Name: Tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dellorganogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Scopri tecniche di coltivazione in vitro per modellare l'organogenesi epatica utilizzando linee cellulari umane e approcci di miniaturizzazione. Questo metodo consente di studiare la morfogenesi e la migrazione cellulare.

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Gli autori desiderano esprimere sincera gratitudine a Ogechi Ogoke e Osama Yousef per i loro inestimabili contributi ai dati utilizzati in questo articolo. NP è stato supportato dai fondi di avvio UB CBE, da una Mark Diamond Fellowship, dal New York State Stem Cell Science C024316, dal centro UB Stem Cells in Regenerative Medicine (ScIRM), dal Center for Cell, Gene, Tissue Engineering (CGTE) dell'Università di Buffalo.

Assembloid Technology: Pioneering Liver Development Research

<ol><li>Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hex+homeobox+gene+controls+the+transition+of+the+endoderm+to+a+pseudostratified%2C+cell+emergent+epithelium+for+liver+bud+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development.</a> Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).</li>
<li>Gualdi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+specification+of+the+gut+endoderm+in+vitro%3A+Cell+signaling+and+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: Cell signaling and transcriptional control.</a> Genes Dev. 10 (13), 1670-1682 (1996).</li>
<li>Ogoke, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+imaging+and+analysis+of+mouse+and+human+liver+bud+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal imaging and analysis of mouse and human liver bud morphogenesis.</a> Dev Dyn. 251 (4), 662-686 (2022).</li>
<li>Ogoke, O., Oluwole, J., Parashurama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+considerations+in+liver+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioengineering considerations in liver regenerative medicine.</a> J Biol Eng. 11, 46(2017).</li>
<li>Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+differentially+expressed+genes+in+epithelial+stem%2Fprogenitor+cells+of+fetal+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver.</a> Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).</li>
<li>Yang, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+the+independent+effect+of+twist+and+snail+in+promoting+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma.</a> Hepatology. 50 (5), 1464-1474 (2009).</li>
<li>Gupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entry+and+integration+of+transplanted+hepatocytes+in+rat+liver+plates+occur+by+disruption+of+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 29 (2), 509-519 (1999).</li>
<li>Koenig, S., Stoesser, C., Krause, P., Becker, H., Markus, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+repopulation+after+hepatocellular+transplantation%3A+Integration+and+interaction+of+transplanted+hepatocytes+in+the+host%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Liver repopulation after hepatocellular transplantation: Integration and interaction of transplanted hepatocytes in the host.</a> Cell Transplant. 14 (1), 31-40 (2005).</li>
<li>Rajvanshi, P., Kerr, A., Bhargava, K. K., Burk, R. D., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+liver+repopulation+using+the+dipeptidyl+peptidase+iv-deficient+rat+and+other+rodent+recipients%3A+Cell+size+and+structure+relationships+regulate+capacity+for+increased+transplanted+hepatocyte+mass+in+the+liver+lobule%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Studies of liver repopulation using the dipeptidyl peptidase iv-deficient rat and other rodent recipients: Cell size and structure relationships regulate capacity for increased transplanted hepatocyte mass in the liver lobule.</a> Hepatology. 23 (3), 482-496 (1996).</li>
<li>Matchett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+decoding+of+human+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Multimodal decoding of human liver regeneration.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.02.24.529873 2023.2002.2024.529873 (2023).</li>
<li>Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+organogenesis+promoted+by+endothelial+cells+prior+to+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function.</a> Science. 294 (5542), 559-563 (2001).</li>
<li>Sosa-Pineda, B., Wigle, J. T., Oliver, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+migration+during+liver+development+requires+prox1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte migration during liver development requires prox1.</a> Nat Genet. 25 (3), 254-255 (2000).</li>
<li>Suzuki, A., Sekiya, S., Büscher, D., Izpisúa Belmonte, J. C., Taniguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tbx3+controls+the+fate+of+hepatic+progenitor+cells+in+liver+development+by+suppressing+p19ARF+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tbx3 controls the fate of hepatic progenitor cells in liver development by suppressing p19ARF expression.</a> Development. 135 (9), 1589-1595 (2008).</li>
<li>Rossi, J. M., Dunn, N. R., Hogan, B. L., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+mesodermal+signals%2C+including+BMPs+from+the+septum+transversum+mesenchyme%2C+are+required+in+combination+for+hepatogenesis+from+the+endoderm%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm.</a> Genes Dev. 15 (15), 1998-2009 (2001).</li>
<li>Ng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+actopaxin+impairs+hepatocellular+carcinoma+metastasis+through+modulation+of+cell+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Suppression of actopaxin impairs hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of cell migration and invasion.</a> Hepatology. 58 (2), 667-679 (2013).</li>
<li>Fransvea, E., Angelotti, U., Antonaci, S., Giannelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blocking+transforming+growth+factor-beta+up-regulates+e-cadherin+and+reduces+migration+and+invasion+of+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Blocking transforming growth factor-beta up-regulates e-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells.</a> Hepatology. 47 (5), 1557-1566 (2008).</li>
<li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+silencing+of+c-myc+inhibits+cell+migration%2C+invasion%2C+and+proliferation+in+hepg2+human+hepatocellular+carcinoma+cell+line%3A+C-myc+silencing+in+hepatocellular+carcinoma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">RNAi silencing of c-myc inhibits cell migration, invasion, and proliferation in hepg2 human hepatocellular carcinoma cell line: C-myc silencing in hepatocellular carcinoma cell.</a> Cancer Cell Int. 13 (1), 23(2013).</li>
<li>Fitamant, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yap+inhibition+restores+hepatocyte+differentiation+in+advanced+HCC%2C+leading+to+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Yap inhibition restores hepatocyte differentiation in advanced HCC, leading to tumor regression.</a> Cell Rep. 10 (10), 1692-1707 (2015).</li>
<li>Xue, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Goosecoid+promotes+the+metastasis+of+hepatocellular+carcinoma+by+modulating+the+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Goosecoid promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by modulating the epithelial-mesenchymal transition.</a> PLoS One. 9 (10), e109695(2014).</li>
<li>Biname, F., Lassus, P., Hibner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+controls+the+directional+migration+of+hepatocyte+cohorts+by+modulating+their+adhesion+to+fibronectin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin.</a> Mol Biol Cell. 19 (3), 945-956 (2008).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-338-3p+inhibits+epithelial-mesenchymal+transition+and+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">MiR-338-3p inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cells.</a> Oncotarget. 8 (42), 71418-71429 (2017).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-1301+inhibits+hepatocellular+carcinoma+cell+migration%2C+invasion%2C+and+angiogenesis+by+decreasing+Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+through+targeting+BCL9%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">MiR-1301 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration, invasion, and angiogenesis by decreasing Wnt/beta-catenin signaling through targeting BCL9.</a> Cell Death Dis. 8 (8), e2999(2017).</li>
<li>Zeng, Y. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiRNA-135a+promotes+hepatocellular+carcinoma+cell+migration+and+invasion+by+targeting+forkhead+box+o1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">MiRNA-135a promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion by targeting forkhead box o1.</a> Cancer Cell Int. 16, 63(2016).</li>
<li>Ogoke, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+niche+and+transcription+trigger+early+murine+and+human+pluripotent+stem+cell-derived+liver+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the niche and transcription trigger early murine and human pluripotent stem cell-derived liver organogenesis.</a> bioRxiv. , 10.1101/2022.07.24.501313 (2023).</li>
<li>Ogoke, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+liver+organogenesis+by+recreating+three-dimensional+collective+cell+migration%3A+A+role+for+TGF-beta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Modeling liver organogenesis by recreating three-dimensional collective cell migration: A role for TGF-beta pathway.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 621286(2021).</li>
<li>Kanton, S., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+assembloids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Human assembloids.</a> Development. 149 (20), dev201120 (2022).</li>
<li>Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Top+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Synthetic tissues.</a> Emerg Top Life Sci. 3 (5), 615(2019).</li>
</ol>

NP è il fondatore di Khufu Therapeutics, un'azienda di ingegneria degli organoidi che sviluppa trattamenti per le malattie epatiche acute e croniche.

Il presente protocollo comprende diversi metodi per la coltivazione di assembloidi semplici e complessi, nonché tecniche per indurre la migrazione cellulare collettiva 3D nell'organogenesi epatica precoce24,25. I protocolli delineati evidenziano diversi passaggi critici, con la formazione di sferoidi che è un aspetto centrale in tutte le metodologie. I micropozzetti (96 o 384 pozzetti) sono utilizzati con piastre non aderenti o rivestite di agarosio per ottenere ...

La migrazione delle cellule epatiche svolge un ruolo significativo nell'organogenesi epatica, nella malattia e nella terapia cellulare. Durante l'organogenesi epatica (E8.5-9.0, topo), l'epitelio pre-epatico dell'intestino anteriore ventrale inizia ad esprimere geni epatici a causa di segnali induttivi provenienti dal mesenchima circostante e dal cuore. A E9.0, l'epitelio dell'intestino anteriore si ispessisce quando le cellule passano da una morfologia cuboidale a una colonnare pseudostratificata, formando il diverticolo epatico1,2. In questa fase critica, il diverticolo epatico è composto da solo ~ 1.500 cellule. Successivamente, l'endoderma epatico che riveste il diverticolo epatico si ispessisce, si delamina e forma cordoni di epatoblasti migratori (HB). Questi HB co-migrano con le cellule endoteliali e le cellule mesenchimali, ramificandosi nel tessuto mesenchimale circostante, avviando la migrazione cellulare collettiva tridimensionale per formare la <gemma epatica class="xref">3,4. Infatti, durante questa fase, le cellule subiscono collettivamente (1) co-migrazione, o movimento insieme ad altri tipi di cellule, (2) morfogenesi ramificata o formazione di strutture tubolari ramificate e (3) migrazione interstiziale, o migrazione sopra o tra altre cellule. Con E11.5, la migrazione cessa e si è formato il fegato primitivo, espandendosi di 103 volte3. La migrazione delle cellule epatiche può essere necessaria anche nelle fasi successive dell'organogenesi epatica, poiché l'espressione di HBs fetali di ratto ha mostrato prove di geni altamente sovraregolati associati alla migrazione cellulare collettiva 3D, alla morfogenesi e al rimodellamento della matrice extracellulare5. Oltre al suo ruolo nell'organogenesi epatica precoce, la migrazione collettiva 3D è strettamente legata alla diffusione locale e alle metastasi del carcinoma epatocellulare avanzato (HCC), portando infine a un peggioramento della prognosi e a un aumento della resistenza al trattamento6. Gli epatociti adulti e fetali impiegano anche la migrazione collettiva quando si spostano dalla milza all'interno del fegato durante il ripopolamento epatico. Studi di imaging in vivo hanno dimostrato che gli epatociti trapiantati entrano nella vena porta e poi nei capillari entro poche ore, migrando attraverso i sinusoidi epatici e attraverso il tessuto epatico7,8,9. Infine, studi recenti dimostrano che la migrazione degli HB si verifica durante la rigenerazione del fegato murino e umano, con alcune prove di movimento in sheets10. Nel complesso, la migrazione collettiva del fegato, capace di molteplici modalità di morfogenesi, svolge un ruolo significativo nell'organogenesi, nel cancro, nella terapia cellulare con epatociti e nella rigenerazione epatica.
Numerosi studi genetici hanno esplorato i percorsi molecolari alla base della migrazione collettiva delle cellule epatiche 3D. Questi studi rivelano che l'assenza di cordoni epatici ostacola la formazione del fegato, sottolineando la necessità della formazione del cordone epatico e delle loro interazioni con le cellule di supporto per la formazione del fegato1,11,12,13. Questi studi dimostrano anche che la crescita del fegato è avviata da vari fattori, tra cui l'FGF-2 secreto dal mesoderma cardiaco, il BMP4 secreto dal mesenchima circostante, l'HGF e le interazioni delle cellule endoteliali. Inoltre, i fattori di trascrizione associati alla migrazione, tra cui HEX, PROX1 e TBX3, svolgono un ruolo cruciale2,14. In conclusione, gli studi genetici forniscono la prova che la segnalazione del fattore solubile, che porta all'espressione del fattore di trascrizione, guida la migrazione, la segnalazione e le interazioni molecolari tra gli HB e il mesenchima circostante.
Sebbene la migrazione cellulare nell'organogenesi epatica precoce sia stata ampiamente studiata, gli attuali studi in vitro sulla migrazione epatica utilizzano spesso saggi 2D che utilizzano cellule HCC altamente migratorie insieme a modelli tumorali in vivo15. Questi studi hanno fornito informazioni su diversi fattori che influenzano la migrazione epatica, tra cui TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 e miRNAs21,22,23. Sebbene siano stati compiuti notevoli progressi nella comprensione dei meccanismi molecolari nella migrazione delle cellule epatiche 3D, le distinte disparità tra la migrazione cellulare 2D e 3D suggeriscono che i saggi 2D possiedono limitazioni intrinseche. Inoltre, questi modelli spesso mancano dell'inclusione di tipi di cellule mesenchimali, che sono essenziali sia per la migrazione che per la crescita. Sebbene ci siano stati progressi nello sviluppo di modelli 3D per la migrazione del fegato che integrano il mesenchima di supporto, questi modelli enfatizzano principalmente la co-migrazione piuttosto che esplorare le diverse modalità di migrazione collettiva.
La capacità di generare tessuti da sferoidi attraverso vari processi di autoassemblaggio e morfogenetici facilita l'esplorazione scientifica dei tessuti sintetici. Questi tessuti hanno ampie applicazioni nello sviluppo e nello screening di farmaci, nella modellazione delle malattie, nella terapia e in altre applicazioni biomediche e biotecnologiche. Vengono forniti i dettagli metodologici di diversi sistemi di coltivazione 3D in vitro progettati per mostrare diverse modalità di migrazione collettiva 3D del fegato. Questi sistemi comprendono (1) coltura di co-sferoidi con sferoidi HEP e MES in una matrice, (2) goccioline di matrice sferoidale HEP coltivate con M-CM, (3) sferoidi misti HEP-MES e (4) matrice sferoidale HEP coltivata con un'alta densità di cellule MES. Questi sistemi consentono una solida modellazione della migrazione collettiva del fegato in un ambiente 3D, migliorando così la nostra comprensione dei processi molecolari e cellulari alla base dell'organogenesi epatica, del cancro e della terapia.

<table><tbody><tr><td>384 pozzetti Nero/Trasparente Fondo rotondo Attacco ultra-basso Micropiastra sferoidale</td><td>Corning</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>96-wl Piastra per colture cellulari Piatta, TC, STRL, 1/pk, 100/CS</td><td>Prodotti da laboratorio Vendite</td><td>701001</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0576</td> Software Axiovision <td>a basso EEO</td></tr><tr><td></td><td>ZEISS</td><td></td><td>versione 4</td></tr><tr><td>Piatto per colture cellulari, 60mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CS</td><td>Vendita di prodotti da laboratorio</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari, 175 cm&sup2;, Sfiato,TC,STRL,5/pk,40/CS</td><td>Vendita di prodotti da laboratorio</td><td>709003</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari,75 cm&sup2;, Sfiato,TC,STRL,5/pk,100/CS</td><td>Vendita di prodotti</td><td>da laboratorio 708003</td><td></td></tr><tr><td>Provette per centrifuga, 15mL,PP,STRL,grad,50/bg,500/CS</td><td>Vendita di prodotti da laboratorio</td><td>L226010</td><td></td></tr><tr><td>Collagene I, coda di ratto, 100 mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, glucosio alto, integratore GlutaMAX, piruvato</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>EVOS Microscopio fluorescente, a contrasto di fase</td><td>EVOS</td><td>AMEFC4300R</td><td>1.360 x 1.024 densità di pixel</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, qualificato, Stati Uniti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogeno dal plasma umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4883-500MG</td><td>500 mg</td></tr><tr><td>Hep G2 [HEPG2]</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>HERAcell vios 160i</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51033557</td><td></td></tr><tr><td>HFF-1</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1041</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>IJ1.46r; https://imagej.net/ij/</td></tr> <tr><td>Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Membrana basale Matrice, senza LDEV, 10 mL</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MRC-5</td><td>ATCC</td><td>CCL-171</td><td></td></tr><tr><td>MSCGMT Crescita di cellule staminali mesenchimali umane BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Trombina da plasma umano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6884-100UN</td><td>100 unità</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiD Soluzione per la marcatura cellulare</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22887</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI Soluzione per la marcatura cellulare</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO Marcatura cellulare Soluzione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza Zeiss Axio</td><td>ZEISS</td><td></td><td>SE64, 1.344 & moltiplicato per 1.024 pixel di densità</td></tr></tbody></table>

tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dell'organogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane

In Vitro Cultivation Techniques for Modeling Liver Organogenesis, Building Assembloids, and Designing Synthetic Tissues using Human Cell Lines

La malattia epatica cronica ha raggiunto proporzioni epidemiche, colpendo oltre 800 milioni di persone in tutto il mondo. Il trattamento attuale, il trapianto ortotopico di fegato, ha diverse limitazioni. Nel campo della medicina rigenerativa del fegato sono emerse soluzioni promettenti, con l'organogenesi epatica che ha un potenziale significativo. L'organogenesi epatica precoce, che si verifica tra E8.5 e 11.5, comporta la formazione di interazioni epiteliali-mesenchimali che portano alla morfogenesi, alla formazione del cordone epatico e alla migrazione collettiva. Tuttavia, mancano metodi per la modellazione in vitro di questo processo. In questo studio, viene presentata una serie dettagliata di metodi, che consentono la modellazione di vari stadi e aspetti dell'organogenesi epatica con linee cellulari umane. In una serie di metodi, viene utilizzata la tecnologia assembloide con sferoidi epatici (HEP) e mesenchimali (MES), replicando le strutture precoci presenti nell'organogenesi epatica, modellando la morfogenesi precoce e dimostrando la migrazione cellulare interstiziale come osservato in vivo. Questi innovativi sistemi assembloidi aiutano a identificare i fattori che influenzano la formazione e la migrazione degli assembloidi. I sistemi di coltivazione di sferoidi HEP sono stati impiegati anche per modellare la migrazione collettiva e la morfogenesi ramificata. I terreni mesenchimalici condizionati (M-CM) svolgono un ruolo significativo nell'avvio della migrazione ramificata dose-dipendente. Tutti i metodi presentati hanno dimostrato di essere altamente riproducibili con un alto tasso di successo. Collegando questi eventi insieme, il nostro lavoro consentirà di ricreare eventi morfogenetici sequenziali per decodificare l'organogenesi in vitro e in vivo.

L'interesse per tessuti sintetici in una vasta gamma di applicazioni biomediche, come la modellizzazione delle malattie, la scoperta di farmaci e l'ingegneria tissutale (Figura 7), è in costante aumento. All'interno di questo settore, gli organoidi, gli sferoidi e le cellule derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) stanno venendo trasformati in tessuti sintetici più complessi e di maggiori dimensioni. Questa trasformazione implica l'applicazione dei principi della morfogenesi,...

Gli organoidi rivoluzionano la modellazione tissutale personalizzata per lo sviluppo di organi, la scoperta di farmaci e la ricerca sulle malattie. L'ingegneria degli organoidi avanza nella creazione di tessuti sintetici intricati. L'obiettivo è quello di integrare la morfogenesi, la tecnologia assembloide e le biomatrici per far progredire l'ingegneria tissutale. Questo protocollo aiuta a modellare l'organogenesi epatica e a stabilire linee guida per la costruzione di tessuti sintetici.

Tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dell'organogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane

Chronic liver disease has reached epidemic proportions, affecting over 800 million people globally. The current treatment, orthotopic liver ...

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Questo articolo si concentrerà sulla creazione di endoderma epatiche umane da popolazioni di cellule staminali embrionali.

Generazione robusta di epatociti-come le cellule da popolazioni di cellule staminali embrionali

Viene descritta una tecnica per isolare epatociti umani e cellule epatiche non parenchimali dallo stesso donatore. I diversi tipi di cellule epatiche costituiscono la base per i modelli funzionali di fegato e l'ingegneria tissutale. Questo nuovo metodo mira a isolare le cellule epatiche in un'elevata resa e vitalità.

Protocollo per l&#39;isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Questa procedura è stata stabilita per essere utilizzata per lo sviluppo di colture epatiche 3D avanzate in vitro, che possono fornire una valutazione più fisiologicamente rilevante dei rischi genotossici associati alle esposizioni di nanomateriali sia su regimi acuti che a lungo termine, a dosi ripetute.

Modelli avanzati di fegato 3D per test di genotossicità in vitro a seguito dell'esposizione a lungo termine ai nanomateriali

Questo protocollo presenta un modello biomimetico 3D con compartimento stromale fibrotico di accompagnamento. Preparato con idrogel fisiologicamente rilevanti in rapporti che imitano le proprietà bio-fisiche della matrice extracellulare stromale, mediatore attivo delle interazioni cellulari, della crescita tumorale e della metastasi.

Un modello biomimetico per il cancro al fegato per studiare le interazioni tumore-stroma in un ambiente 3D con proprietà bio-fisiche tonnibili

Un sistema di coltura organoide 3D ex vitro a lungo termine è stato stabilito da epatociti di topo. Questi organoidi possono essere passati e manipolati geneticamente dall'infezione da lentivirus di costruzione shRNA/ectopica, trasfezione di siRNA e ingegneria CRISPR-Cas9.

Istituzione e manipolazione genetica degli organoidi epatociti murini

Qui presentiamo un metodo non genetico per generare sferoidi epatici autologhi umani usando cellule mononucleate isolate dal sangue periferico allo stato stazionario.

Sferoidi epatici umani da sangue periferico per studi sulle malattie del fegato

Questo protocollo descrive la generazione di organoidi epatici endodermici (eHEPO) veloci e riproducibili. Con questo protocollo, gli eHEPO possono essere prodotti entro 2 settimane e ampliati a lungo termine (più di 1 anno) senza perdere la loro differenziazione e funzionalità.

Generazione di organoidi epatici endodermici funzionali

Forniamo una panoramica completa e un perfezionamento dei protocolli esistenti per la formazione di organoidi del carcinoma epatocellulare (HCC), comprendendo tutte le fasi della coltivazione degli organoidi. Questo sistema funge da modello prezioso per l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici e la valutazione dell'efficacia dei farmaci candidati.

Sviluppo e ottimizzazione di un modello di organoide derivato da pazienti affetti da carcinoma epatocellulare umano per l'identificazione di potenziali bersagli e la scoperta di farmaci

I recenti progressi tecnici hanno consentito la produzione su larga scala di una piattaforma in vitro per il metabolismo dei farmaci e le applicazioni di tossicità. Un sistema epatico 2D+ completamente umano (TV2D+) fornisce risultati fisiologicamente rilevanti utilizzando i tradizionali metodi di coltura bidimensionale. Questo protocollo supporterà gli utenti finali nella configurazione, nella manutenzione e nell'applicazione del sistema.

Un sistema di coltura epatica interamente umano per applicazioni di sviluppo di farmaci

Questo protocollo presenta una tecnica ottimizzata di perfusione epatica della collagenasi in due fasi in un modello di ratto e mostra l'uso di epatociti isolati per la coltura in vitro a lungo termine di organoidi 3D.

Perfusione epatica di ratto e isolamento degli epatociti primari: una vecchia procedura cruciale per la coltura di organoidi 3D all'avanguardia

Scopri tecniche di coltivazione in vitro per modellare l'organogenesi epatica utilizzando linee cellulari umane e approcci di miniaturizzazione. Questo metodo consente di studiare la morfogenesi e la migrazione cellulare.

Tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dellorganogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane (Video) | JoVE Journal

Tecniche di coltivazione in vitro per la modellazione dell'organogenesi epatica, la costruzione di assembloidi e la progettazione di tessuti sintetici utilizzando linee cellulari umane

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