Epon Post Embedding Microscopia Ottica ed Elettronica Correlativa
12 gennaio 2024
Presentiamo un protocollo dettagliato per la microscopia ottica ed elettronica correlativa post-embedding di Epon utilizzando una proteina fluorescente chiamata mScarlet. Questo metodo può mantenere contemporaneamente la fluorescenza e l'ultrastruttura. Questa tecnica è suscettibile di un'ampia varietà di applicazioni biologiche.
La microscopia ottica ed elettronica correlativa è una tecnica di microscopia completamente stabile, che può combinare le informazioni di localizzazione fornite dalla microscopia a fluorescenza ed è l'ultra struttura della microscopia elettronica. Tuttavia, la mentalità di questa tecnica è quella di preservare la fluorescenza dopo aver ottenuto una semplice preparazione. Usando questa proteina fluorescente, possiamo ottenere la luce correlata e il microscopio elettronico che può mantenere contemporaneamente la fluorescenza e l'ultra struttura.
Panoramica
Questo studio presenta un protocollo dettagliato per la microscopia correlative di luce ed elettronica post-inclusione in Epon mediante l'uso della proteina fluorescente mScarlet. Il metodo preserva con successo sia la fluorescenza che l'ultrastruttura, rendendolo applicabile a diverse applicazioni biologiche.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito di Ricerca
- Microscopia correlative di luce ed elettroni
- Applicazioni delle proteine fluorescenti
- Tecniche di microscopia
Sfondo
- Combinazione di microscopia fluorescente con microscopia elettronica
- Sfide nella conservazione della fluorescenza durante la preparazione
- Utilizzo di mScarlet per un'immagine migliorata
Metodi Utilizzati
- Tecniche di microscopia correlative tra luce ed elettroni
- Tessuto cerebrale di topo come modello biologico
- Post-embedding utilizzando Epon e mScarlet
Risultati principali
- Preservazione riuscita della fluorescenza e dell'ultrastruttura
- Immagini dettagliate del tessuto cerebrale
- Allineamento efficace dei segnali di microscopia a fluorescenza e microscopia elettronica
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo affidabile per la microscopia correlative di luce ed elettroni
- Evidenzia il potenziale per applicazioni più ampie nella ricerca biologica
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La microscopia correlative di luce ed elettroni (CLEM) con inclusione in resina Epon consente la preservazione simultanea della fluorescenza e dell'ultrastruttura, affrontando una sfida fondamentale nell'imaging cellulare nella fase di scoperta. Questa capacità migliora la riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi fornendo un contesto spaziale ad alta risoluzione per la localizzazione molecolare. Il metodo supporta la fiducia predittiva in punti critici chiave dei percorsi di ricerca preclinica e nella fase iniziale di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente una localizzazione precisa di bersagli molecolari all'interno dell'ultrastruttura cellulare preservata.
- Supporta la validazione funzionale dei bersagli correlando i segnali di fluorescenza con caratteristiche ultrastrutturali.
- Facilita la riduzione dei rischi meccanicistici attraverso la visualizzazione diretta delle relazioni molecolari e strutturali.
- Migliora la fiducia predittiva per la progressione dei bersagli nel percorso di scoperta.
Sviluppo di screening e saggi
- Prepara sezioni biologiche validate per flussi di lavoro di imaging ad alto contenuto successivi.
- Garantisce riproducibilità e risultati quantitativi nell'imaging mantenendo sia la fluorescenza che l'ultrastruttura.
- Supporta la standardizzazione e la scalabilità dei saggi per applicazioni di screening che richiedono risoluzione spaziale.
- Permette una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulle strutture subcellulari.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati sulla localizzazione molecolare alle alterazioni ultrastrutturali rilevanti per la malattia in modelli preclinici.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica integrando dati di imaging multimodale.
- Supporta decisioni di avanzamento proporzionate al rischio basate su prove spaziali e molecolari solide.
- Migliora lo sviluppo di biomarcatori traslazionali correlando la fluorescenza con la patologia ultrastrutturale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale del bersaglio alla ricerca preclinica, collegando l'analisi della localizzazione molecolare con quella ultrastrutturale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi correlando dati molecolari e strutturali.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per lo sviluppo di saggi e la valutazione di composti.
- Analisi: Offre misurazioni ad alta risoluzione e output di registrazione delle immagini per analisi comparative.
- Ricerca traslazionale: Permette l'allineamento di marcatori molecolari con ultrastrutture rilevanti per la malattia in modelli preclinici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile per diversi programmi di R&S che richiedono microscopia correlativa.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro di imaging e garantisce la riproducibilità tra esperimenti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale fornendo dati spaziali robusti.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione e la progressione di asset nella scoperta e nello sviluppo preclinico, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze sia nelle tecniche di microscopia a fluorescenza che in quelle di microscopia elettronica.
- Necessita di accesso a strumentazione avanzata per l'imaging e a software per la registrazione delle immagini.
- Richiede standardizzazione tra gruppi diversi per la preparazione dei campioni e i protocolli di imaging.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi di tessuto o sistemi modello.
- Dipende dalla compatibilità delle proteine fluorescenti con l'inclusione in Epon e la preparazione per microscopia elettronica.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:44
Ultrathin Sectioning for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM)
1:33
Creating the Navigation Map for CLEM and Preparation of the Ultrathin Sections for Electron Microscopy
4:07
Image Analysis of Brightfield and Fluorescence Images of the Mouse Brain Sections for Epon Post‐Embedding Correlative Light and Electron Microscopy
6:16
Registration of the Fluorescence Microscopy Image with the Electron Microscopy Image for Correlative Light and Electron Microscopy
