Name: Produzione di matrice extracellulare cardiaca da fibroblasti umani adulti per il rivestimento di piastre di coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Scopri come produrre matrice extracellulare cardiaca da fibroblasti umani adulti per studiare le interazioni cella-matrice. Questo metodo supporta la bioingegneria tissutale cardiaca e la medicina rigenerativa.

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<meta charset="utf8"></head><body>Generazione di matrice extracellulare che imita il miocardio per colture cellulari

<ol><li>Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix%3A+A+dynamic+microenvironment+for+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Bottiglia da laboratorio da 1 L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>215-1595</td><td>Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>10 ml di pipetta sierologica</td><td>Falcon</td><td>357551</td><td>Sterile,&nbsp; polistirene</td></tr><tr><td>100 mm lastra di vetro&nbsp;</td><td>VWR</td><td>391-0578</td><td>Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Piastre da 100 mm</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>Piastra per colture cellulari sterili trattate e sterili</td></tr><tr><td>Provette sterili</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Centrifuge Provette sterili, polipropilene</td></tr><tr><td>Vetri di copertura da 22 mm x 22 mm</td><td>VWR</td><td>631-1570</td><td>Autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica da 25 mL</td><td>Falcon</td><td>357525</td><td>Sterile, &nbsp; flacone da laboratorio in polistirene</td></tr><tr><td>da 250 mL</td><td>VWR</td><td>215-1593</td><td>Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Piastre da 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>Piatto per colture cellulari sterili trattate</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td>Provette sterili sterili in polistirene</td></tr> da <tr><td>50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td>Provette sterili per centrifuga, polipropilene</td></tr><tr><td>Flacone da laboratorio da 500 mL</td><td>VWR</td><td>215-1594</td><td>Pulire e autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>piastre da 60 mm</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Piastra per colture cellulari sterile trattata</td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio (NH4OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338818</td><td>Liquid</td></tr><tr><td>Bisturi monouso</td><td>VWR</td><td>233-5526</td><td>Sterile e monouso</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>D6429-500ml</td><td>Conservare a 2-8 gradi C; evitare l'esposizione alla luce</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>F9665-500ml</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Il siero deve essere aliquotato in volumi di lavoro più piccoli</td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>VWR</td><td>232-1317</td><td>Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Gelatina dalla pelle suina</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>G1890-100G</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>commerciale Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>H1387-1L</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche grandi</td><td>VWR</td><td>233-1211</td><td>Pulire e autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Forbici per microdissezione&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S3146</td><td>Pulire e sterilizzare in autoclave prima dell'uso</td></tr><tr><td>Penicillina e Streptomicina&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P4333-100ml</td><td>Conservare a -20 °C. La soluzione&nbsp; dovrebbe essere aliquotato in volumi di lavoro più piccoli</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P9333</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio Monobasico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>P5665</td><td></td></tr><tr><td>Polvere Cloruro di sodio&nbsp;</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>S7653</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>Sodio Fosfato Bibasico</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>94046</td><td>Polvere</td></tr><tr><td>Stericup Filtri</td><td>Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td>Membrane filtranti sterili e monouso da 0,22 mm.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td>Tripsina liquida-EDTA</td></tr><tr><td></td><td>Sigma- Aldrich</td><td>T4049-100ml</td><td>Conservare a -20 &deg;C. Dovrebbe essere aliquotato in volumi di lavoro più piccoli</td></tr></tbody></table>

produzione di matrice extracellulare cardiaca da fibroblasti umani adulti per il rivestimento di piastre di coltura

Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating

La crescita dei fibroblasti dai piccoli frammenti di miocardio nativo posti in coltura è stata osservata entro 3-5 giorni (Figura 1).
Nei giorni successivi, il numero di fibroblasti ha continuato ad aumentare, probabilmente a causa della crescita sostenuta dal campione di tessuto cardiaco e della proliferazione di fibroblasti migrati sulla superficie della piastra. Non ci si deve aspettare che tutti i frammenti di miocardio ottenuti mediante disaggregazione meccanica con un bisturi producano lo stesso numero di fibroblasti nello stesso tempo, poiché i frammenti di tessuto risultanti possono avere volumi e tassi di sopravvivenza cellulare leggermente diversi. In particolare, i frammenti di miocardio con attività di crescita confermata possono essere trattenuti e riplaccati, consentendo così di essere utilizzati almeno due volte per l'isolamento dei fibroblasti.
I fibroblasti possono essere sottoposti a subcoltura per diversi passaggi per aumentare il numero di cellule disponibili per ulteriori esperimenti. Tuttavia, una volta raggiunta la confluenza, i fibroblasti cessano di proliferare in vitro e assumono attività di sintesi e secrezione, depositando matrice extracellulare. La successiva decellularizzazione lascia la superficie della placca rivestita con una rete ECM cardiaca (Figura 2). L'osservazione visiva della piastra di coltura, ad occhio nudo e utilizzando un microscopio a contrasto di fase invertito, durante la rimozione dei fibroblasti è essenziale per ridurre al minimo necessario e sufficiente il tempo di incubazione nella soluzione di decellularizzazione. La presenza di un velo galleggiante durante l'incubazione indica la permeabilizzazione e il distacco del monostrato di fibroblasti, e la soluzione di decellularizzazione deve essere diluita e rimossa immediatamente dopo.
La composizione della ECM cardiaca derivata dai fibroblasti dipende dalla fonte dei fibroblasti. Nei nostri esperimenti, la ECM cardiaca prodotta da fibroblasti isolati da cuori umani normali e da cuori umani con cardiopatia ischemica aveva diversi contenuti proteici ed esercitava diverse influenze sulla proliferazione, l'apoptosi e la migrazione delle cellule cardiache primitive11,12. Sebbene la perdita di proteine della ECM sia inevitabile durante il processo di decellularizzazione, il metodo impiegato nel presente protocollo ha preservato in larga misura la composizione e l'architettura della ECM cardiaca prodotta in vitro (Figura 3).
In questo protocollo è stato utilizzato il tessuto atriale perché può essere ottenuto sia da cuori normali (donatore) che patologici (riceventi). Mentre l'intero cuore patologico (ricevente) può essere sezionato e utilizzato per la ricerca (seguendo i principi della Dichiarazione di Helsinki e con l'approvazione del comitato etico locale), non è possibile ottenere campioni di ventricoli dal cuore del donatore al momento del trapianto. Per questo motivo, se lo scopo dello studio è quello di indagare le differenze tra tessuto cardiaco in condizioni normali e patologiche, la migliore fonte di campione è la parete atriale. A seconda della disponibilità di altre fonti di tessuto cardiaco vitali, i campioni provenienti dalle pareti atriali o ventricolari dei cuori normali o patologici possono essere utilizzati seguendo lo stesso protocollo per il rivestimento delle piastre della ECM cardiaca.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig01.jpg"> Figura 1: Isolamento dei fibroblasti cardiaci. Crescita di fibroblasti da frammenti di miocardio dopo 4 giorni (A), 8 giorni (B) e 12 giorni (C) giorni di coltura. Barre della scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig02.jpg"> Figura 2: Decellularizzazione della matrice extracellulare. Fibroblasti dopo circa 10 s (A), 20 s (B), 30 s (C), 40 s (D), 50 s (E) e 60 s (F) di incubazione nella soluzione di decellularizzazione. Barre della scala: 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66160/66160fig03.jpg"> Figura 3: Composizione della matrice extracellulare prima e dopo la decellularizzazione. Colorazione in immunofluorescenza indiretta di proteine rappresentative della matrice extracellulare cardiaca, tra cui collagene di tipo III (A,E) e tipo IV (B,F), laminina (C,G) e fibronectina (D,H), prima (A-D) e dopo la rimozione dei fibroblasti (E-H). I nuclei cellulari sono stati colorati con DAPI (blu). Barre di scala: (A-C,E-G) 50 μm; (D,H) 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66160/66160fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Soluzioni</td>
			<td colspan="2">Composizione delle soluzioni</td>
			<td>Volume finale</td>
			<td>Commenti</td>
		</tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)</td>
			<td colspan="2">Sali di alimentazione commerciale + acqua sterile a doppia distillazione + 0,35 g di bicarbonato di sodio</td>
			<td>1 litro</td>
			<td>Sterilizzato mediante filtrazione/conservazione a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di decellularizzazione</td>
			<td colspan="2">0,25% Triton X-100 + 10 mM NH4OH+ PBS</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>Sterilizzato mediante filtrazione/conservazione a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Eagle Medium modificato di Dulbecco (DMEM)</td>
			<td colspan="2">223,75 mL di DMEM + 25 mL di siero fetale bovino + 1,25 mL di soluzione di penicillina/streptomicina</td>
			<td>250 ml</td>
			<td>Conservare a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di gelatina</td>
			<td colspan="2">0,2 g di gelatina in polvere + 100 mL di soluzione salina tamponata con fosfato</td>
			<td>100 ml</td>
			<td>Sterilizzato mediante filtrazione/conservazione a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS)</td>
			<td colspan="2">0,1 g di fosfato di potassio monobasico + 0,1 g di cloruro di potassio + 4,0 g di cloruro di sodio + 0,575 g di fosfato di sodio bibasico + acqua sterile bidistillata</td>
			<td>500 ml</td>
			<td>Sterilizzato mediante filtrazione/conservazione a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di arresto della tripsina (TSS)</td>
			<td colspan="2">5 ml di siero fetale bovino + 45 ml di soluzione salina bilanciata di Hank</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>Conservare a 4 °C</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: I componenti e le rispettive concentrazioni per ciascuna soluzione utilizzata nello studio.

Produzione di matrice extracellulare cardiaca da fibroblasti umani adulti per il rivestimento di piastre di coltura

The myocardium is composed of cardiomyocytes and an even greater number of fibroblasts, the latter being responsible for extracellular matrix production. ...

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Culture del mouse cardiomiociti primari sono uno degli strumenti cardine per l'indagine di organizzazione e la funzione miofibrillare. Il protocollo che segue descrive l'isolamento e la coltura di cardiomiociti primari di cuori neonatali mouse. Le risultanti colture di cardiomiociti possono successivamente essere utilizzati per una varietà di biomeccanici, saggi biochimici e cellule biologiche.

Isolamento e Cultura della neonatali mouse Cardiomyocytes

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

Costruzione di Engineered Definito umani cardiache tessuti per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca

In questi studi, forniamo metodologia per nuovi, neonatali, impalcature cardiaci murini per l'uso in studi rigenerative.

Neonatale cardiaco Impalcature: Matrici innovativi per gli Studi rigenerativi

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Paragonabile decellularizzazione degli espianti di tessuto cardiaco fetali ed adulti come 3D-come le piattaforme per studi In Vitro

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Un metodo basato su stampo netto della creazione senza impalcatura tridimensionale del tessuto cardiaco

L'obiettivo del presente protocollo è la produzione delle fibre di intera tabella extracellulare mirati per la riparazione della ferita che sono adatti per la valutazione preclinica come parte di un impianto di impalcatura rigenerativa. Queste fibre sono prodotte dalla cultura dei fibroblasti su membrane a fibra cava ed estratte dalla dissoluzione delle membrane.

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Lo scopo di questo metodo è quello di ottenere matrici 3D derivate dal fibroblasto come scaffold naturale per i successivi saggi cellulari. I fibroblasti vengono semiizzati in una piastra di coltura pretrattata e stimolati con acido ascorbico per la generazione di matrici. Le matrici vengono decellularizzate e bloccate alle cellule rilevanti di coltura (ad esempio, cellule endoteliali).

Sistema a matrice 3D derivato da fibroblasti applicabile al saggio di formazione di tubi endoteliali

L'attuale protocollo genera tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di maglia contenenti cellule cardiovascolari derivate da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per consentire lo studio della terapia dell'impianto cellulare per le malattie cardiache.

Preparazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati a forma di mesh derivati da cellule iPS umane per la riparazione miocardia in Vivo

Qui, descriviamo una metodologia facile da usare per generare array di microtessuti cardiaci auto-assemblati 3D composti da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti preseferenziate indotte dall'uomo, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali. Questa tecnica user-friendly e a bassa richiesta cellulare per generare microtessuti cardiaci può essere implementata per la modellazione della malattia e le prime fasi dello sviluppo del farmaco.

Fabbricazione di array di microtissue cardiaci 3D utilizzando cardiomiociti derivati da iPSC umani, fibroblasti cardiaci e cellule endoteliali

Qui viene presentato un protocollo per generare tessuti connettivi ingegnerizzati per una coltura parallela di 48 tessuti in una piastra multi-pozzo con doppi poli, adatto per studi meccanicistici, modellazione di malattie e applicazioni di screening. Il protocollo è compatibile con fibroblasti di diversi organi e specie ed è esemplificato qui con fibroblasti cardiaci primari umani.

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Scopri come produrre matrice extracellulare cardiaca da fibroblasti umani adulti per studiare le interazioni cella-matrice. Questo metodo supporta la bioingegneria tissutale cardiaca e la medicina rigenerativa.

Produzione di matrice extracellulare cardiaca da fibroblasti umani adulti per il rivestimento di piastre di coltura

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