Name: Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-01-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: Impara a isolare le cellule stromali da midollo osseo e timo murino per studi di ematopoiesi. Questi protocolli ottimizzati per multiomica a singola cellula consentono di identificare popolazioni stromali eterogenee.

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Siamo stati supportati con l'assistenza tecnica di esperti dalla struttura di citometria a flusso HSCI-CRM del Massachusetts General Hospital e dalla struttura Bauer Core dell'Università di Harvard. T.K e K.G sono stati sostenuti dal Consiglio svedese per la ricerca e C.M. dalla Fondazione tedesca per la ricerca. Ringraziamo Sergey Isaev e I-Hsiu Lee per l'assistenza nell'analisi dei dati di sequenziamento dell'RNA a singola cellula.

Ottimizzazione dell'isolamento delle cellule stromali dal timo e dal midollo osseo

<ol><li>Baryawno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+taxonomy+of+the+bone+marrow+stroma+in+homeostasis+and+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia.</a> Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).</li>
<li>Severe, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+changes+in+bone+marrow+stromal+cell+populations+revealed+through+single-cell+protein+expression+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping.</a> Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).</li>
<li>Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+2020+view+of+thymus+stromal+cells+in+t+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development.</a> J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).</li>
<li>Park, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+t+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), (2020).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Lischetti, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+thresholding+and+tissue+dissociation+optimization+for+cite-seq+identifies+differential+surface+protein+abundance+in+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma.</a> Commun Biol. 6 (1), 830(2023).</li>
<li>Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+and+perivascular+cells+maintain+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells.</a> Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).</li>
<li>Mendez-Ferrer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+and+haematopoietic+stem+cells+form+a+unique+bone+marrow+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche.</a> Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).</li>
<li>Raaijmakers, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((progenitor+dysfunction+induces+myelodysplasia+and+secondary+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia.</a> Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).</li>
<li>Himburg, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+bone+marrow+sources+of+pleiotrophin+control+hematopoietic+stem+cell+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration.</a> Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).</li>
<li>Zhou, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes+promote+the+regeneration+of+stem+cells+and+haematopoiesis+by+secreting+scf%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf.</a> Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).</li>
<li>Steinmann, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+human+thymus+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Top+Pathol%22%5BJournal%5D)">Changes in the human thymus during aging.</a> Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).</li>
<li>Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+involution+of+the+ageing+human+thymic+epithelium+is+independent+of+puberty.+A+morphometric+study%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study.</a> Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).</li>
<li>Ambrosi, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+accumulation+in+the+bone+marrow+during+obesity+and+aging+impairs+stem+cell-based+hematopoietic+and+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).</li>
<li>Ho, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+bone+marrow+hematopoietic+stem+cell+niches+promotes+myeloid+cell+expansion+during+premature+or+physiological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging.</a> Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).</li>
<li>Kusumbe, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+modulation+of+vascular+niches+for+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Stoeckle, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+myeloid+dendritic+cells+and+epithelial+cells+from+human+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus.</a> J Vis Exp. (79), e50951(2013).</li>
<li>Gustafsson, K., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+thymus+stromal+cells+from+human+and+murine+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue.</a> Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).</li>
<li>Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html">Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html</a> (2023).</li>
<li>Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+hind+limb+long+bone+dissection+and+bone+marrow+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation.</a> J Vis Exp. (110), e53936(2016).</li>
<li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+isolation+and+culture+of+mesenchymal+stem+cells+from+mouse+compact+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone.</a> Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).</li>
<li>Calvi, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoblastic+cells+regulate+the+haematopoietic+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche.</a> Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).</li>
<li>Kode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukaemogenesis+induced+by+an+activating+beta-catenin+mutation+in+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts.</a> Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).</li>
<li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+niche-specific+expression+of+cxcl12+controls+quiescence+of+treatment-resistant+leukemia+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells.</a> Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).</li>
<li>Duarte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+endosteal+vascular+niche+remodeling+rescues+hematopoietic+stem+cell+loss+in+aml%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml.</a> Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).</li>
<li>O'flanagan, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+solid+tumor+tissues+with+cold+active+protease+for+single-cell+rna-seq+minimizes+conserved+collagenase-associated+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses.</a> Genome Biol. 20 (1), 210(2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biol. 19 (1), 224(2018).</li>
</ol>

D.T.S. è direttore e azionista di Agios Therapeutics e Editas Medicines; fondatore, direttore, azionista e membro del comitato consultivo scientifico di Magenta Therapeutics e LifeVault Bio, azionista e fondatore di Fate Therapeutics e Garuda Therapeutics e direttore, fondatore e azionista di Clear Creek Bio, consulente di FOG Pharma, Inzen Therapeutics e VCanBio e destinatario di finanziamenti per la ricerca sponsorizzati da Sumitomo Dianippon. D.T.S e K.G sono inventori di US20220143099A1 brevettuali.

Le cellule stromali negli organi ematopoietici sono fondamentali per la normale produzione di sangue e le perturbazioni dello stroma ematopoietico possono causare gravi compromissioni nel mantenimento ematopoietico e nella risposta allo stress 9,23,24. La comprensione delle cellule stromali ematopoietiche è essenziale per comprendere le malattie ematologiche 7,9,10,24 e per la capacità di sviluppare terapie per combatterle 25,26. La separazione riproducibile dello stroma ematopoietico dal parenchima è tuttavia una sfida, in particolare con l'avvento della multiomica a singola cellula che richiede preparazioni di campioni di alta qualità massimizzando la resa e la varietà delle cellule stromali. I protocolli qui descritti sono stati ottimizzati per essere compatibili con la maggior parte delle applicazioni multiomiche a valle, affrontando al contempo le sfide dell'isolamento delle cellule stromali ematopoietiche 1,2,19.
Il primo problema da considerare per l'isolamento delle cellule stromali ematopoietiche sono le condizioni di dissociazione. La dissociazione ottimale è fondamentale per rilasciare le cellule stromali dal tessuto per riflettere la completa eterogeneità del compartimento stromale 1,2. La scelta della giusta miscela di dissociazione dipende dall'ambito sperimentale e dai protocolli a valle. Si consiglia di preparare miscele di dissociazione il più fresche possibile e di tenerle in ghiaccio fino all'uso. Alcuni componenti sono difficili da sciogliere, come la dispasi, e potrebbero richiedere più tempo per la miscelazione delle pipette. Il vortex non è raccomandato in quanto potrebbe interrompere la conformazione nativa degli enzimi della digestione, portando infine alla loro inattivazione. È importante sottolineare che l'EDTA inibisce l'attività enzimatica e deve essere evitato durante le fasi di digestione attiva, ma può essere impiegato per fermare la reazione se l'enzima contenente tampone non può essere rimosso tempestivamente. Oltre alla miscela enzimatica stessa, due punti sono fondamentali per un'efficiente dissociazione dei tessuti, (1) frantumazione e taglio accurati per aumentare la superficie e (2) tempo di incubazione sufficiente con gli enzimi della digestione. Il tessuto timico umano è, ad esempio, significativamente più difficile da dissociare rispetto al tessuto murino e i tempi di digestione devono quindi essere più lunghi. Se non viene effettuato un aggiustamento per il tessuto umano, la resa stromale e la varietà cellulare saranno ridotte (Figura 2A). Gli enzimi di dissociazione richiedono una temperatura ottimale di 37 °C che influenza inevitabilmente l'espressione genica27. Sebbene la dissociazione a freddo o a temperatura più bassa sia auspicabile per conservare gli stati cellulari, attualmente non esistono combinazioni di enzimi di dissociazione freddo-attivi disponibili in commercio adatte all'osso e al midollo osseo. Per qualsiasi tessuto che richiede digestione, l'eterogeneità e il contributo percentuale acquisito dai diversi tipi di cellule cambieranno invariabilmente con il tempo di digestione, la composizione del cocktail enzimatico e l'elaborazione. A valle di queste fasi iniziali, l'eterogeneità e la rappresentazione saranno ulteriormente limitate dalle fasi di filtrazione, come le dimensioni degli ugelli durante lo smistamento e la cattura di tipi di cellule difficili (ad esempio, adipociti dallo stroma) e diametri dei canali dei dispositivi fluidici. Pertanto, quando si confrontano i set di dati, dovremmo essere consapevoli del fatto che queste differenze nei protocolli possono influire sulla rappresentazione delle sottopopolazioni. Ne consegue logicamente che dobbiamo essere vigili nel mantenere uguali le fasi di lavorazione quando misuriamo l'impatto delle perturbazioni nei sistemi stromali.
Mentre il costo del sequenziamento è stato e sta diminuendo, le tecnologie a singola cellula sono spesso limitate dal numero di cellule che possono essere analizzate. Per ottimizzare la capacità di ciascun kit di reagenti, è stata impiegata la deplezione magnetica delle cellule ematopoietiche quando possibile. Ciò consente di evitare un numero elevato di cellule contaminanti che sono molto più numerose dello stroma sia nel midollo osseo che nelle frazioni di campioni di timo. Tuttavia, se il materiale di partenza è limitato, come nel caso del tessuto timico post-trapianto, l'aumento e non specifico della perdita di cellule in cui incorrono invariabilmente le strategie di deplezione magnetica, può renderlo sconsigliabile. Inoltre, durante la preparazione e la digestione dei tessuti, la frantumazione, il taglio e il rilascio enzimatico dei componenti della matrice extracellulare generano una grande quantità di detriti. Questo tipo di contaminante, se lasciato nel campione per l'analisi, può causare problemi di intasamento nella lavorazione a valle, causare pozzetti negativi per lo smistamento dell'indice di singola cellula e gonfiare notevolmente le percentuali di gate padre nell'analisi. La colorazione con calceina è stata utilizzata per il gate positivo per cellule/cellule vive. La calceina è disponibile in diversi colori, il che la rende altamente adattabile alla matrice di colorazione. Quando si lavora con la calceina, fare attenzione a non sottoporre il colorante a ripetuti cicli di congelamento-scongelamento (ad esempio, preparare sempre fresco e conservare a temperatura ambiente dopo lo scioglimento).
La capacità di multiplexare i campioni basati su anticorpi codificati a barre con oligodi DNA 28 consente una maggiore utilità delle reazioni di sequenziamento di singole cellule su piattaforme come 10x Genomics. Gli anticorpi hashtagging progettati per il multiplexing dei campioni sono dotati di diversi bersagli per le molecole della superficie cellulare o della membrana nucleare e di specificità sia per il topo che per l'uomo. Mentre il sistema di hashtagging cellulare è stato utilizzato con successo per più tessuti, gli esperimenti che combinano miscele di enzimi di digestione con il successivo uso di hashtag possono portare a una drastica riduzione del recupero. Abbiamo cercato di includere ulteriori fasi di lavaggio dopo la dissociazione e abbiamo aggiunto EDTA per inibire l'attività degli enzimi della digestione. Tuttavia, anche con questi passaggi, aspettati un'identificazione degli hashtag inferiore rispetto alle cellule ematopoietiche. È stato riscontrato che con i protocolli di digestione enzimatica, i tassi di cattura degli hashtag erano compresi tra il 30% e il 70%. Ciò si verifica nonostante il fatto che lo stesso clone di anticorpo con un coniugato fluorocromo marcato >90% delle cellule stromali nella stessa popolazione. Qualsiasi disegno sperimentale che abbini la digestione enzimatica del tessuto con l'hashtagging dovrebbe essere pilotato e si dovrebbe prendere cautela per garantire l'inibizione enzimatica.

Nell'adulto sano, la produzione de novo di cellule del sangue avviene nel midollo osseo e nel timo. Le cellule stromali in questi siti sono essenziali per il mantenimento dell'emopoiesi, ma lo stroma costituisce meno dell'1% del tessuto 1,2,3,4. Ottenere isolati puri di emopoiesi che supportano lo stroma costituisce quindi una sfida significativa, in particolare per la multiomica a singola cellula che richiede un'elaborazione rapida per ottenere campioni di alta qualità. I componenti di diversi cocktail di digestione possono interferire con alcune fasi dell'analisi multiomica 5,6. I protocolli qui presentati descrivono in dettaglio l'isolamento di un'ampia varietà di cellule stromali dal midollo osseo e dai tessuti timici.
Le perturbazioni dei costituenti stromali sia nel midollo osseo che nel timo provocano una profonda interruzione dello sviluppo delle cellule del sangue e possono provocare tumori maligni 7,8,9. L'emopoiesi che supporta lo stroma viene danneggiata in seguito al condizionamento citotossico e al trapianto di midollo osseo, con conseguente riduzione della secrezione di citochine e fattori di crescita che sostengono le cellule staminali ematopoietiche e progenitrici (HSPC)2,10,11. Inoltre, l'invecchiamento colpisce le cellule stromali del midollo osseo e del timo, contribuendo probabilmente ai fenotipi ematopoietici invecchiati. Il timo è il primo organo a subire un'estesa involuzione associata all'età. Il grasso e il tessuto fibrotico iniziano a sostituire lo stroma di supporto delle cellule T già all'inizio della pubertà12,13. Nel midollo osseo, il contenuto di adipociti aumenta con l'età e le nicchie vascolari ed endostali sono significativamente rimodellate 14,15,16.
Per consentire lo studio dello stroma di supporto all'emopoiesi in più stati di stress e nel caso del timo sia del tessuto umano che di quello murino, abbiamo ottimizzato i protocolli di digestione precedentemente pubblicati 1,2,8,17,18. Questi protocolli garantiscono un isolamento efficiente e riproducibile delle cellule e sono compatibili con il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNAseq) e altri tipi di multiomica.

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>7AAD (7-aminoactinomicina D)</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di lignaggio anti-umano 3-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>643510</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino</td><td>Albumina Millipore Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6 topi</td><td>Jackson</td><td>664</td><td>Maschi o femmine, 8-12 settimane</td></tr><tr><td>di Calcein&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>65-0853-78</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Millipore Sigma</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Filtri per Cellule Sterili Corning, Bianco, Dimensioni della maglia: 70 &; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione Dnase I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90083</td><td>&nbsp; 2500 U/mL</td></tr><tr><td>Streptavidina di topo Easysep Kit di isolamento RapidSpheres</td><td>StemCell Technologies</td><td>19860</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>A31605-01</td><td>Qualificato One Shot</td></tr><tr><td>Human Fc Block</td><td>BD Biosciences</td><td>564220</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>5401127001</td><td>Research Grade</td></tr><tr><td>Medium 199</td><td>Gibco</td><td>12350</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD235a-BV77</td><td>BD Biosciences</td><td>740785</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD31-PE/Dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>303130</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD45-BV77</td><td>Biolegend</td><td>304050</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD4-BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>562658</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD66b-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>555724</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-umano CD8-APC/Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557760</td><td></td></tr><tr><td>Topo anti-umano EpCam-BV421</td><td>Biolegend</td><td>324220</td><td></td></tr><tr><td>Protettore Inibitore della RNasi</td><td>Millipore Sigma</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD105-PE /dazzle594</td><td>Biolegend</td><td>120424</td><td></td></tr><tr><td>Ratto anti-topo CD11b-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>101204</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD140a-APC</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-1401-81</td><td></td></tr><tr><td>Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD31-BUV737</td><td>BD Biosciences</td><td>612802</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD31-BV421</td><td>Biolegend</td><td>102424</td><td></td></tr><tr><td>Ratto anti-topo CD3-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>100244</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45.2-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>109804</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>103114</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto CD45R/B220-Biotin</td><td>Biolegend</td><td>103204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto CD51-PE</td><td>Biolegend</td><td>104106</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto EpCam-BV711</td><td>BD Biosciences</td><td>563134</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto Ly-6A/E(Sca-1)-AF700</td><td>Biolegend</td><td>108142</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-Biotin</td><td></td><td>Biolegend 108404</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto Ter119-Biotina</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto Ter119-PE</td><td>Biolegend</td><td>116208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-topo di ratto Ter119-PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>116222</td><td></td></tr><tr><td>Stemxyme&nbsp;</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS004107</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

Stromal Cell Isolation From Hematopoietic Organs

Il sequenziamento di singole cellule ha permesso la mappatura di popolazioni cellulari eterogenee nello stroma degli organi ematopoietici. Queste metodologie forniscono una lente attraverso la quale studiare l'eterogeneità precedentemente irrisolta allo stato stazionario, nonché i cambiamenti nella rappresentazione del tipo cellulare indotti da stress estrinseci o durante l'invecchiamento. Qui, presentiamo protocolli graduali per l'isolamento di popolazioni di cellule stromali di alta qualità dal timo murino e umano, nonché dall'osso murino e dal midollo osseo. Le cellule isolate attraverso questi protocolli sono adatte per generare set di dati multiomici a singola cellula di alta qualità. Qui vengono discussi gli impatti della digestione del campione, l'esaurimento del lignaggio ematopoietico, l'analisi/smistamento FACS e il modo in cui questi fattori influenzano la compatibilità con il sequenziamento a singola cellula. Con esempi di profili FACS che indicano una dissociazione riuscita e inefficiente e rese di cellule stromali a valle nell'analisi post-sequenziamento, vengono forniti indicatori riconoscibili per gli utenti. Considerare i requisiti specifici delle cellule stromali è fondamentale per acquisire risultati di alta qualità e riproducibili che possano far progredire le conoscenze sul campo.

Questi protocolli producono varietà di cellule stromali riproducibili dal timo e dal midollo osseo adatte per l'analisi citofluorimetrica, nonché per la multiomica a singola cellula, come il sequenziamento dello scRNA. Il tessuto timico murino subisce un significativo rimodellamento in risposta a fattori di stress, come il condizionamento citotossico che precede il trapianto di midollo osseo o il naturale processo di invecchiamento. Di conseguenza, la cellularità timica è drasticamente ridotta in entrambi questi contesti (Figura 1A). Mentre un timo di un topo selvatico di 8 settimane contiene circa 100 milioni di cellule, ci si può aspettare che la cellularità di un topo di 2 anni sia la metà di quella e un timo 4 giorni dopo l'irradiazione e il trapianto di midollo osseo può essere di soli 5.000.000 di cellule (Figura 1A).
Il condizionamento citotossico ablerà preferenzialmente le cellule ematopoietiche, quindi il compartimento stromale sarà arricchito proporzionalmente (Figura 1B). Tuttavia, la bassa cellularità complessiva renderà difficile isolare un numero sufficiente di cellule stromali timiche. Potrebbe quindi essere necessario raggruppare gli animali per ottenere numeri di cellule compatibili con le applicazioni multiomiche a valle e per ridurre al minimo la perdita di materiale, ove possibile. Per eseguire la multiomica su cellule stromali timiche, lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) di cellule CD45-Ter119- vive, singole (Figura 1C) garantirà che un numero sufficiente di cellule possa essere selezionato dalla maggior parte delle condizioni di stress.
Per preservare l'eterogeneità del compartimento stromale, in genere non selezioniamo un singolo marcatore stromale positivo, ma cancelliamo le cellule ematopoietiche. L'inclusione di marcatori di cellule stromali positive è ancora raccomandata per l'analisi per garantire che sia stata raggiunta una corretta dissociazione tissutale. Tuttavia, l'isolamento del FACS è imperfetto e, come determinato da scRNAseq, il 30%-50% delle cellule selezionate sarà di origine ematopoietica (Figura 1D, E). Questo può essere migliorato esaurendo magneticamente le cellule CD45+ prima del FACS; tuttavia, questo non è raccomandato per condizioni di ridotta cellularità timica (Figura 1A) poiché la perdita di materiale che deriva dalla lavorazione extra coinvolta nella deplezione magnetica si traduce in rese stromali troppo basse per le applicazioni a valle.
Per l'isolamento dello stroma timico umano, il passaggio più critico è la digestione enzimatica. Se la fase di dissociazione è affrettata, la resa complessiva delle cellule stromali, così come la rappresentazione del sottotipo di cellula stromale, saranno gravemente ridotte (Figura 2A). Si raccomanda inoltre di includere sempre i marcatori dell'endotelio e dell'epitelio timico per garantire che la digestione dei tessuti sia stata ottimale, poiché il semplice gating negativo per i marcatori ematopoietici non sarà sufficiente per valutare l'effettivo rilascio di cellule stromali. Ciò è esemplificato nella Figura 2A, dove la percentuale di cellule negative per i marcatori ematopoietici è più alta nel campione digerito per 30 minuti rispetto al campione incubato per 90 minuti. Tuttavia, come si vede nel cancello consecutivo, la resa delle cellule endoteliali ed epiteliali è molto scarsa nel protocollo di digestione più breve (Figura 2A).
Per l'isolamento FACS di cellule stromali timiche umane per applicazioni multiomiche, si suggerisce la colorazione con un cocktail di anticorpi di linea ematopoietica, nonché con anticorpi CD4 e CD8, oltre al marcatore pan-ematopoietico CD45 e al marcatore eritroide CD235a (Figura 2B) per migliorare l'arricchimento delle cellule stromali. Pertanto, per l'analisi multiomica umana dello stroma timico, le cellule CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8- vive e singole devono essere selezionate FACS (Figura 2B). Come si è visto per scRNAseq di campioni murini, ciò provoca ancora la contaminazione del 30%-50% delle cellule ematopoietiche, ma ciò fornisce ancora una risoluzione accettabile del compartimento stromale del timo umano (Figura 2C, D).
Per l'osso e lo stroma BM, è stata utilizzata la stessa strategia utilizzata per il tessuto timico; Le cellule stromali vengono isolate mediante gating su cellule negative per i marcatori ematopoietici e ulteriori marcatori di cellule stromali sono inclusi come controlli della digestione (Figura 3). La dissociazione del tessuto calcificato come l'osso provoca un significativo accumulo di detriti. L'aggiunta di calceina come colorante vitale consentirà l'esclusione della maggior parte di questi detriti, che altrimenti gonfiano falsamente i numeri ordinati e diminuiscono le frequenze di popolazione recintata (Figura 3). Questo è esemplificato nei grafici FACS che confrontano il gating su tutte le celle e il gating solo su Calcein+ (Figura 3). Come osservato per le cellule stromali timiche umane, la percentuale di cellule ematopoietiche marcatore-negative non è una lettura affidabile per l'efficienza della dissociazione ossea e del tessuto midollare (Figura 3). Mentre il cancello CD45-Ter119- può contenere un'abbondanza di cellule in un campione in cui la fase di digestione non è riuscita, ulteriori analisi dei tipici marcatori delle cellule stromali ossee e del midollo osseo CD31, CD140a e CD51 dimostrano chiaramente uno scarso rilascio di stroma (Figura 3 e Figura 4).
Per l'isolamento FACS dell'osso murino e delle cellule stromali del midollo osseo, si suggerisce l'utilizzo della strategia di gating come nella Figura 3, dove selezioniamo solo CD45-Ter119-Calcein+ ma monitoriamo le proprietà di dispersione diretta e laterale e l'espressione dei marcatori delle cellule stromali della popolazione selezionata per garantire una digestione ottimale (Figura 3A). La combinazione della deplezione delle cellule magnetiche positive per il lignaggio ematopoietico del midollo osseo prima della FACS e lo smistamento sui cancelli mostrati si traduce nel sequenziamento di singole cellule che sono &gt;90% di stroma. Un esempio di tale esecuzione di seq scRNA (Figura 5A, B) illustra questa bassa contaminazione ematopoietica dopo l'annotazione basata sul trascrittoma delle cellule analizzate (esempi di geni marcatori ematopoietici Figura 5C). Ciò è in netto contrasto con le preparazioni stromali timiche, in cui la deplezione delle cellule magnetiche non è stata eseguita prima della fase di selezione a causa del materiale di partenza limitato nel tessuto timico post-trapianto (Figura 1F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig01.jpg"> Figura 1: Citometria a flusso e sequenziamento dell'RNA a singola cellula dello stroma del timo murino. (A) Quantificazione del numero di timociti in topi di 8 settimane (Controllo), topi di 8 settimane irradiati letalmente e trapiantati 4 giorni prima (trapianto) e topi di 2 anni (Aged). (B) Grafici rappresentativi di citometria a flusso che dimostrino l'arricchimento nei sottotipi di cellule stromali 4 giorni dopo l'irradiazione letale e il trapianto. (C) Strategia di gating della citometria a flusso per ordinare lo stroma del timo murino per l'analisi multiomica a singola cellula. (D) UMAP del timo murino che indica lo stroma (blu) e le cellule ematopoietiche (rosso). (E) UMAP che mostrano geni marcatori ematopoietici murini in campioni di timo. (F) Quantificazione di cellule stromali ed ematopoietiche murine in campioni di scRNAseq del timo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig02.jpg"> Figura 2: Analisi citofluorimetrica e sequenziamento dell'RNA a singola cellula dello stroma timico umano. (A) Grafici FACS che mostrano risultati rappresentativi dell'impatto di diversi tempi di digestione sul rilascio di popolazioni di cellule stromali timomiche umane. (B) Strategia di gating della citometria a flusso per selezionare lo stroma timico umano per l'analisi multiomica a singola cellula. (C) UMAP del timo umano che indica lo stroma (blu) e le cellule ematopoietiche (rosso). (D) UMAP che mostrano geni marcatori ematopoietici umani in campioni di timo. (E) Quantificazione di cellule stromali ed ematopoietiche umane in campioni di scRNAseq del timo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig03.jpg"> Figura 3: I marcatori stromali del midollo osseo murino e la calceina sono utili per stimare l'efficienza della dissociazione. (A) Analisi rappresentativa della citometria a flusso delle cellule stromali murine del midollo osseo CD45-Ter119- gate su tutte le cellule e sulle cellule della calceina+. Con il successivo gating CD31- che mostra una percentuale più elevata di cellule CD140a+CD51+ quando si selezionano le cellule Calceina+. (B) Analisi di citometria a flusso rappresentativa di una digestione ossea fallita con cellule CD140a+CD51+ mancanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig04.jpg"> Figura 4: Strategia di gating dello stroma del midollo osseo. (A) Strategia di gating della citometria a flusso per selezionare lo stroma del midollo osseo murino per la multiomica a singola cellula. (B) Analisi di citometria a flusso rappresentativa di una digestione del midollo osseo fallita con cellule CD140a+CD51+ mancanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66231/66231fig05.jpg"> Figura 5: Sequenziamento dell'RNA a singola cellula del midollo osseo con composizione delle cellule stromali ed ematopoietiche. (A) UMAP dell'osso murino e del midollo osseo che indica lo stroma (blu) e le cellule ematopoietiche (rosso). (B) Quantificazione di cellule stromali ed ematopoietiche in campioni murini di osso e midollo osseo. (C) UMAP di geni marcatori ematopoietici in campioni di midollo osseo murino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66231/66231fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Qui presentiamo protocolli che consentono l'isolamento di cellule stromali da osso murino, midollo osseo, timo e tessuto timico umano compatibile con la multiomica a singola cellula.

Isolamento delle cellule stromali da organi ematopoietici

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