Colture cellulari neuronali da Aplysia per imaging ad alta risoluzione di coni di crescita

Nel laboratorio simulato, coltiviamo neuroni della cellula bagagliaio dal mollusco marino Plegia California car. Questi neuroni proiettano coni di crescita molto grandi, che li rendono un ottimo sistema modello per studi ad alta risoluzione sulla motilità e sul guidaggio dei coni di crescita, in particolare per l'analisi della dinamica del citoscheletro. In questo video, mostriamo come eseguire la dissezione di Plegia e la coltura delle cellule bagagliaio.

Ciao, sono Daniel Suter del Dipartimento di Scienze Biologiche della Purdue University. Oggi vi mostreremo la procedura per la dissezione, la coltura e l'imaging dei neuroni della cellula plegia del dorso. I neuroni del C, her apia CAA sono stati ampiamente utilizzati negli studi relativi all'apprendimento e alla memoria.

Dato che Apia ha un sistema nervoso semplice e neuroni di grandi dimensioni adatti all'elettrofisiologia, nel nostro laboratorio utilizziamo questi neuroni perché i loro coni di crescita sono ampi e particolarmente adatti all'acquisizione di immagini ad alta risoluzione della dinamica proteica associata alla motilità e al guidaggio del cono di crescita. Il procedimento completo comprende i seguenti passaggi.

Il primo giorno, l'animale viene sacrificato e dissezionato per ottenere i gangli addominali. Il secondo giorno, vengono preparate le piastre di coltura. I cluster cellulari posteriori vengono dissezionati e i singoli neuroni sono seminati.

Al terzo giorno, viene costruita una camera per l'acquisizione di immagini in differenziale interferenza contrasto (DIC) per l'analisi in time-lapse delle cellule, con dimostrazione e commento narrato. La procedura di oggi sarà eseguita da iTune Lee, studentessa laureata nel mio laboratorio. Ora vi mostrerà come preparare i neuroni della cellula dorsale.

Iniziamo. I neuroni delle cellule posteriori fanno parte del ganglio addominale del sistema nervoso pleurale, quindi isoleremo l'intero ganglio addominale per la digestione enzimatica. Successivamente separeremo i due gruppi di cellule a sacco dal resto del ganglio.

Il ganglio addominale verrà digerito in questa soluzione di fase due per 15-16 ore al fine di ammorbidire i tessuti connettivi. Ora dobbiamo preparare una grossa siringa da 60 millilitri riempita con cloruro di magnesio 0,5 M per sacrificare l'animale e per i ferri da dissezione, ovvero una pinzetta da dissezione, forbici e forbici grandi. Utilizziamo Aplysia californica provenienti dalla costa californiana, che pesano circa 150 grammi.

Manteniamo gli animali in un acquario per aragoste per un massimo di tre o quattro settimane. L'animale viene iniettato con soluzione di cloruro di magnesio vicino alla testa, all'interno della cavità corporea. Massaggiare l'animale aiuta a diffondere la soluzione e impedisce che si contragga.

Fissare l'animale per la testa e per la coda su una tavola di polistirolo utilizzando aghi da siringa. Sollevare il muscolo della parete corporea con una pinzetta e aprire la cavità corporea con un paio di forbici grandi. Quindi praticare un'incisione lungo il fianco della parete corporea dalla testa alla coda e fissare il muscolo alla tavola.

Successivamente, il ganglio addominale deve essere individuato al di sotto dell'ovaio, un organo giallastro simile a una spazzola. Il ganglio addominale può essere localizzato. Staccare il ganglio recidendo i nervi con le forbici da dissezione sulla faccia anteriore e posteriore del ganglio.

Quindi trasferire il ganglio in un tubo da prova contenente un millilitro della soluzione dislocata e collocarlo in un bagno d'acqua a 22 gradi per 15,5 ore. Durante questo periodo di incubazione, il tessuto connettivo si ammorbidirà fino a un punto in cui i cluster cellulari posteriori potranno essere rimossi facilmente. Prima di iniziare la coltura delle cellule posteriori, prepareremo le lamelle su cui verranno coltivati i neuroni.

Cultiviamo i neuroni della radice dorsale su coprivetrini rivestiti, posizionati in piatti di Petri da 35 millimetri. Successivamente, vengono immersi in un mezzo L 15 A SW, un mezzo di coltura ad alto contenuto salino. Per questo tipo di cellule, di solito prepariamo da otto a dieci piatti di Petri con coprivetrini per ogni animale.

Ora discutiamo gli strumenti utilizzati per la semina dei neuroni delle cellule a sacco. Per la dissezione dei cluster di cellule a sacco, avremo bisogno di tre piatti petri senza coprivetri riempiti con L 15 A SW, pinzette e forbici sterilizzate con alcol e una punta gialla piegata collegata a una pipetta P 20. La punta gialla viene riscaldata passandola rapidamente sulla fiamma di un becco Bunsen e quindi piegata con l'ausilio delle pinzette.

Attenzione a non schiacciare la parte curva. In caso contrario, l'aggregato cellulare potrebbe rimanere bloccato in quel punto in seguito. La dissezione e la semina delle cellule del sacco di plegia vengono effettuate a temperatura ambiente sotto la lente stereoscopica.

Ora l'incubazione enzimatica di 15,5 ore è terminata e possiamo trasferire il ganglio addominale dallo spazio del disco a una delle capsule operative contenenti mezzo L 15 A SW. Prima di mostrare come vengono isolate le cellule del sacco, diamo un'occhiata allo schema. Per visualizzare come viene dissezionato il ganglio addominale, tagliamo innanzitutto il ganglio addominale al centro.

Come puoi vedere da questa linea. Effettuiamo quindi due tagli davanti e dietro la parte posteriore. In modo da formare un gruppo, come puoi vedere qui.

Ora, osservando attraverso il microscopio stereoscopico, si può notare che il ganglio addominale è stato tagliato al centro e che ora sono stati effettuati due tagli nella parte anteriore e posteriore dell'aggregato cellulare dorsale. Successivamente, si utilizzano le pinzette per individuare un'apertura nel tessuto connettivo e si spinge delicatamente verso il basso la guaina del tessuto connettivo che circonda l'aggregato delle cellule a borsa. Rimuovere il tessuto connettivo dall'aggregato, se possibile, in un unico pezzo, utilizzando le forbici da dissezione.

Ma fare attenzione a non danneggiare il gruppo di cellule della borsa. Con una pipetta dal becco ricurvo contenente del mezzo, trasferire delicatamente il gruppo di cellule della borsa in un'altra piastra di lavoro. Rimuovere delicatamente le singole cellule della borsa dal gruppo utilizzando una punta gialla.

Per fare ciò, aspirare l'aggregato nella punta della pipetta ed espellerlo senza provocare bolle d'aria. Trasferire le cellule vitali dall'aggregato in piatti contenenti coprivetri rivestiti di poli. Le cellule morte appaiono nere al centro, mentre le cellule vive sono bianche.

È importante posizionare le cellule al centro del vetrino per l'analisi microscopica e rimuovere eventuali detriti cellulari e cellule morte il più rapidamente possibile. Raccogliendo il materiale indesiderato o soffiandolo via, le cellule sane si attaccheranno rapidamente alla piastra di polilisina. Circa da 15 a 25 cellule per ogni vetrino.

Una volta posizionate tutte le cellule del primo cluster, si rimuove il tessuto connettivo del secondo cluster e si prosegue con la stessa procedura di semina cellulare. Al termine della semina in tutte le piastre, lasciarle a temperatura ambiente sul banco per almeno due ore per consentire l'adeguato attacco delle cellule, evitando qualsiasi vibrazione. Successivamente, posizionare le piastre su un vassoio di polistirolo o di plastica e trasferirle in un incubatore a 14 gradi prima di ulteriori utilizzi.

Di solito osserviamo i coni di crescita dei plegia uno o due giorni dopo la semina. Per l'acquisizione in tempo reale della dinamica dei coni di crescita neuronali, realizziamo una piccola camera di osservazione composta da due coprivetrini separati da distanziali di plastica. Il coprivetrino inferiore ha i neuroni aderenti.

Il vetrino superiore viene accorciato con una penna a diamante per consentire un facile scambio del mezzo. Sul tavolo del microscopio, il sandwich di vetrini viene quindi inserito in un supporto su misura per il montaggio sul microscopio. Viene utilizzata una grassa da vuoto ad alta resistenza per mantenere uniti gli elementi della camera senza che il mezzo fuoriesca. Utilizzando una piccola siringa, la grassa da vuoto ad alta resistenza viene applicata sul vetrino superiore, quindi usiamo pinzette per posizionare gli spaziatori e successivamente applichiamo ulteriore grassa da vuoto sulla parte superiore.

Successivamente prendiamo l'intero montaggio, lo giriamo e lo premiamo delicatamente sul vetrino coprioggetto con le cellule ancora immerse nella piastra. Utilizziamo bastoncini di cotone per allineare i vetrini coprioggetto e premere delicatamente il vetrino superiore senza romperlo. Poi rimuoviamo con attenzione il sandwich dalla piastra, asciughiamo eventuali residui di mezzo e lo posizioniamo sulla base del supporto.

Posizionare il preparato nel portapreparati senza rompere il vetrino di copertura applicando pressione. Pulire entrambi i vetrini di copertura con detergente per vetri Sparkle su un bastoncino di ovatta; preferiamo utilizzare Sparkle perché lascia meno striature sul vetro. Pulire il vetrino coperto con un movimento circolare a partire dal centro e passare immediatamente un bastoncino di ovatta asciutto per evitare striature.

Un vetro pulito e protetto è molto importante per ottenere immagini di alta qualità, in particolare con ottiche DIC. Le colture neuronali di cellule della schiena di plegia sono colture a bassa densità, quindi sarà molto utile se il microscopio dispone di funzioni di posizionamento del tavolino per passare facilmente da una cellula all'altra. Ora siamo pronti per osservare la morfologia e la motilità del cono di crescita.

Visualizziamo la crescita sulla morfologia e sulla motilità mediante immagini in differenziale interferenza contrasto (DIC) in time-lapse ad alta risoluzione. L'immagine DIC è utile per questa applicazione perché fornisce una vista superficiale della struttura del cono di crescita in questo filmato in time-lapse DIC 60 X. È possibile osservare chiaramente i tre domini di un tipico cono di crescita.

Il dominio periferico, costituito da affect enrich la mela podia e op podia. La zona di transizione, caratterizzata da attività di ripiegamento, e il dominio centrale, che contiene principalmente microtubuli e organelli. Per studiare i meccanismi della direzione della crescita, abbiamo sviluppato il saggio di interazione con perline vincolate (RBI), in questo saggio.

Microsfere rivestite con proteine artesiane vengono utilizzate per imitare substrati cellulari bersaglio. La microsfera viene posizionata sul dominio periferico del cono di crescita mediante un micropuntello nel filmato in tempo reale con microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC). È possibile osservare un effetto retrogrado e un flusso sotto forma di onde in movimento retrogrado nel dominio centrale.

Gli organelli si muovono sui microtubuli. Dopo un periodo iniziale durante il quale non si verificano cambiamenti significativi, si può osservare un improvviso movimento in avanti del confine del dominio centrale verso il microsfera vincolata. Un movimento accompagnato da crescita del bordo anteriore e aumento della tensione, che determina inoltre un attenuazione del flusso e un allungamento dei microtubuli, può essere osservato in particolare lungo l'asse di interazione con la microsfera.

Per analizzare la dinamica del citoscheletro nei coni di crescita, utilizziamo la microscopia a macchie fluorescenti. Iniettiamo mediante microiniezione sonde di tubulina e actina marcate con fluorescenza nel corpo cellulare neuronale e acquisiamo filmati a intervalli di tempo. Tra i movimenti dinamici del citoscheletro, quelli mostrati in rosso si assemblano lungo il margine anteriore, vengono traslocati retrogradamente mediante flusso retrogrado e riciclati nella zona di transizione.

I microtubuli dinamici mostrati in verde esplorano la periferia mediante una combinazione di comportamenti di assemblaggio e traslocazione. La bassa quantità di marcatura produce un modello a puntini, consentendoci di analizzare quantitativamente i diversi parametri della dinamica del citoscheletro. Abbiamo mostrato come eseguire la dissezione, la coltura e l'acquisizione di immagini di cellule nervose, se si desidera effettuare un'analisi ad alta risoluzione dei coni di crescita neuronali.

Questo è davvero il sistema da utilizzare a causa delle grandi dimensioni dei coni di crescita, delle regioni citoplasmatiche ben definite e del citoscheletro ampiamente descritto. È tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.