Name: Un insieme di mezzi di comunicazione simulati informati in situ per la coltura di microrganismi anaerobici acquisiti nellambiente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-12T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Scopri la preparazione di mezzi anaerobici per microrganismi fastidiosi usando la tecnica Hungary modificata. Questo metodo facilita la coltura di microbi difficili e supporta la ricerca sulla materia oscura microbica.

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Gli autori vorrebbero riconoscere il lignaggio di informazioni e tutoraggio che ha influenzato/evoluto queste tecniche nel corso degli anni. Il Dr. Hamilton-Brehm come ex studente laureato, postdoc e attuale professore ha un debito di gratitudine nei confronti di coloro che si sono presi il tempo di insegnare le tecniche anaerobiche: il Dr. Mike Adams, il Dr. Gerti Schut, il Dr. Jim Elkins, il Dr. Mircea Podar, il Dr. Duane Moser e il Dr. Brian Hedlund. The Nature Conservancy e American Rivers hanno sostenuto questo lavoro attraverso le sovvenzioni G21-026-CON-P e AR-CE21GOS373, rispettivamente. Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo documento sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni di Nature Conservancy o American Rivers. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Istituto Avanzato per l'Energia della SIU, che riconosce con gratitudine i finanziamenti assegnati attraverso l'Advanced Energy Resource Board. NGS è stato eseguito da LC Sciences.

Metodo anaerobico simulato in situ per la coltura di microbi ambientali

<ol><li>Staley, J. T., Konopka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+in+situ+activities+of+nonphotosynthetic+microorganisms+in+aquatic+and+terrestrial+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of in situ activities of nonphotosynthetic microorganisms in aquatic and terrestrial habitats.</a> Annu. Rev. Microbiol. 39 (1), 321-346 (1985).</li>
<li>Lloyd, K. G., Steen, A. D., Ladau, J., Yin, J., Crosby, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylogenetically+novel+uncultured+microbial+cells+dominate+earth+microbiomes%5BTitle%5D)+AND+%22MSystems%22%5BJournal%5D)">Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate earth microbiomes.</a> MSystems. 3 (5), e00055(2018).</li>
<li>Rinke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li>
<li>Marcy, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+biological+%26%2334%3Bdark+matter%26%2334%3B+with+single-cell+genetic+analysis+of+rare+and+uncultivated+tm7+microbes+from+the+human+mouth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Dissecting biological &#34;dark matter&#34; with single-cell genetic analysis of rare and uncultivated tm7 microbes from the human mouth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (29), 11889-11894 (2007).</li>
<li>Giovannoni, S., Stingl, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+culturing+bacterioplankton+in+the%27omics%27+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The importance of culturing bacterioplankton in the'omics' age.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5 (10), 820-826 (2007).</li>
<li>Stewart, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+unculturable+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Growing unculturable bacteria.</a> J. Bacteriol. 194 (16), 4151-4160 (2012).</li>
<li>Dedysh, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivating+uncultured+bacteria+from+northern+wetlands%3A+Knowledge+gained+and+remaining+gaps%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cultivating uncultured bacteria from northern wetlands: Knowledge gained and remaining gaps.</a> Front. Microbiol. 2, 184(2011).</li>
<li>Kaeberlein, T., Lewis, K., Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating%26%2334%3B+uncultivable%26%2334%3B+microorganisms+in+pure+culture+in+a+simulated+natural+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolating&#34; uncultivable&#34; microorganisms in pure culture in a simulated natural environment.</a> Science. 296 (5570), 1127-1129 (2002).</li>
<li>Bomar, L., Maltz, M., Colston, S., Graf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+culturing+of+microorganisms+using+metatranscriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Directed culturing of microorganisms using metatranscriptomics.</a> mBio. 2 (2), e00012(2011).</li>
<li>Tyson, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-directed+isolation+of+the+key+nitrogen+fixer+Leptospirillum+ferrodiazotrophum+sp.+nov.+from+an+acidophilic+microbial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genome-directed isolation of the key nitrogen fixer Leptospirillum ferrodiazotrophum sp. nov. from an acidophilic microbial community.</a> Appl. Environ. Microbiol. 71 (10), 6319-6324 (2005).</li>
<li>Balch, W. E., Fox, G. E., Magrum, L. J., Woese, C. R., Wolfe, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanogens%3A+Reevaluation+of+a+unique+biological+group%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Methanogens: Reevaluation of a unique biological group.</a> Microbiol. Rev. 43 (2), 260-296 (1979).</li>
<li>Merino, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsurface+microbial+communities+as+a+tool+for+characterizing+regional-scale+groundwater+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Subsurface microbial communities as a tool for characterizing regional-scale groundwater flow.</a> Sci. Total Environ. 842, 156768(2022).</li>
<li>Anderson, K. B., Creeping, J. C., Huggett, W. W. Process for the dissolution of coal, biomass and other organic solids in superheated water. U.S. patent 8,563,791. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/23/49/97/e50f70357c62d8/US8563791.pdf</a> (2013).</li>
<li>Anderson, K. B., Crelling, J. C., Huggett, W. W., Perry, D. M. Production of organic materials using oxidative hydrothermal dissolution. U.S. patent 10,023,512. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf">https://patentimages.storage.googleapis.com/a6/28/30/7f14a156b44bdf/US10023512.pdf</a> (2018).</li>
<li>Mullin, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+in+situ+mineral+colonization+by+microorganisms+in+a%7E+60+c+deep+continental+subsurface+aquifer%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Patterns of in situ mineral colonization by microorganisms in a~ 60 c deep continental subsurface aquifer.</a> Front. Microbiol. 11, 536535(2020).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+dual-index+sequencing+strategy+and+curation+pipeline+for+analyzing+amplicon+sequence+data+on+the+miseq+illumina+sequencing+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the miseq illumina sequencing platform.</a> Appl. Environ. Microbiol. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Miller, T. L., Wolin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum+bottle+modification+of+the+hungate+technique+for+cultivating+obligate+anaerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A serum bottle modification of the hungate technique for cultivating obligate anaerobes.</a> Appl Microbiol. 27 (5), 985-987 (1974).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoanaerosceptrum+fracticalcis+gen.+nov.+sp.+nov.%2C+a+novel+fumarate-fermenting+microorganism+from+a+deep+fractured+carbonate+aquifer+of+the+us+great+basin%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Thermoanaerosceptrum fracticalcis gen. nov. sp. nov., a novel fumarate-fermenting microorganism from a deep fractured carbonate aquifer of the us great basin.</a> Front. Microbiol. 10, 2224(2019).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caldicellulosiruptor+obsidiansis+sp.+nov.%2C+an+anaerobic%2C+extremely+thermophilic%2C+cellulolytic+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Caldicellulosiruptor obsidiansis sp. nov., an anaerobic, extremely thermophilic, cellulolytic bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Appl. Environ. Microbiol. 76 (4), 1014-1020 (2010).</li>
<li>Hamilton-Brehm, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermodesulfobacterium+geofontis+sp.+nov.%2C+a+hyperthermophilic%2C+sulfate-reducing+bacterium+isolated+from+obsidian+pool%2C+yellowstone+national+park%5BTitle%5D)+AND+%22Extremophiles%22%5BJournal%5D)">Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park.</a> Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).</li>
<li>Twigg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation-reduction+aspects+of+resazurin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxidation-reduction aspects of resazurin.</a> Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

La sezione di produzione media di questo protocollo (sezione 1) deve la sua struttura alla tecnica Hungate modificata di Miller e Wolin17, che è stata ampiamente utilizzata sin dalla sua pubblicazione. La praticità di questo protocollo ampliato deriva dalla sua natura descrittiva e dall'abbinamento con l'acquisizione in situ di microrganismi. I flaconi di coltura contenenti terreni informati e simulati dal punto di vista ambientale sono stati utilizzati per coltivare con successo i seguenti ex membri acquisiti in situ della "materia oscura microbica": batteri anaerobici del sottosuolo Thermoanaerosceptrum fracticalcis ceppo DRI1318, Caldiatribacterium inferamans ceppo SIUC1 (numero di adesione MT023787; manoscritto in preparazione) e Anaerothermus hephaesti ceppo SIUC3 (numero di adesione MK618647; manoscritto in preparazione) e batterio anaerobico del sottosuolo ceppo non caratterizzato DRI14 (numero di adesione KR708540).
Uno dei punti focali di questo protocollo è che è fatto per essere altamente adattabile agli ambienti anaerobici superficiali e sotterranei e ai microrganismi. In primo luogo, si incoraggia a modificare la composizione del mezzo per riflettere la composizione dell'ambiente di interesse. Ad esempio, 3.000 mg/L di NaCl possono essere aggiunti alla ricetta quando si simula un ambiente con concentrazioni ioniche di 3.000 mg/L sia per Na+ che per Cl-; oppure 650 mL di sabbia e 650 mL di scisto possono essere inseriti nel bioreattore quando si simula un ambiente con un rapporto di volume 1:1 tra arenaria e scisto. In secondo luogo, la composizione del terreno può essere modificata per favorire la crescita di specifici microrganismi di interesse. In particolare, i media ingenui come i tre media in questo articolo sono pronti e dipendenti da tali modifiche. Esempi di fonti di carbonio ed energia includono fumarato18, peptone18, materia organica contenente cellulosa19, acetato20, estratto di lievito19,20, xilitolo (ceppo SIUC1), formiato (ceppo SIUC3) e altre potenziali fonti come H2 / CO2 , citrato e glucosio. Infine, la composizione del mezzo può essere modificata a seconda dello studio desiderato. Ad esempio, l'interesse principale dello studio descritto nella sezione dei risultati rappresentativi era quello di scoprire come i microrganismi anaerobici rappresentativi del sottosuolo risponderebbero a un unico liquame organico misto (un impasto di pannocchie di mais processato da OHD13,14); Pertanto, la sua ricetta conteneva questa fonte di carbonio invece di opzioni più convenzionali. Altre potenziali modifiche per studi specifici includono l'aggiunta di materie plastiche, acidi e metalli pesanti o altri xenobiotici per studi di biorisanamento; l'aggiunta di polimeri di carbonio recalcitranti come cellulosa e plastica per studi di prodotti depolimerizzati a valore aggiunto; e l'aggiunta di letame e rifiuti vegetali per il compostaggio su piccola scala e altri studi agricoli.
Se si desidera un'analisi post-riducente di un mezzo, come le misurazioni del pH, del potenziale di ossidoriduzione (ORP) e dell'ossigeno disciolto (DO), è possibile ottenerla indirettamente sacrificando un numero rappresentativo di bottiglie di terreno per comprendere con sicurezza il carattere di quel lotto. Dopo aver esposto all'aria un flacone medio sigillato, si consiglia vivamente di effettuare le letture di ORP e DO entro 1 minuto dall'apertura. Le misurazioni non dipendenti dall'ossigeno (ad es. pH) possono essere effettuate in modo non urgente dopo l'apertura iniziale. I microrganismi anaerobici esigenti richiedono in genere valori di ORP < -200 mV per la crescita. Se il terreno produce un valore ORP di > -200 mV e/o valori di DO >0,40 mg/L, è possibile utilizzare Na2S aggiuntivo (0,1-0,2 g/L) o un altro riducente (ad es. citrato di titanio, L-cisteina, acido ascorbico) per ridurre ulteriormente il mezzo.
La resazurina è spesso usata come indicatore di ossigeno (come in questo protocollo); Tuttavia, è più precisamente un indicatore redox21, che indica la presenza di ossigeno indirettamente quando l'ossigeno cambia il potenziale redox di una soluzione. La resazurina in soluzione appare inizialmente di colore blu. In seguito all'esposizione ad agenti riducenti, la soluzione si sposta irreversibilmente verso un colore rosa. Quando la soluzione viene ulteriormente ridotta, diventa reversibilmente incolore e ritorna al rosa dopo l'ossidazione. Gli autori hanno osservato casi in cui i terreni ridotti contenenti resazurina sono passati dal blu al rosa, ma non sono riusciti a passare all'incolore. Tuttavia, gli autori hanno anche osservato che tali terreni spesso diventano incolori dopo la sterilizzazione in autoclave e che l'aumento del tempo trascorso a bollire e lavare i terreni generalmente consente alla resazurina di passare alla sua forma incolore dopo l'aggiunta di riducenti. Se lo si desidera, la concentrazione di ossigeno nel mezzo può essere verificata con una sonda di ossigeno disciolto.
Tutti i materiali necessari per far funzionare questi bioreattori e gli stessi bioreattori in vetro su misura non hanno superato ~ $ 5K (questo presuppone che le attrezzature di supporto siano già disponibili come bagni d'acqua, pompe e incubatori). Queste tecniche di coltivazione anaerobica sono economicamente amichevoli, rispetto ai bioreattori automatizzati commerciali che possono partire da > $ 10.000. Inoltre, molti bioreattori commerciali stanno passando a contenitori per reattori monouso, il che cambia la dinamica del confronto e non è conveniente per i laboratori di ricerca/università più piccoli da sostituire continuamente. Inoltre, i sistemi commerciali possono avere pregiudizi chimici di produzione (dalla plastica utilizzata, dal grasso su guarnizioni/raccordi o dall'acqua trattata chimicamente) che influenzeranno il successo della crescita di microrganismi esigenti. Il basso costo, la personalizzazione e la versatilità per raccogliere un campione ambientale anaerobico, in combinazione con un terreno informato che può essere inoculato, che si traduce nella generazione di arricchimenti per lo studio, aumenta notevolmente le possibilità di acquisire microrganismi unici.

La maggior parte dei microrganismi rimane non coltivata; Ciò è supportato dalla grande disparità tra le cellule osservata attraverso la microscopia, contrastata dai pochi microrganismi coltivati con successo utilizzando piastre di agar. Staley e Konopka chiamarono questa disparità "Anomalia del Conteggio delle Grandi Placche"1. La diversità stimata non contabilizzata è supportata da dati metagenomici e metatrascrittomici che mostrano molti nuovi generi distribuiti in curve di abbondanza di rango provenienti da diversi ambienti2. I microrganismi che sono stati osservati (generalmente mediante sequenziamento casuale di una comunità microbica) ma che non sono stati coltivati sono stati definiti "materia oscura microbica"3,4.
Nell'era della -omica, la coltura di microrganismi rimane fondamentale per valutare appieno i dati genomici e verificare la funzione/fenotipo dei geni presenti. Il sequenziamento di microrganismi in coltura è ancora l'unico modo per ottenere con sicurezza genomi completi fino a quando tecnologie come la metagenomica shotgun e i genomi assemblati con metagenoma dall'ambiente non diventeranno infallibili5. Le valutazioni genomiche accoppiate con microrganismi in coltura forniscono forti inferenze per la comprensione della "materia oscura microbica". Molti membri della "materia oscura microbica" svolgono funzioni cruciali che hanno un impatto sul ciclo dei nutrienti e di altri elementi e sulla produzione di preziosi prodotti naturali, supportano i sistemi ecologici e svolgono servizi ecologici. Dal punto di vista medico, circa la metà di tutti i prodotti farmaceutici attualmente commercializzati sono prodotti e derivati di prodotti batterici, e si sospetta che la profilazione di specie non coltivate riveli gli antibiotici del futuro. Per ottenere l'accesso a questa maggioranza incolta, è necessario aumentare una varietà di metodologie di coltivazione6. Tra i membri della "materia oscura microbica", i microrganismi oligotrofi anaerobici sono in gran parte sottostimati e probabilmente detengono percorsi biochimici ecologicamente e industrialmentepreziosi, rendendoli importanti bersagli della coltura. Tuttavia, i microrganismi oligotrofi anaerobici sono più difficili da coltivare rispetto alle loro controparti aerobiche e copiotrofiche a causa dei tempi di incubazione più lunghi spesso richiesti, delle condizioni esigenti (ad esempio, particolari temperature in vitro non standard) e dell'uso di ricette di terreni specializzati.
Le attuali tecniche di sviluppo per coltivare membri della "materia oscura microbica", compresi i nuovi microrganismi oligotrofi anaerobici, hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione e aumentato la rappresentazione di questi microrganismi all'interno dell'albero filogenetico. Le attuali tecniche che utilizzano terreni informati per la coltura di nuovi microrganismi (cioè terreni derivati dalla conoscenza del/i microrganismo/i di interesse) possono essere suddivise in tre metodi distinti. Il primo dei metodi prevede la rimozione diretta di una sezione discreta dell'ambiente per il trasferimento in una camera di crescita in vitro che contiene già i microrganismi di interesse all'interno di una membrana. La sezione discreta (ad esempio, l'acqua di mare) agisce per fornire ai microrganismi di interesse l'habitat geochimico che utilizzano in situ, mentre la membrana arresta il movimento delle cellule attraverso (le cellule di interesse rimarranno all'interno; le cellule estranee che sono arrivate con la sezione discreta rimarranno all'esterno). Includendo composti naturalmente disponibili per i microrganismi bersaglio nel loro habitat naturale, tali microrganismi possono essere coltivati8. Il secondo metodo utilizza la metatrascrittomica o la genomica per chiarire le capacità metaboliche, fornendo indizi su parametri di coltura ristretti per un disegno mirato del terreno. Questo approccio fornisce un profilo eco-fisiologico che può essere utilizzato per indirizzare l'arricchimento di specifici tipi di microrganismi da un ambiente. Le disposizioni del terreno sono adattate ai geni identificati presenti che si presume supportino i microrganismi bersaglio per ridurre la diversità di arricchimento,9,10. Un avvertimento è che le informazioni genomiche non deducono direttamente l'espressione dei geni, mentre le informazioni trascrittomiche sì.
Il terzo metodo comprende i media informati e simulati dal punto di vista ambientale, distinti dal primo metodo, che non simula i media, ma utilizza l'ambiente direttamente come fonte di media. Questo terzo metodo richiede la ricognizione ambientale della geochimica di un sito di campo contenente microrganismi di interesse. Con questa conoscenza, i componenti primari e i parametri fisici vengono identificati per produrre un mezzo simulato informato sull'ambiente. Il terreno riceve quindi un'infusione diretta di sedimenti o liquidi contenenti microrganismi dall'ambiente nel terreno. Questo metodo è particolarmente utile nei casi in cui il microbiologo colturatore non ha accesso a quantità sufficienti di ambiente sorgente (come necessario per il primo metodo) né a dati metatrascrittomici o genomici appropriati (come necessario per il secondo).
Il seguente protocollo è un esempio del terzo metodo; Si basa e mira a simulare gli ambienti di interesse. All'interno del protocollo vengono presentate in parallelo tre ricette di terreni naïve mirate a diverse colture di microrganismi anaerobi acquisite sul campo. Le tre colture rappresentate sono colture miste originate dal suolo (di seguito, coltura mista del suolo), colture miste originate dall'interno di un pozzo trivellato (di seguito, coltura mista da pozzo) e un metanogeno isolato proveniente dall'interno di un pozzo trivellato (di seguito, metanogeno isolato da pozzo). Le identità composte e le quantità nelle ricette multimediali qui condivise sono intese come una guida iniziale; Sono in grado e incoraggiati ad essere personalizzati in base all'ambiente del lettore e ai microrganismi di interesse.

<table><tbody><tr><td>General Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacone di borosillicato da 1 L</td> Siringa <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 1 ml con punta scorrevole</td><td>Pipetta in vetro Fisher Scientific</td> da 10 mL Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Flacone per coltura da 100 mL</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crimpatrice manuale da 20 mm</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ago da 23 G</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacone in borosilicato da 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td> Fisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Sigillo in alluminio</td> Fisher <td>Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cannula, lunghezza 31,5 cm</td> Cannula <td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, lunghezza 6 cm</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corer</td><td>Giddings Machine Company&nbsp;</td><td></td><td>Assemblato da parti dell'azienda</td></tr><tr><td>Collettore del gas</td><td>Swagelok</td><td></td><td>Assemblato da molte parti diverse</td></tr><tr><td>Accendino</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N2 gas</td><td>Airgas</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Guanti in nitrile</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tappo in gomma (per bombole GL45)</td><td>Glasgeratebau OCHS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tappo in gomma (per bottiglie di coltura)</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante per agitazione</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oligoelementi</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamine</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materiali specifici per bioreattore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>#10 Tappo in gomma</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tappo in gomma #7</td><td>Siringa Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 1 ml con punta luer lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valvola a sfera con portagomma da 1/4"</td><td>Siringa Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>da 10 ml con punta luer lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flacone in borosilicato da 3,5 L</td> Fisher <td>Scientific Adattatore</td><td></td><td></td></tr> per <tr><td>portagomma da 5/16" - 1/4" raccordo</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 mL siringa con punta luer lock</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8 L borosillicate damigiana</td><td>Allen Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connettore per tubo angolato per tappo aperto GL14</td><td>Ace Glass</td><td>7623-20</td><td></td></tr><tr><td>Balloon</td><td>Party City</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borosillicate bioreattore</td><td>Allen Scientific Glass</td><td></td><td>Su misura su richiesta</td></tr><tr><td>Drill</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femmina luer lock adattatore accoppiatore</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GL14 tappo superiore aperto</td><td>Ace Glass</td><td>7621-04</td><td></td></tr><tr><td>GL18 tappo superiore aperto</td><td>Ace Glass</td><td>7621-08</td><td></td></tr><tr><td>GL45 tappo superiore aperto</td><td>Ace Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTFE affrontato setto in silicone per tappo superiore aperto GL14</td><td>Ace Vetro</td><td>7625-06</td><td></td></tr><tr><td>PTFE affrontato silicone setto per GL18 tappo superiore aperto</td><td>Ace Glass</td><td>7625-07</td><td></td></tr><tr><td>Ring stand</td> Fisher <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ring stand morsetto catena</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ring stand morsetto</td> Fisher <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone; 1/4 "id, 1/2" od</td><td>Grainger</td><td>55YG13</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in silicone; 3/16" id, 3/8" od</td><td>Grainger</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connettore per tubo flessibile dritto per tappo superiore aperto GL14</td><td>Ace Glass</td><td>7623-22</td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto a tre vie</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubinetto a due vie</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipompa a flusso variabile a flusso ultra basso</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria</td><td>Fisher Scientifc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Setto in gomma bianca per tubi diametro esterno 13-18 mm</td><td>Ace Glass</td><td>9096-49</td><td></td></tr><tr><td>Wire</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fascetta</td><td>Lowe's</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un insieme di mezzi di comunicazione simulati informati in situ per la coltura di microrganismi anaerobici acquisiti nell'ambiente

A Set of In Situ Informed Simulated Medium Formats for Culturing Environmentally Acquired Anaerobic Microorganisms

La ricerca sui microrganismi anaerobi dipendente dalla coltura si basa sulla competenza metodologica. Questi metodi devono creare e mantenere condizioni di crescita adeguate (ad esempio, pH e fonti di carbonio) per i microrganismi anaerobici, consentendo al contempo l'estrazione di campioni senza compromettere l'ambiente artificiale. A tal fine, i metodi che si basano e simulano un ambiente in situ possono essere di grande aiuto nella coltura di microrganismi provenienti da quell'ambiente. Qui, descriviamo un metodo anaerobico in situ informato e simulato per la coltura di microrganismi terrestri superficiali e sotterranei, enfatizzando la raccolta di campioni anaerobici con perturbazioni minime. Questo protocollo descrive in dettaglio la produzione di un mezzo liquido anaerobico personalizzabile e l'acquisizione ambientale e la crescita in vitro di microrganismi anaerobici. Il protocollo copre anche i componenti critici di un bioreattore anaerobico utilizzato per simulazioni ambientali di sedimenti e mezzi liquidi anaerobici per colture acquisite in ambiente. Abbiamo incluso i dati preliminari di sequenziamento di nuova generazione da un microbioma mantenuto per tutta la durata di vita di un bioreattore in cui la coltura attiva si è regolata dinamicamente in risposta a una fonte sperimentale di carbonio.

Qui mostriamo i risultati di uno studio su un bioreattore utilizzando un metodo di preparazione del terreno di coltura misto in foro e un metodo di configurazione del bioreattore come descritto di seguito. Il terreno di coltura misto del pozzo è stato modificato per contenere come fonte di carbonio un liquame di pannocchie di mais processate mediante dissoluzione idrotermale ossidativa (OHD)13,14. Il terreno di coltura misto modificato è stato pompato nel bioreattore per 44 giorni a una velocità di 0,4 mL/min. Il giorno 23, un inoculo proveniente dal pozzo BLM-1 nella regione della Death Valley del Nevada, USA, è stato aggiunto15. I campioni liquidi del bioreattore sono stati raccolti in un flacone di raccolta del campione nei giorni 1, 8, 15, 22, 23 (dopo l'inoculazione), 30, 37 e 44.
Per monitorare lo stato generale della coltura dell'inoculo (e degli abitanti sopravvissuti all'autoclave pre-inoculo del sedimento del bioreattore), i campioni liquidi del bioreattore sono stati osservati mediante conta cellulare diretta. La conta cellulare diretta del liquido campionato è stata eseguita con un emocitometro di Petroff-Hauser. Per conoscere l'identità dei membri microbici del bioreattore, il DNA è stato estratto da campioni liquidi del bioreattore e i geni rRNA 16S sono stati analizzati mediante sequenziamento di nuova generazione (NGS). I dati NGS sono stati elaborati internamente utilizzando mothur seguendo la MiSeq SOP16.
Prima dell'inoculazione, la conta cellulare diretta era spesso inferiore al limite di rilevamento (b.d.l.) di 1,0 × 106 cellule/mL. Il giorno 23 (dopo l'inoculazione) ha avuto un basso numero di cellule di 2,6 × 106 cellule/mL, mentre i giorni successivi 30, 37 e 44 hanno avuto un numero di cellule superiore a 1,0 × 107 cellule/mL (Figura 3). Sebbene la conta delle cellule fosse b.d.l. nei giorni 1, 8 e 22, il DNA è stato estratto per NGS da ogni punto temporale, indicando una presenza basale di microrganismi pre-inoculo nel sedimento anche dopo la sterilizzazione in autoclave. Il genere principale presente (determinato dal numero di letture in ciascuna unità tassonomica operativa (OTU)) è rimasto stabile nei giorni 8, 15 e 22 ed è stato identificato come Geobacillus. Dopo l'inoculazione con l'inoculo BLM-1 il giorno 23, Geobacillus non dominava più e sono sorti nuovi generi principali insieme a una moltitudine di generi presenti in modo minore, che per la maggior parte hanno mantenuto una presenza fino alla fine dello studio (Figura 4). Da questi, concludiamo che l'inoculo BLM-1 era una coltura attiva e dinamicamente mutevole all'interno del bioreattore.
Un ulteriore studio dei dati NGS ha rivelato membri della "materia oscura microbica". Le OTU con nomi tassonomici assegnati contenenti le parole "non classificato" o "non coltivato" sono state utilizzate come proxy per le OTU contenenti membri della "materia oscura microbica". I dati NGS sono stati raccolti per il giorno 44 (l'ultimo giorno di post-inoculazione con microrganismi dal pozzo BLM-1) e filtrati per non contenere OTU che avevano letture nei dati pre-inoculazione (giorni 1, 8, 15 o 22) poiché non era probabile che questi OTU fossero nell'inoculo. I dati NGS filtrati del giorno 44 contenevano 1.844 OTU e 3.396 letture. Di questi, 366 OTU (20%) e 925 letture (27%) non erano classificate a livello di phylum e 1252 OTU (68%) e 2357 letture (69%) erano non classificate o non coltivate a livello di genere. Anche se a breve termine, questo studio pilota supporta il potenziale di un bioreattore con terreni informati sull'ambiente per coltivare membri della "materia oscura microbica".
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig01.jpg"> Figura 1: Schema del bioreattore borosilicato progettato su misura utilizzato per la coltura anaerobica. (A) Vista del bioreattore da un lato. (B) Ruotando A di 90° (in senso orario) attorno all'asse z si ottiene la vista). (C) Una vista dall'alto del bioreattore. Il design rivestito consente il controllo della temperatura con acqua o olio. Le due porte del rivestimento possono essere viste sul lato destro della vista in B. La camera interna può essere riempita con sedimenti di qualsiasi tipo o può essere lasciata vuota di sedimenti per la coltura planctonica. Tre porte di campionamento (visibili sul lato destro della vista in A) consentono di rimuovere il materiale a diverse profondità della colonna del bioreattore. Le aperture standard 45, 18 e 14 GL possono essere sigillate utilizzando setti in teflon o butilico che manterranno una tenuta stagna per 1-6 mesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig02.jpg"> Figura 2: Gruppo bioreattore attivo. I bicchieri presentati nella foto da sinistra a destra sono (A) damigiana da 8 litri, (B) bioreattore (vedi Figura 1) e (C) flacone di raccolta non campionato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig03.jpg"> Figura 3: Conta cellulare diretta dallo studio del bioreattore. Le popolazioni microbiche all'interno del bioreattore sono state monitorate utilizzando una camera di conteggio delle cellule con emocitometro Petroff-Hauser da 0,02 mm. L'inoculo è stato aggiunto all'inizio del giorno 23. La conta delle cellule per i giorni 1, 8 e 22 era al di sotto del limite di rilevamento. Il limite di rilevamento effettivo della conta cellulare diretta è di 1 × 106 cellule/mL. Abbreviazione: b.d.l. = al di sotto del limite di rilevamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66228/66228fig04.jpg"> Figura 4: Sequenziamento di nuova generazione del bioreattore. Le OTU sono rappresentate in grafici a barre impilate che indicano la percentuale di letture appartenenti a OTU univoche da ogni punto temporale dello studio del bioreattore. Le OTU univoche sono state assegnate alla loro tassonomia associata a un cutoff del genere. Il genere "Altro" è definito come tutti i generi con meno del 10% di letture in ogni punto temporale. Il numero totale di letture del DNA rappresentate è 506.358. Il numero di letture per ogni punto temporale è elencato nella parte superiore del grafico. L'inoculo è stato aggiunto all'inizio del giorno 23. Abbreviazione: OTU = Operational Taxonomic Unit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Composto</td>
			<td>Quantità per la coltura mista del suolo</td>
			<td>Importo per la coltura mista da pozzo</td>
			<td>Quantità per metanogeno isolato da pozzo</td>
		</tr><tr><td>Acqua distillata</td>
			<td>1000.0 mL</td>
			<td>1000.0 mL</td>
			<td>1000.0 mL</td>
		</tr><tr><td>HEPES</td>
			<td>3.600 grammi</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>MOPS</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>2.000 grammi</td>
		</tr><tr><td>MgCl2 ∙6 H2O</td>
			<td>0.400 grammi</td>
			<td>0.400 grammi</td>
			<td>0.400 grammi</td>
		</tr><tr><td>Kcl</td>
			<td>0.500 grammi</td>
			<td>0,250 grammi</td>
			<td>0.500 grammi</td>
		</tr><tr><td>NH4cl</td>
			<td>0,268 grammi</td>
			<td>0,268 grammi</td>
			<td>0,268 grammi</td>
		</tr><tr><td>Na2SO4</td>
			<td>-</td>
			<td>0,284 grammi</td>
			<td>1.500 grammi</td>
		</tr><tr><td>Na2HPO4 ∙2 H2O</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>0,356 grammi</td>
		</tr><tr><td>1 M KH2PO4 a pH 6</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>1 M H3BO3 a pH 9,4</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr><tr><td>Oligoelementi</td>
			<td>1,0 mL</td>
			<td>-</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr><tr><td>Vitamine</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>1,0 mL</td>
		</tr><tr><td>1 mg/mL di resazurina di sodio</td>
			<td>0,4 mL</td>
			<td>0,3 mL</td>
			<td>0,4 mL</td>
		</tr><tr><td>Regolazione del pH a</td>
			<td>-</td>
			<td>7.0</td>
			<td>7.0</td>
		</tr><tr><td>Regolazione del pH mediante</td>
			<td>-</td>
			<td>NaOH</td>
			<td>KOH</td>
		</tr><tr><td>Temperatura di incubazione</td>
			<td>25 °C</td>
			<td>60 °C</td>
			<td>47 °C</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione dei supporti. Elenco dei composti e dei parametri fisici per ciascun mezzo. I media presentati sono ingenui; Non contengono carbonio e fonti di energia in quanto queste possono essere specifiche e dovrebbero essere informate dai microrganismi e dall'ambiente di interesse del lettore. Vedi la sezione di discussione per idee su possibili aggiunte di carbonio e fonti di energia.
File supplementare 1: Configurazione del collettore del gas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66228/66228_Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare il file.</a>

L'obiettivo di questo documento è quello di descrivere in dettaglio le migliori pratiche per la produzione di terreni per microrganismi anaerobici fastidiosi acquisiti da un ambiente. Questi metodi aiutano a gestire le colture anaerobiche e possono essere applicati per supportare la crescita di microrganismi non coltivati elusivi, la "materia oscura microbica".

Un insieme di mezzi di comunicazione simulati informati in situ per la coltura di microrganismi anaerobici acquisiti nell'ambiente

Culture-dependent research of anaerobic microorganisms rests upon methodological competence. These methods must create and maintain suitable growth ...

La nostra ricerca si concentra sui microrganismi terrestri di superficie e sotterranei, coltivandoli e studiandone i genomi e i fenotipi. Di particolare interesse sono i microrganismi in ambienti che non sono ben compresi, come quelli nel sottosuolo profondo e in alcune zone umide. La maggior parte dei microrganismi che coltiviamo sono anaerobici, il che significa che il processo di coltura richiede generalmente più tempo e attenzione rispetto ai processi per i microrganismi aerobici più comunemente usati.Ci auguriamo che la presentazione audiovisiva della preparazione del terreno anaerobico aiuti i ricercatori che non conoscono la tecnica ad apprenderla in modo relativamente rapido e semplice. Questa preparazione del terreno si basa sulla tecnica Hungate modificata di Miller e Wolin. La coltura di microbi esigenti è noiosa e problematica.Avere più strumenti per coltivarli è molto gradito alla comunità scientifica. La ricerca futura in generale sarà simile alla nostra attuale ricerca sui microrganismi terrestri poco studiati. Ci sono ancora molti nuovi microbi da scoprire e studiare.

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Fonte: Ahmadi, S., et al. Un modello di batch-culture in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra un metodo per modellare la fermentazione microbica intestinale incubando campioni fecali con fibre fermentabili alimentari in condizioni anaerobiche per studiare la produzione di metaboliti da parte del microbiota intestinale.

In vitro Modello di coltura batch-coltura per imitare la fermentazione colonica da parte del microbiota intestinale umano

Clostridium difficile è un batterio patogeno che è un rigoroso anaerobio e provoca diarrea associata agli antibiotici (AAD). Qui, metodi per isolare, coltivare e mantenere C. cellule vegetative difficile e spore vengono descritti. Queste tecniche richiedono una camera anaerobico, che richiede una manutenzione regolare per assicurare adeguate condizioni di ottimale C. la coltivazione difficile.

Coltura e manutenzione<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In un ambiente anaerobico

Questo protocollo descrive un sistema di fermentazione in vitro a coltura batch del microbiota fecale umano, utilizzando l'inulina (un prebiotico ben noto e uno dei modulatori microbiota più studiati) per dimostrare l'uso di questo sistema nella stima degli effetti di interventi sulla composizione del microbiota fecale e sulle attività metaboliche.

Un modello di coltura batch in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano

Poiché gli organismi anaerobici obbligati non sono in grado di crescere dopo l'esposizione all'ossigeno, l'uso di tecniche di coltura anaerobica è indispensabile. Qui, dimostriamo un metodo semplice ed efficace per coltivare una coltura mista derivata da una pianta di biogas dalla preparazione dei media alla quantificazione del gas e degli acidi grassi volatili.

Preparazione media per la coltivazione di microrganismi in condizioni rigorosamente anaerobiche/anossiche

Il protocollo riassume le migliori pratiche per ridurre al minimo la carica microbica in un ambiente di camera bianca e include strategie come il monitoraggio ambientale, il monitoraggio dei processi e i test di sterilità del prodotto. È rilevante per gli impianti di produzione e collaudo che sono tenuti a soddisfare gli attuali standard di buona pratica dei tessuti e gli attuali standard di buona pratica di fabbricazione.

Controllo microbico e strategie di monitoraggio per ambienti di camere bianche e terapie cellulari

Il protocollo presenta due metodologie per migliorare l'isolamento dei batteri intestinali anaerobi. Il primo si concentra sull'isolamento di una vasta gamma di batteri utilizzando diversi terreni di coltura. La seconda si concentra sulle fasi di coltivazione di uno specifico gruppo microbico, possibilmente assimilando il mio-inositolo, per comprenderne appieno il significato ecologico.

Strategie per migliorare la coltivazione di batteri anaerobici dal tratto gastrointestinale del pollo

Questo protocollo descrive la progettazione e l'uso di un chip di isolamento (iChip) per la coltivazione in situ di microbi del suolo recalcitranti nel loro ambiente naturale. Descrive anche la coltivazione in situ di batteri del suolo che producono antimicrobici. Il protocollo può essere adattato per recuperare batteri da diverse nicchie con altre proprietà desiderabili.

Sul posto Isolamento e coltura di batteri del suolo recalcitranti utilizzando un chip di isolamento (iChip)

Questo protocollo descrive in dettaglio l'assemblaggio di array di mini-bioreattori da utilizzare per la coltura a flusso continuo di comunità fecali complesse in condizioni anaerobiche. Discutiamo anche i metodi per l'assemblaggio, l'inoculazione e il campionamento dei reattori per ulteriori analisi.

Assemblaggio di bioreattori per la coltura continua di comunità fecali complesse

Cambiamenti della pesca indotti alla pesca di crostacei sfruttati, come l'aragosta pesca americano, potrebbero potenzialmente influenzare le loro dinamiche riproduttive, portando ad una riduzione nel successo di accoppiamento. L'obiettivo di questo studio era di sviluppare un metodo invasivo per accertare il successo dell'accoppiamento delle aragoste femmine che possono essere fisiologicamente o funzionalmente maturo.

Un metodo non invasivo per<em&gt; In situ</em&gt; Determinazione del successo di accoppiamento in americano femminile Aragoste (<em&gt; Homarus americanus</em&gt;)

Un romanzo Upflow anaerobica Solid State (UAS) reattore è stato utilizzato per la produzione di biogas da materie prime fibrose. Digestato prodotto dal reattore UASs è stato idrotermicamente carbonizzato in HTC biochar in un reattore batch di pressione. L'integrazione dei due concetti bioenergetici è stato applicato in questo studio per aumentare la produzione globale di bioenergia.

Valutazione della gestione integrata digestione anaerobica e carbonizzazione idrotermale per Bioenergy Production

Scopri la preparazione di mezzi anaerobici per microrganismi fastidiosi usando la tecnica Hungary modificata. Questo metodo facilita la coltura di microbi difficili e supporta la ricerca sulla materia oscura microbica.

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