Name: Monitoraggio dellevoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dellembrione di pulcino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Scopri come monitorare le proprietà meccaniche del tessuto neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino usando la microscopia Brillouin. Questo metodo non invasivo consente l'imaging in vivo per studiare la biomeccanica dello sviluppo embrionale.

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Questo lavoro è sostenuto dall'Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health (K25HD097288, R21HD112663).

Il protocollo è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Wayne State University.
1. Preparazione sperimentale
<ol><li>Usa una soluzione di etanolo al 70% per pulire e sterilizzare le forbici e le pinzette. Inoltre, prepara pipette monouso e una siringa.</li>
	<li>Preparare un mezzo di lavaggio aggiungendo 3.595 g di NaCl a 495 ml di acqua deionizzata. Quindi, aggiungere 5 ml di Penicillina-Streptomicina (5 U/mL) al terreno. Riempire una capsula di Petri da 100 mm con il mezzo di lavaggio e riscaldarla a 37 °C.</li>
	<li>Preparare i piatti di coltura secondo la Figura 1, che illustra la configurazione generale.<ol><li>Preparare un pezzo di carta da filtro, tagliarlo in una forma rettangolare di circa 17 mm × 20 mm e rimuovere i quattro angoli. Creare un centro cavo nella carta da filtro, di circa 7 mm × 10 mm per fissare l'embrione (Figura 1, a sinistra). NOTA: La raccolta degli embrioni è descritta nella fase 2.</li>
		<li>Fissare un anello disponibile in commercio (Φ = 1 pollice, vedere la tabella dei materiali) con uno strato di pellicola flessibile (ad es. pellicola di paraffina), assicurandosi che anche la pellicola flessibile abbia un centro cavo. Questo anello con la pellicola servirà a contenere la carta da filtro con l'embrione.</li>
		<li>Infine, posizionare l'anello preparato in una capsula di Petri da 35 mm (Figura 1, a destra). NOTA: La carta da filtro serve per fissare e trattenere l'embrione estratto posizionando la carta da filtro sulla membrana e lasciando l'embrione nell'area cava centrale (che verrà descritta in dettaglio nel passaggio 2). I quattro angoli sono stati tagliati per adattarsi alle dimensioni dell'anello esterno (non necessario se è già montato). Viene utilizzata una piastra di coltura con fondo in vetro da 35 mm per una migliore propagazione del raggio laser. Il piatto ha un pozzetto interno (Φ = 23 mm), che può essere riempito con albume per la coltura ex ovo . Il diametro dell'anello deve essere maggiore del diametro del pozzetto interno in modo che il pozzetto possa essere coperto dalla pellicola flessibile sull'anello (Figura 1, riquadro). La dimensione della carta da filtro non è limitata e può essere modificata in base alle dimensioni dell'anello scelto e della piastra di coltura. In alternativa, il fondo del piatto può essere pre-rivestito con uno strato di agarosio (spessore: ~1 mm). Rimuovendo l'agarosio dal centro dello strato utilizzando una lama, è possibile creare un pozzetto con una forma simile al centro cavo del film flessibile per caricare l'albume. Un punto critico è che i quattro lati della carta da filtro cava devono avere una larghezza sufficiente (> 5 mm) per garantire l'adesione dell'embrione.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Estrazione ed ex ovocoltura dell'embrione di pollo
NOTA: questo passaggio è stato modificato rispetto ai report 40,41 pubblicati in precedenza.
<ol><li>Dopo la pre-coltura, prelevare l'uovo dall'incubatrice e posizionarlo sul suo asse lungo sul vassoio del cartone delle uova. Pulite il guscio d'uovo con etanolo al 70%, avendo cura di coprire tutta la superficie, e poi lasciatelo riposare per 15 min.</li>
	<li>Tieni l'uovo sul suo asse corto e rompilo sul fondo. Aprire l'uovo su una capsula di Petri pulita da 100 mm per estrarne il contenuto, come illustrato nella Figura 2. Assicurati di non ruotare l'uovo mentre lo tieni e lo rompi.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta, trasferire e raccogliere circa 10 mL di albume sottile (cioè l'albume liquido42) in una provetta da 15 mL per l'uso ex ovocoltura . Riempire il pozzetto centrale della piastra di coltura con l'albume sottile raccolto (circa 0,9 ml), come mostrato nella Figura 3. Il processo di riempimento deve essere lento, evitando la formazione di eventuali bolle all'interno del pozzetto. Assicurarsi che il piatto di coltura con albume sia riscaldato a 37 °C. NOTA: Questa parabola verrà utilizzata per la coltura dell'embrione ex ovo. Durante l'imaging di Brillouin verranno utilizzate nuove piastre di coltura riempite con terreno di lavaggio (vedere fase 3).</li>
	<li>Usando carta velina, rimuovere delicatamente l'albume denso (cioè l'albume viscoso) attaccato all'embrione separando con cura l'albume dalla membrana vitellina, come mostrato nella Figura 4. Evitare il contatto diretto con la membrana vitellina.</li>
	<li>Dopo aver rimosso tutto l'albume denso, fissare con cura la carta da filtro alla membrana vitellina. Assicurarsi che l'asse del corpo dell'embrione sia allineato con l'asse lungo del rettangolo centrale sulla carta da filtro. Usa le forbici per tagliare la membrana che circonda la carta da filtro.</li>
	<li>Usando una pinzetta, allontana delicatamente la carta da filtro isolata dal tuorlo in direzione obliqua. Capovolgere la carta da filtro per posizionare l'embrione con il lato dorsale rivolto verso il basso (per la configurazione al microscopio invertito). Immergere con cautela l'intera carta da filtro da un lato dell'asse lungo nella capsula di Petri da 100 mm con il mezzo di lavaggio in modo obliquo.</li>
	<li>Lavare via il tuorlo residuo spruzzando delicatamente il mezzo di lavaggio parallelamente alla carta da filtro utilizzando una pipetta pulita. Evitare di spruzzare direttamente il mezzo di lavaggio sulla membrana.</li>
	<li>Dopo aver eliminato tutto il tuorlo, rimuovere con cautela la carta da filtro dal mezzo di lavaggio e utilizzare carta velina per assorbire il mezzo in eccesso dai bordi. Quindi, posizionare la carta da filtro con l'embrione sulla piastra di coltura, assicurandosi che il lato dorsale dell'embrione sia rivolto verso il basso, come illustrato nella Figura 5. Per mantenere l'umidità, metti una carta velina inumidita nel piatto.</li>
	<li>Trasferire il piatto di coltura nell'incubatrice sul palco per la coltura ex ovo .</li>
</ol>3. Misurazione di Brillouin dell'embrione
<ol><li>Prepara un altro set di piatti di coltura e riempili con il terreno di lavaggio. Assicurarsi che il mezzo di lavaggio sia riscaldato a 37 °C.</li>
	<li>Quando l'embrione raggiunge lo stadio di sviluppo desiderato, trasferire la carta da filtro con l'embrione nella piastra di coltura riempita con il terreno di lavaggio. Posizionare la capsula di coltura nell'incubatrice sul tavolino del microscopio Brillouin (vedere Tabella dei materiali).<ol><li>Prima di eseguire la misurazione di Brillouin, salvare un'immagine in campo chiaro dell'intero embrione come riferimento. La configurazione dettagliata del microscopio Brillouin è stata descritta in precedenza30 ed è riassunta nella sezione Risultati (Figura 6).</li>
	</ol></li>
	<li>Misurare il segnale di Brillouin di acqua e metanolo, che verrà utilizzato nella fase 4 per il processo di calibrazione.</li>
	<li>Regolare la potenza del laser incidente e il tempo di esposizione della fotocamera del dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni (EMCCD, vedere la tabella dei materiali) per ottenere almeno 10.000 conteggi del segnale di Brillouin. Utilizzando l'immagine in campo chiaro come guida, impostare l'intervallo di scansione e la dimensione del passo. Acquisire un'immagine di Brillouin della regione di interesse scansionando l'embrione utilizzando uno stadio traslazionale 2D. NOTA: L'intervallo di scansione orizzontale può essere determinato in base all'immagine in campo chiaro e l'intervallo di scansione verticale (cioè in profondità) può essere determinato in base alla potenza del segnale ottenuta da una scansione rapida e grossolana. Per evitare qualsiasi fotodanneggiamento dell'embrione, limitare la potenza incidente a 25 mW e impostare il tempo di esposizione della fotocamera EMCCD a 50 ms. È possibile scegliere una dimensione del passo di 2 μm in direzione orizzontale e 1 μm in direzione verticale per bilanciare la qualità dell'imaging e il tempo di acquisizione.</li>
	<li>Dopo aver completato la scansione, rimuovere con cautela la carta da filtro con l'embrione e utilizzare carta velina per assorbire il mezzo di lavaggio in eccesso. Quindi, rimetti la carta da filtro nel piatto di coltura pieno di albume sottile per la coltura continua nell'incubatrice sul palco.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.2-3.5 a intervalli di tempo regolari (ad esempio, 1,5 ore) per acquisire immagini di Brillouin time-lapse durante lo sviluppo dell'embrione.</li>
	<li>Ricostruire l'immagine 2D di Brillouin seguendo il passaggio 4.</li>
</ol>4. Ricostruzione dell'immagine di Brillouin
<ol><li>Calibrare lo spettrometro Brillouin utilizzando i segnali Brillouin dell'acqua e del metanolo per calcolare l'intervallo spettrale libero (FSR) e il rapporto di conversione pixel-frequenza (PR) dello spettrometro30. I valori calibrati di FSR e PR saranno utilizzati per calcolare lo spostamento di Brillouin dell'embrione ad ogni pixel. NOTA: La Figura 7A mostra uno spettro di Brillouin grezzo catturato dalla telecamera EMCCD. Sommando verticalmente lo spettro e quindi eseguendo un fitting lorentziano, è possibile ottenere la distanza di picco Δd dei due punti (Figura 7B). Ottenendo la distanza di picco dell'acqua Δdacqua e metanolo Δdmetanolo, l'FSR e il PR possono essere calcolati in base alle equazioni30: PR = 2· (ωmetanolo-ω acqua)/(Δdacqua- Δdmetanolo) e FSR = 2·ωacqua + PR·Δdacqua, con il noto spostamento di Brillouin dell'acqua ωacqua = 6,01 GHz e metanolo ωmetanolo = 4,49 GHz a 660 nm.</li>
	<li>Ottenere la distanza di picco del segnale di Brillouin in corrispondenza di ciascun pixel del campione. Calcolare lo spostamento di Brillouin in base all'FSR calibrato e al PR:campione ω = 0,5 (FSR - PR xcampione Δd)30, dove ilcampione ω è lo spostamento di Brillouin del campione e ilcampione Δd è la distanza di picco del segnale di Brillouin.</li>
	<li>Ricostruisci l'immagine di Brillouin 2D in base agli spostamenti di Brillouin di tutti i pixel. NOTA: Per condurre un'analisi locale, è possibile selezionare una regione di interesse (ad esempio, la placca neurale) dall'immagine di Brillouin acquisita e quantificarne le proprietà meccaniche. Un approccio comune consiste nel calcolare lo spostamento medio di Brillouin della regione selezionata.</li>
</ol>

Monitoraggio longitudinale della meccanica delle placche neurali nello sviluppo dell'embrione di pollo

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<li>Edrei, E., Scarcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+in+spectroscopy+and+densely+labeled-fluorescence+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics in spectroscopy and densely labeled-fluorescence applications.</a> Optics Express. 26 (26), 33865-33877 (2018).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Lo sviluppo precoce dell'embrione può essere facilmente influenzato da disturbi esterni. Pertanto, è necessaria la massima cautela durante l'estrazione e il trasferimento del campione. Un potenziale problema è il distacco dell'embrione dalla carta da filtro, che può portare al restringimento della membrana vitellina e provocare un artefatto inclinato della placca neurale nell'imaging di Brillouin. Inoltre, questo restringimento può arrestare lo sviluppo dell'embrione. È necessario prestare attenzione a diversi passaggi c...

I difetti del tubo neurale (NTD) sono gravi difetti congeniti del sistema nervoso centrale causati da errori nella chiusura del tubo neurale (NTC) durante lo sviluppo embrionale1. L'eziologia delle NTD è complessa. Gli studi hanno dimostrato che l'NTC coinvolge una sequenza di processi morfogenetici, tra cui l'estensione convergente, la flessione della placca neurale (ad esempio, la costrizione apicale), l'elevazione della piega neurale e infine l'adesione della piega neurale. Questi processi sono regolati da molteplici meccanismi molecolari e genetici 2,3 e qualsiasi malfunzionamento in questi processi può provocare NTD 4,5,6. Poiché prove crescenti suggeriscono che anche i segnali meccanici svolgono un ruolo cruciale durante le NTC 3,7,8,9,10,11 e sono state trovate relazioni tra geni e segnali meccanici 12,13,14, diventa imperativo studiare la biomeccanica dei tessuti durante la neurulazione.
Sono state sviluppate diverse tecniche per misurare le proprietà meccaniche dei tessuti embrionali, tra cui l'ablazione laser (LA)15, la dissezione e il rilassamento tissutale (TDR)16,17, l'aspirazione con micropipette (MA)18, la nanoindentazione basata sulla microscopia a forza atomica (AFM)19, i micropenetratori (MI) e le micropiastre (MP)20, la microreologia (MR) con pinzette ottiche/magnetiche 21,22,23e sensori basati su goccioline24. I metodi esistenti sono in grado di misurare le proprietà meccaniche a risoluzioni spaziali che vanno dalle scale subcellulari a quelle tissutali. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi sono invasivi perché richiedono il contatto con il campione (ad es. MA, AFM, MI e MP), l'iniezione di materiale esterno (ad es. MR e sensori basati su goccioline) o la dissezione tissutale (ad es. LA e TDR). Di conseguenza, è difficile per i metodi esistenti monitorare l'evoluzione meccanica del tessuto della placca neurale in situ25. Recentemente, l'elastografia a coerenza ottica riverberante si è dimostrata promettente per la mappatura meccanica senza contatto ad alta risoluzionespaziale 26.
La microscopia confocale Brillouin è una modalità ottica emergente che consente la quantificazione senza contatto della biomeccanica tissutale con risoluzione subcellulare 27,28,29,30. La microscopia di Brillouin si basa sul principio della diffusione spontanea della luce di Brillouin, che è l'interazione tra la luce laser incidente e l'onda acustica indotta dalle fluttuazioni termiche all'interno del materiale. Di conseguenza, la luce diffusa subisce uno spostamento di frequenza, noto come spostamento di Brillouin ωR, seguendo l'equazione31:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq01.jpg" style="margin: auto;"> (1)
Qui, è l'indice di rifrazione del materiale, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq02.jpg" style="margin: auto;"> λ è la lunghezza d'onda della luce incidente, M' è il modulo longitudinale, ρ è la densità di massa e θ è l'angolo tra la luce incidente e la luce diffusa. Per lo stesso tipo di materiali biologici, il rapporto tra indice di rifrazione e densità <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66117/66117eq03.jpg" style="margin: auto;"> è approssimativamente costante 28,32,33,34,35,36. Pertanto, lo spostamento di Brillouin può essere utilizzato direttamente per stimare i cambiamenti meccanici relativi nei processi fisiologici. La fattibilità della microscopia di Brillouin è stata convalidata in vari campioni biologici 29,37,38. Recentemente, è stata dimostrata l'imaging meccanico time-lapse di un embrione di pulcino vivo combinando un microscopio Brillouin con un sistema di incubazione sul palco39. Questo protocollo fornisce descrizioni dettagliate della preparazione del campione, dell'implementazione dell'esperimento, della post-elaborazione e dell'analisi dei dati. Ci auguriamo che questo sforzo faciliti l'adozione diffusa della tecnologia Brillouin senza contatto per lo studio della regolazione biomeccanica nello sviluppo embrionale e nei difetti alla nascita.

<table><tbody><tr><td>Piastra di Petri da 100 mm&nbsp;</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>palcoscenico motorizzato 2D&nbsp;</td><td>Prior Scientific</td><td>H117E2</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri da 35 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Brillouin con incubatore su tavolino</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Si tratta di un sistema di microscopio Brillouin costruito su misura basato su Ref. 30</td></tr><tr><td>Uova di gallina</td><td>Università del Connecticut</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>CMOS Thorlabs</td><td>CS2100M-USB</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera EMCCD</td><td>Andor</td><td>iXon</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>#2701</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro</td><td>Whatman</td><td>1004-070</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per in ovo coltura</td><td>GQF Manufacturing Company Inc.</td><td>GQF 1502&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ring</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>Corpo del microscopio</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore al palco</td><td>Oko labs</td><td>OKO-H301-PRIOR-H117</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-711-6M</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Artman instruments</td><td>N/A</td><td>3pc Micro Forbici 5</td></tr><tr><td>Siringhe</td><td>BD</td><td>305482</td><td></td></tr><tr><td>Carta velina</td><td>Kimwipes</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>DR Instruments</td><td>N/A</td><td>Set di pinze per microdissezione</td></tr></tbody></table>

monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Monitoring the Mechanical Evolution of Tissue During Neural Tube Closure of Chick Embryo

La chiusura del tubo neurale (NTC) è un processo critico durante lo sviluppo embrionale. Il fallimento di questo processo può portare a difetti del tubo neurale, causando malformazioni congenite o addirittura la mortalità. L'NTC coinvolge una serie di meccanismi a livello genetico, molecolare e meccanico. Sebbene la regolazione meccanica sia diventata un argomento sempre più interessante negli ultimi anni, rimane in gran parte inesplorata a causa della mancanza di una tecnologia adeguata per condurre test meccanici del tessuto embrionale 3D in situ. In risposta, abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare le proprietà meccaniche del tessuto embrionale di pollo in modo non invasivo e senza contatto. Ciò si ottiene integrando un microscopio confocale Brillouin con un sistema di incubazione sul palco. Per sondare la meccanica dei tessuti, un embrione pre-coltivato viene raccolto e trasferito in un'incubatrice sul palco per la coltura ex ovo . Allo stesso tempo, le immagini meccaniche del tessuto della placca neurale vengono acquisite dal microscopio Brillouin in diversi momenti durante lo sviluppo. Questo protocollo include descrizioni dettagliate della preparazione del campione, l'implementazione degli esperimenti di microscopia di Brillouin e la post-elaborazione e l'analisi dei dati. Seguendo questo protocollo, i ricercatori possono studiare longitudinalmente l'evoluzione meccanica del tessuto embrionale durante lo sviluppo.

La figura 6 mostra lo schema del microscopio Brillouin. Il sistema utilizza un laser a 660 nm come sorgente luminosa. Un isolatore viene posizionato subito dopo la testa laser per respingere qualsiasi luce retroriflessa e un filtro a densità neutra (ND) viene utilizzato per regolare la potenza del laser. Per espandere il raggio laser viene utilizzata una coppia di lenti, L1 e L2, con lunghezze focali rispettivamente di f1 = 16 mm e f2 = 100 mm. Una piastra a semionda (HWP) e un polarizzatore...

Questo protocollo è stato sviluppato per monitorare longitudinalmente le proprietà meccaniche del tessuto della placca neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino. Si basa sull'integrazione di un microscopio Brillouin e di un sistema di incubazione sul palco, che consente l'imaging meccanico dal vivo del tessuto della placca neurale in embrioni di pulcino in coltura exovo .

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

Neural tube closure (NTC) is a critical process during embryonic development. Failure in this process can lead to neural tube defects, causing congenital ...

Lo scopo di questa ricerca è quello di sviluppare un nuovo strumento in grado di misurare la meccanica tissutale di un embrione vivo. Utilizzando questo strumento, vogliamo capire come si evolve la meccanica tissutale quando l'embrione sta sperimentando la chiusura del tubo neuronale. Questo può aiutarci a capire le regole meccaniche nello sviluppo embrionale.Per misurare la rigidità dei tessuti, i metodi attuali come la microscopia a forza atomica, la nanoidentificazione e l'aspirazione con micropipette devono entrare fisicamente in contatto con il campione e applicare una forza per deformarlo. Questo è molto impegnativo per misurare la meccanica tissutale dell'embrione vivo in situ. In questo caso, abbiamo impiegato una tecnologia ottica chiamata microscopia di Brillouin.Rispetto ad altre tecnologie, la microscopia Brillouin utilizza solo un fascio di fuoco per misurare la meccanica dei tessuti. Pertanto, si tratta di un metodo senza contatto e non invasivo e ha una certa risoluzione microspaziale. Questo ci permette di catturare l'immagine meccanica time-lapse di un embrione vivo in situ.In futuro, vogliamo comprendere a fondo il ruolo della meccanica tissutale nello sviluppo embrionale. In particolare, vogliamo studiare come i fattori genetici, la via di segnalazione biochimica e la meccanica tissutale si coordinano tra loro nella morfogenesi. Questo potrebbe fornirci nuove informazioni sulla fornitura di malattie congenite come i difetti del tubo neuronale.

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Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Induzione neurale è il primo passo nella formazione del cervello. Si tratta di un meccanismo attraverso il quale nodo di Hensen (organizzatore), istruisce tessuti adiacenti ad adottare un destino neurale, cioè di dare origine al sistema nervoso. Questo video dimostra un test per l'induzione neurale in embrione di pollo.

Test di induzione neurale nell&#39;embrione Chick

Questo articolo descrive una tecnica di trapianto di tessuto che è stato progettato per verificare la segnalazione e le proprietà di patterning ectoderma cefalico superficie durante lo sviluppo cranio-facciale.

La valutazione delle proprietà di segnalazione di ectodermica epiteli durante lo sviluppo craniofacciale

Questo articolo descrive l'etichettatura di superficie...

Monitoraggio Deformazioni tessuto morfogenetica in embrione di pollo primi

Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

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Imaging del tessuto embrionale in real-time è una sfida per lunghi periodi di tempo. Qui vi presentiamo un test per monitorare i cambiamenti cellulari e sub-cellulare del midollo spinale pulcino per lunghi periodi con elevata risoluzione spaziale e temporale. Questa tecnica può essere adattato ad altre regioni del sistema nervoso e sviluppo embrionale.

Imaging ad alta risoluzione dal vivo del comportamento delle cellule in via di sviluppo neuroepitelio

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Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

Questo video illustra una tecnica per isolare le pieghe neurali craniche dalla regione del mesencefalo degli embrioni di pollo. Presenta un dettagliato processo di dissezione delle pieghe neurali, il loro posizionamento e l'attaccamento su vetrini coprioggetti rivestiti di fibronectina, seguito dall'osservazione della migrazione delle cellule della cresta neurale dalle pieghe neurali.

Isolamento delle pieghe neurali craniche da un embrione di pollo per una coltura di cellule neurali in cresta

Visualizzare e accedere all'embrione di pollo durante lo sviluppo può essere impegnativo. Abbiamo sviluppato un metodo ex ovo che è semplice, economico e può essere facilmente utilizzato in classe o in un ambiente di ricerca. Questo metodo consente l'accesso all'embrione nelle fasi avanzate dello sviluppo embrionale (HH 40).

Ottimizzato Ex-ovo Coltura di Chick embrioni a stadi avanzati di sviluppo

Qui segnaliamo la doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni utilizzando l'innesto intraspecie del tubo neuraleGFP del pulcino combinato con l'iniezione di DiI intra-vascolare. Questa tecnica sperimentale ci permette di visualizzare e studiare contemporaneamente lo sviluppo del sistema nervoso derivato dall'NCC (enterico) e del sistema vascolare, durante l'organogenesi.

Doppia etichettatura delle cellule della cresta neurale e dei vasi sanguigni all'interno degli embrioni di pollo utilizzando l'innesto del tubo neuraleGFP del pulcino e l'iniezione di colorante carbocianina

Qui, presentiamo un protocollo introducendo una serie di nuovi esperimenti di ex-ovo e approcci di modellazione fisica per studiare la meccanica della morfogenesi durante primi torsione cervello embrionale di pulcino.

I ruoli di forze fisiche in anticipo pulcino morfogenesi embrionale di sondaggio

Questo protocollo versatile descrive l'isolamento delle cellule della cresta neurale premigratoria (NCC) attraverso l'escissione di pieghe neurali craniche da embrioni di pulcino. Dopo la placcatura e l'incubazione, gli NCC migratori emergono dagli espianti di piega neurale, consentendo la valutazione della morfologia cellulare e della migrazione in un ambiente 2D semplificato.

Preparazione e analisi morfologica di colture cellulari di cresta neurale cranica di pulcino

Scopri come monitorare le proprietà meccaniche del tessuto neurale durante la neurulazione dell'embrione di pulcino usando la microscopia Brillouin. Questo metodo non invasivo consente l'imaging in vivo per studiare la biomeccanica dello sviluppo embrionale.

Monitoraggio dell'evoluzione meccanica del tessuto durante la chiusura del tubo neurale dell'embrione di pulcino

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