunoprecipitation-with-an-anti-epitope-tag-affinity-gel-to-study

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tandem purificazione per affinità è un valido approccio per l'individuazione di partner di legame proteico. Come prova di concetto, questa metodologia è stata applicata al ben caratterizzato eIF4E fattore di inizio traduzione di co-precipitato i fattori coinvolti in cellule ospiti di inizio di traduzione. Questo metodo è facilmente adattabile a qualsiasi proteina cellulare o virale.

Individuazione di partner proteine ​​interagenti mediante Tandem Affinity Purification

Questo video mostra complessi proteici co-immunoprecipitati su una membrana PVDF per l'analisi dell'interazione proteina-proteina. Le proteine ridotte dei complessi sono state trattate con tripsina per scindere le singole proteine in corrispondenza dei peptidi più piccoli, quindi i peptidi rimanenti sono stati estratti dalla membrana in PVDF. Il peptide estratto derivato da entrambe le proteine del complesso è stato quindi essiccato e risospeso in una bassa concentrazione di acido formico per...

Digestione di proteine su membrana per preparare proteine co-immunoprecipitate per studi di interazione

In questo video, dimostriamo una tecnica per eseguire la co-immunoprecipitazione di proteine PD-1 wild-type e mutate marcate con GFP utilizzando perle rivestite con anticorpi anti-GFP. Le proteine PD-1-GFP legate al bead-bound sono incubate con proteine SHP2 che interagiscono con PD-1, consentendo l'identificazione di specifici motivi strutturali in PD-1 che svolgono un ruolo critico nell'interazione con SHP2.

Saggio di immunoprecipitazione per studiare le interazioni dei recettori enzimatici nelle cellule trasfettate

Questo video dimostra la purificazione di affinità tandem, una tecnica per purificare complessi proteici da cellule eucariotiche per studiare l'interazione proteina-proteina. Il complesso contiene due proteine marcate con diversi tag epitopici. Dopo la purificazione del complesso utilizzando due resine con un'affinità per i due diversi tag in modo sequenziale, la presenza di entrambe le proteine nell'eluito conferma l'interazione tra le due.

Saggio di purificazione di affinità tandem per studiare le interazioni proteina-proteina

Descriviamo qui un nuovo, robusto ed efficiente metodo di purificazione di affinità tandem (TAP) per l'espressione, l'isolamento e la caratterizzazione di complessi proteici da cellule eucariotiche. Questo protocollo potrebbe essere utilizzato per la caratterizzazione biochimica di complessi discreti e per l'identificazione di nuovi interattori e modificazioni post-traduzionali che ne regolano la funzione.

Tandem Affinity Purification di complessi proteici da cellule eucariotiche

Presentato qui sono due tecniche di ricerca di interazione proteina-proteina anticorpo-basato: immunofluorescenza e immunoprecipitazione. Queste tecniche sono adatte per lo studio delle interazioni fisiche tra le proteine per la scoperta di nuovi componenti delle vie di segnalazione cellulare e per la dinamica di proteina di comprensione.<br...

Studio delle interazioni proteina-proteina nella ricerca di autofagia

Qui, presentiamo un protocollo per una tecnica di digestione su membrana per la preparazione di campioni per la spettrometria di massa. Questa tecnica facilita la comoda analisi delle interazioni proteina-proteina.

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

L'immunoprecipitazioni quantitativa multiplex (QMI) utilizza la citometria di flusso per rilevare sensitivemente le differenze nell'abbondanza di interazioni mirate proteina-proteina tra due campioni. QMI può essere eseguita utilizzando una piccola quantità di biomateriale, non richiede tag geneticamente ingegnerizzati e può essere adattato per qualsiasi rete di interazione proteica definita in precedenza.

Quantificazione delle dinamiche della rete di interazione proteica mediante co-immunoprecipitazioni multiplexate

Questo video mostra esperimenti con successiva analisi delle interazioni proteina-proteina mediante l'uso di micro-fantasia superfici. L'approccio offre la possibilità di rilevare le interazioni delle proteine ​​nelle cellule viventi e combina le elevate capacità di throughput con la possibilità di estrarre informazioni quantitative.

In vivo di rilevamento di interazioni proteina-proteina su disegno micro, Superfici

Questo protocollo descrive come immagine interazioni proteina-proteina mediante un saggio basato su FRET prossimità.

Imaging interazioni proteina-proteina In vivo</em

Scopri l'immunoprecipitazione con gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina nelle cellule HEK-293. Questo metodo riduce la degradazione proteica e conferma l'associazione tra DYKDDDDK-PRDM16 e HA-EHMT1.

Immunoprecipitazione con un gel di affinità antiepitopo per studiare le interazioni proteina-proteina

Esplora altri video