Name: Modello murino di morsetto ilare polmonare sinistro di lesione da riperfusione da ischemia polmonare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 45 s
Description: Impara il protocollo di clamping ilare polmonare sinistro nei modelli murini per studiare la lesione da ischemia-riperfusione. Questo metodo riproducibile aiuta a comprendere i meccanismi cellulari e molecolari del danno polmonare.

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Modello murino per lo studio del danno da ischemia-riperfusione polmonare

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<li>Nakata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+anti-HMGB1+monoclonal+antibody+on+lung+ischemia+reperfusion+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice.</a> Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).</li>
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Gli autori non riportano alcuna divulgazione rilevante.

Descriviamo una tecnica di clamp ilare che prevede l'applicazione di un nodo scorsoio sull'ilo sinistro che occlude l'arteria polmonare e le vene e i bronchi per indurre l'ischemia calda seguita da riperfusione. Dopo il clampaggio ilare, il polmone sinistro può essere prelevato per una varietà di tecniche sperimentali come l'istologia, la citometria a flusso, il sequenziamento di massa o di singole cellule e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Inoltre, il sangue e la milza possono essere utilizzati per studiare gli effetti sistemici, mentre il polmone destro non ischemico può fungere da controllo interno. In questo protocollo, descriviamo anche metodi dettagliati per ottenere misurazioni ABG e/o determinare lo stravaso cellulare.
La tecnica di clampaggio ilare murino è fondamentale per lo studio dell'IRI polmonare e per il più ampio campo del trapianto di polmone. Ad esempio, utilizzando questo modello di morsetto ilare, il nostro gruppo ha scoperto che i monociti classici CCR2+ derivati dalla milza mediano lo stravaso di neutrofili nel polmone dopo IRI18. Un altro gruppo ha dimostrato che le cellule epiteliali alveolari di tipo II producono CXCL1 (un chemioattrattivo neutrofilo) in modo NADPH ossidasi-IL-17-TNFα-dipendente utilizzando un modello di morsetto ilare19. È stato scoperto che TLR4 svolge un ruolo nello sviluppo dell'edema in un modello murino di clamping ilare20.
Sebbene il trapianto di polmone murino ortotopico sia più clinicamente applicabile e possa simulare sia l'ischemia calda che quella fredda, introduce anche traumi chirurgici da anastomosi vascolari e bronchiali e stimoli allogenici da mancata corrispondenza donatore-ricevente. Pertanto, il vantaggio principale della tecnica del morsetto ilare è la sua capacità di isolare gli effetti dell'IRI polmonare da questi altri fattori. Inoltre, per il microchirurgo del topo inesperto, la procedura di clamp ilare è tecnicamente meno impegnativa e può essere padroneggiata più rapidamente rispetto al trapianto di polmone. Una limitazione del modello a morsetto ilare è che l'ischemia fredda è difficile da ottenere. L'ischemia fredda in situ è stata eseguita in suini con perfusione anterograda attraverso l'arteria polmonaresinistra 25, tuttavia questo è molto più impegnativo nel topo a causa delle sue dimensioni ridotte e della necessità di mantenere la normotermia durante l'intervento chirurgico. Tuttavia, lo studio dell'ischemia calda isolata è importante in quanto è generalmente più deleteria per la funzione degli organi rispetto all'ischemia fredda 4,5,6. Inoltre, i centri trapianti stanno adottando sempre più trapianti di polmone DCD, che sono accompagnati da tempi ischemici caldi molto più lunghi rispetto ai tradizionali trapianti di polmone DBD7. Pertanto, lo studio dettagliato degli eventi durante l'ischemia calda e il successivo periodo di riperfusione è fondamentale e può essere realizzato con questo modello di morsetto ilare.
Negli ultimi due decenni sono state create molte varianti della tecnica del morsetto ilare. Questi includono l'uso di un morsetto microvascolare atraumatico 8,9,10,11,12,13, un laccio emostatico Rumel14,15 e una cravatta con un nodo scorsoio attorno all'ilo16. Descriviamo il nostro adattamento della tecnica del nodo scorsoio nei topi. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altre tecniche di clamp ilare è che consente la chiusura del torace durante il periodo di ischemia, riducendo al minimo le perdite di liquidi insensibili, in particolare nei protocolli con periodi di ischemia più lunghi. Questo non può essere ottenuto quando un morsetto o un laccio emostatico è posizionato sull'ilo.
Per quanto riguarda la selezione animale, abbiamo scelto di sviluppare questo modello nel topo rispetto ai ratti o ai modelli di animali di grandi dimensioni, come il maiale. Il ragionamento è duplice: il nostro laboratorio ha una vasta esperienza nella microchirurgia murina con trapianto ortotopico di polmone di topo17. In secondo luogo, mentre i topi sono più piccoli e tecnicamente più difficili da operare rispetto ai ratti, attualmente ci sono più ceppi di topi transgenici disponibili in commercio rispetto ai ceppi di ratto26,27. I topi si riproducono anche più rapidamente, consentendo uno sviluppo più rapido di nuovi ceppi, il che è particolarmente utile quando si studiano i meccanismi immunitari dell'IRI. Per questi motivi, abbiamo scelto di sviluppare questa tecnica nei topi.
Per quanto ne sappiamo, questo è il primo articolo basato su video che utilizza la tecnica del morsetto ilare del polmone sinistro nel topo con nodo scorsoio. Saito et al. hanno pubblicato un articolo basato su un video che dimostra il clamp ilare nel ratto utilizzando un clamp microvascolare22. Nel topo, Liao et al hanno pubblicato un modello IRI polmonare con bloccaggio dell'arteria polmonare (PA) con un nodo scorsoio, tuttavia il polmone rimane ventilato in questo modello poiché il bronco è escluso dal morsetto28. La tecnica di clampaggio PA è stata utilizzata come modello per studiare l'embolia polmonare29, l'ipertensione polmonare e/o l'insufficienza ventricolare destra30,31. Poiché l'area di studio è l'IRI polmonare nel trapianto, abbiamo scelto di bloccare l'intero ilo, compreso il bronco, per ridurre al minimo il barotrauma oltre al danno ischemico.
Da notare che sono stati scelti 30 minuti di ischemia calda seguiti da 1 ora di riperfusione perché siamo interessati alla dinamica delle cellule infiltranti il polmone nel primissimo periodo post-IRI. Ad esempio, gli studi hanno riportato una sovraregolazione dei geni citoprotettivi, come l'eme ossigenasi 1, dopo soli 30 minuti di ischemia seguiti da 2 ore di riperfusione13. In precedenza si pensava che i neutrofili fossero il tipo di cellula centrale che si infiltrava nel polmone dopo IRI32, tuttavia abbiamo dimostrato che i monociti precedono i neutrofili nel loro arrivo al polmone 18,24. Più recentemente, abbiamo scoperto che le cellule B precedono anche i monociti ed entrano nel polmone entro 1 ora dalla riperfusione (dati non pubblicati). Quando si adatta questa tecnica, le durate dell'ischemia calda e della riperfusione possono essere regolate in base alla domanda e all'ipotesi dello studio. Periodi più lunghi di ischemia calda sono possibili senza preoccuparsi di un'eccessiva perdita di liquidi e calore, poiché il torace può essere chiuso durante questo periodo.
Diverse complicanze possono verificarsi durante il perioperatorio, con l'esito comune finale che è la morte perioperatoria. Abbiamo osservato che l'incidenza della morte degli animali durante l'intervento chirurgico diminuisce con le ripetizioni della tecnica da parte del chirurgo. Stimiamo che i chirurghi richiedano almeno 2 mesi di pratica e/o almeno 20 casi per raggiungere un plateau di abilità. A questo punto, stimiamo che la mortalità intraoperatoria si verifichi in circa 1 caso su 50. La morte nel topo anestetizzato è spesso annunciata da respiri agonici che comportano forti contrazioni del diaframma e della muscolatura della parete toracica. All'inizio di questi respiri agonali, la morte si verificherà in 3-5 minuti se non viene effettuato alcun intervento. Ci sono diverse cause che possono precipitare la morte intraoperatoria, molte delle quali sono riconoscibili e prevenibili. Evidenzieremo di seguito i passaggi critici di questo intervento chirurgico e le tecniche di risoluzione dei problemi per ottenere un risultato di successo.
Intubazione Il primo passo fondamentale è un'attenta intubazione e la messa in sicurezza delle vie aeree per evitare l'estubazione involontaria. In un intervento chirurgico di sopravvivenza, è particolarmente importante assicurarsi che le corde vocali non vengano danneggiate durante l'intubazione iniziale, poiché il topo non sarà in grado di respirare dopo l'estubazione. L'avanzamento dell'ETT oltre le corde deve essere effettuato sotto visualizzazione diretta attraverso il microscopio. Se durante l'intubazione si incontra resistenza, l'ETT non deve essere fatto avanzare alla cieca. Mantenendo l'orofaringe aperta con il morsetto per zanzare, è necessario prestare attenzione a non perforare la mucosa orale poiché il sangue oscuri la vista delle vie aeree. Il numero di tentativi di intubazione deve essere limitato a meno di cinque.
Estubazione accidentale Se in qualsiasi momento durante la procedura, i polmoni non sembrano gonfiarsi in modo appropriato, è possibile che l'ETT si sia spostato. Un'altra manifestazione di estubazione accidentale che passa inosservata per un periodo prolungato è il topo che sviluppa improvvisamente la respirazione agonica. Dopo l'intubazione iniziale, è necessario prestare attenzione a fissare bene l'ETT al naso circonferenzialmente con nastro di seta e limitare la regolazione del collo e del busto del topo. Se né il polmone sinistro né quello destro si gonfiano, l'ETT potrebbe essere uscito dalla trachea. Si può tentare di reinserire l'ETT, tuttavia potrebbe essere necessario reintubare il topo in modo rapido per evitare la morte prematura dell'animale. Se solo un polmone si gonfia quando ci si aspetta che lo facciano entrambi, l'ETT potrebbe essere troppo profondo e deve essere accuratamente tirato indietro e rifissato.
Mobilizzazione polmonare La mobilizzazione del polmone sinistro deve essere eseguita utilizzando applicatori con punta di cotone con una leggera pressione sul parenchima polmonare, poiché la lesione da compressione può danneggiare gli alveoli e ridurre la compliance del polmone. I polmoni non devono essere afferrati con pinze o pinze in quanto ciò danneggerebbe il parenchima polmonare.
Applicazione del morsetto ilare La pinza ilare sinistra deve essere posta sotto visualizzazione diretta, facendo attenzione a non stendere il nodo troppo centralmente (per non impigliare l'atrio sinistro) o troppo perifericamente (per non catturare alcun parenchima polmonare). Afferrare l'atrio sinistro con il morsetto ilare probabilmente precipiterà la fibrillazione atriale e la successiva morte. La visualizzazione dell'ilo può essere migliorata garantendo un'adeguata retrazione delle costole per espandere il campo visivo. Dopo aver legato il nodo scorsoio, è utile assicurarsi che il morsetto sia completamente occlusivo eseguendo una manovra di reclutamento, occludendo manualmente il tubo di deflusso che collega l'ETT al ventilatore e assicurandosi che il polmone sinistro non si espanda con una pressione positiva. Si presume l'occlusione vascolare con conferma dell'occlusione bronchiale, data l'aumentata collassabilità dell'arteria polmonare e delle vene rispetto al bronco cartilagineo. Inoltre, il morsetto ilare non deve essere legato con una forza eccessiva in quanto schiaccerà le porzioni cartilaginee del bronco principale sinistro e impedirà l'espansione del polmone sinistro dopo il rilascio del morsetto ilare. Una volta rilasciato il morsetto ilare, è importante verificare che il polmone sia ancora in grado di essere ventilato eseguendo un'altra manovra di reclutamento.
Chiusura sul petto Quando si chiude il torace, la4a e la 5acostola devono essere unite quando il polmone è al massimo dell'inspirazione. Ciò ridurrà al minimo la quantità di aria rimanente nella cavità pleurica, che provocherebbe pneumotorace una volta chiuse le costole. Gli strati muscolari e la pelle devono essere chiusi ermeticamente per evitare lo sviluppo di pneumotorace da tensione.
Ottenere ABG Infine, quando si ottengono gli ABG, è importante prima bloccare l'ilo destro in modo che la misurazione dell'ABG rifletta solo la funzione polmonare sinistra22,23. Senza il morsetto ilare destro, il polmone destro normalmente ventilato compenserà ampiamente il polmone sinistro ischemico danneggiato e le misurazioni dell'ABG appariranno normali.
In sintesi, la tecnica del clamp ilare che descriviamo sopra è uno strumento prezioso per lo studio del trapianto di polmone e, soprattutto, può isolare lo studio dell'IRI caldo senza l'introduzione di allogenicità, traumi chirurgici correlati all'anastomosi o conservazione ischemica fredda. In particolare, questa tecnica descritta di clampaggio ilare è facilmente insegnabile e ampiamente adottabile e può portare a risultati affidabili e riproducibili.

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Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

L'IRI durante il trapianto d'organo è un importante fattore di rischio per la disfunzione primaria del trapianto e per i successivi episodi di rigetto del trapianto 1,2. Durante il trapianto, il tempo di ischemia calda è definito come il periodo di tempo che intercorre tra il cross-clamp dell'aorta del donatore e l'inizio della perfusione fredda e tra la rimozione dell'organo dal ghiaccio all'impianto dell'organo. Il tempo di conservazione a freddo è definito come il periodo di tempo che intercorre tra l'inizio della perfusione fredda e la rimozione dell'organo dal ghiaccio3. L'ischemia calda è più deleteria per la funzione d'organo successiva rispetto all'ischemia fredda 4,5,6 e i suoi meccanismi sottostanti giustificano ulteriori studi in modelli preclinici. Inoltre, il trapianto di organi da donazione dopo morte cardiaca (DCD) è associato a tempi ischemici caldi più lunghi rispetto alla donazione tradizionale dopo morte cerebrale (DBD)7. Sebbene l'uso di donatori di DCD possa espandere il pool di donatori e aumentare l'utilizzo polmonare, sono necessari ulteriori studi preclinici per valutare gli effetti dell'ischemia calda sulla funzione polmonare post-trapianto. Di seguito, descriviamo un modello di IRI caldo nei topi tramite il morsetto ilare polmonare sinistro.
Diversi modelli animali di clampaggio ilare polmonare sono stati sviluppati e adattati negli ultimi anni e possono includere l'uso di un clamp microvascolare atraumatico 8,9,10,11,12,13, un laccio emostatico di Rumel14,15 o una legatura della sutura16 come il morsetto ilare. Il punto cruciale del morsetto ilare è che deve essere reversibile e causare danni minimi o nulli alle strutture ilari in modo da poter ottenere la riperfusione. Qui, descriviamo la nostra tecnica di clamp ilare nei topi che prevede la legatura reversibile della sutura dell'ilo polmonare sinistro con un nodo scorsoio. Questo metodo occlude l'afflusso arterioso polmonare, il deflusso venoso e il flusso d'aria dentro e fuori il bronco principale. Il vantaggio principale di un nodo scorsoio rispetto a un morsetto vascolare, una clip o un laccio emostatico è che il torace può essere chiuso durante periodi prolungati di ischemia, riducendo così al minimo la perdita di liquidi insensibili e calore nel topo. Forniamo un protocollo per ottenere misurazioni affidabili dei gas nel sangue arterioso (ABG) e per misurare lo stravaso cellulare dopo il clampaggio ilare.
Questa tecnica di clamp ilare occupa un posto importante nello studio più ampio del trapianto di polmone. Rispetto ai piccoli modelli animali di trapianto di polmone ortotopico, la tecnica del clamp ilare può isolare gli effetti dell'IRI senza l'aggiunta di traumi anastomotici chirurgici o di allogenicità17. Inoltre, la tecnica del morsetto ilare può essere padroneggiata più facilmente e rapidamente rispetto al trapianto di polmone di topo. Infatti, utilizzando tecniche di clamp ilare, nell'ultimo decennio sono stati identificati diversi meccanismi importanti nella patogenesi dell'IRI, come il TLR4, la NADPH ossidasi e il recettore 14,18,19,20 dell'adenosina A2A. Nel seguente protocollo, presentiamo un metodo affidabile, insegnabile e riproducibile di clampaggio ilare come strumento per lo studio dell'IRI polmonare.

<table><tbody><tr><td><forte>Farmaci</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% soluzione di iodio povidone</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Per disinfettante</td></tr><tr><td>Buprenorfina 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Per il controllo del dolore</td></tr><tr><td>Carprofene</td><td>Cronus Pharma</td><td>NDC 69043-027-18</td><td>Per il controllo del dolore</td></tr><tr><td>Eparina 1000 unità/mL</td><td>Sagent</td><td>NDC 25021-404-01</td><td>Per ottenere sangue arterioso</td></tr><tr><td>Isoflurano 1%-1,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato 100 mg/mL</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Puralube Vet unguento oculare</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Per prevenire la disidratazione oculare</td></tr><tr><td>Xilazina 20 mg/mL</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Per il controllo del dolore</td></tr><tr><td>Strumenti e strumenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Argent High Temp Penna cautoria a punta fine</td><td>McKesson</td><td>231</td><td>Per coagulare i vasi sanguigni</td></tr><tr><td>Pinza per zanzare curva</td><td>Strumenti di scienza</td><td>13009-12</td><td>Per procedura chirurgica</td></tr><tr><td>Pinze curve fini</td><td>Strumenti di scienza</td><td>11274-20</td><td>Per chirurgia procedura</td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>15040-11</td><td>Per la procedura chirurgica</td></tr><tr><td>Impostazione del morsetto per intubazione</td> Strumenti per le <td>scienze</td><td>18374-44, 18144-30</td><td>Per tenere il mouse verticalmente per la lingua durante l'intubazione. Vedere la Figura 1A supplementare.</td></tr><tr><td>Divaricatori magnetici per costole</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-01, 18200-10</td><td>Per la retrazione della toracotomia. Il fissatore magnetico e il divaricatore devono essere collegati da un tubo in micro lattice sottostante.</td></tr><tr><td>Fibra ottica in plastica di grado ottico senza rivestimento, 500&mu; m</td><td>Edmund Optics</td><td>02-532</td><td>Per realizzare l'introduttore per il tubo endotracheale. Vedere la Figura 1B supplementare. Una lunghezza di 1,5 pollici di questa fibra ottica dovrebbe avere un pezzo di nastro di seta fissato a un'estremità. Può quindi essere utilizzato come introduttore per il tubo endotracheale. L'estremità dell'introduttore dovrebbe essere leggermente curva.</td></tr><tr><td>Power Pro Ultra clipper</td><td>Oster</td><td>078400-020-001</td><td>Per tagliare i capelli</td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14370-22</td><td>Per procedura chirurgica</td></tr><tr><td>Termoforo per piccoli animali</td><td>K& H Pet Products</td><td>Thermo-Peep Pad</td><td>riscaldato per mantenere la normotermia</td></tr><tr><td>Ventilatore per piccoli animali</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>55-0000</td><td>Per la ventilazione (TV 0,35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)</td></tr><tr><td>Tubo in gomma di micro lattice Spearit (1/8 di pollice di diametro esterno, 1/16 di pollice di diametro interno)</td><td>Amazon.com</td><td>https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1</td><td>Per la retrazione di toracotomia</td></tr><tr><td>Stat Profile Prime Critical Care Analizzatore di gas ematici Nova</td><td>Biomedical</td><td>https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB&nbsp; &nbsp;</td><td>Per la retrazione della toracotomia</td></tr><tr><td>Morsetto dritto</td><td>Fine Science Tools</td><td>13008-12</td><td>Per interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Pinza dritta</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td>Per interventi chirurgici</td></tr><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>non più prodotto</td><td>Per intubazione e interventi chirurgici; si consiglia la sostituzione con microscopi operatori Leica</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac12; cc siringa con &frac12; ago da 29 G</td><td>McKesson</td><td>942665</td><td>Per l'iniezione di ketamina/xilazina per via intraperitoneale</td></tr><tr><td>&frac12; ago da 31 pollici su una siringa di tubercolina da 1 cc</td><td>McKesson</td><td>16-SNT1C2705</td><td>Per l'aspirazione di sangue arterioso dal ventricolo sinistro</td></tr><tr><td>Catetere IV da 1 pollice 20G</td><td>Terumo</td><td>SROX2025CA</td><td>Per tubo endotracheale (ETT)</td></tr><tr><td>Seta da 1 pollice nastro</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Per fissare l'ETT al naso e per fissare gli arti</td></tr><tr><td>Siringa da 3/10 cc con ago da 5/16 pollici 31G</td><td>McKesson</td><td>102-SN310C31516P</td><td>Per l'iniezione di anticorpi nella vena cava inferiore</td></tr><tr><td>6-0 sutura monofilamento su un ago P-10</td><td>McKesson</td><td>S697GX</td><td>Per la chiusura della toracotomia, dello strato muscolare e della pelle</td></tr><tr><td>Cravatta di seta 6-0</td><td>Surgical Specialties Look</td><td>SP102</td><td>Per fare nodo scorsoio per morsetto ilare</td></tr><tr><td>Applicatori appuntiti con punta di cotone</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Per manipolare il polmone e per la dissezione smussata</td></tr></tbody></table>

modello murino di morsetto ilare polmonare sinistro di lesione da riperfusione da ischemia polmonare

Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury

Il danno da ischemia e riperfusione (IRI) durante il trapianto di polmone è un importante fattore di rischio per le complicanze post-trapianto, tra cui la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto acuto e cronico e la mortalità. Gli sforzi per studiare le basi dell'IRI hanno portato allo sviluppo di un modello murino affidabile e riproducibile di clamping ilare del polmone sinistro. Questo modello prevede una procedura chirurgica eseguita in un topo anestetizzato e intubato. Viene eseguita una toracotomia sinistra, seguita da un'attenta mobilizzazione polmonare e dalla dissezione dell'ilo polmonare sinistro. Il morsetto ilare comporta la legatura reversibile della sutura dell'ilo polmonare con un nodo scorsoio, che interrompe l'afflusso arterioso, il deflusso venoso e il flusso d'aria attraverso il bronco principale sinistro. La riperfusione viene avviata con un'attenta rimozione della sutura. Il nostro laboratorio utilizza 30 minuti di ischemia e 1 ora di riperfusione per il modello sperimentale nelle attuali indagini. Tuttavia, questi periodi di tempo possono essere modificati a seconda della specifica domanda sperimentale. Immediatamente prima del sacrificio, l'emogasanalisi arteriosa può essere prelevata dal ventricolo sinistro dopo un periodo di 4 minuti di clampaggio ilare destro per garantire che i valori di PaO2 ottenuti siano attribuiti al solo polmone sinistro danneggiato. Descriviamo anche un metodo per misurare lo stravaso cellulare con la citometria a flusso, che prevede l'iniezione endovenosa di un anticorpo marcato con fluorocromo specifico per le cellule da studiare prima del sacrificio. Il polmone sinistro può quindi essere prelevato per la citometria a flusso, congelato o fissato, l'immunoistochimica inclusa in paraffina e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Questa tecnica di clamp ilare consente uno studio dettagliato dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dell'IRI. I risultati rappresentativi rivelano una diminuzione dell'ossigenazione del polmone sinistro e l'evidenza istologica di danno polmonare a seguito di clamping ilare. Questa tecnica può essere facilmente appresa e riprodotta da personale con e senza esperienza microchirurgica, portando a risultati affidabili e coerenti e fungendo da modello ampiamente adottabile per lo studio dell'IRI polmonare.

Dopo il clamping ilare sinistro, la pressione parziale di ossigenazione nel sangue arterioso (PaO2) attribuita al polmone sinistro è di ~100 mmHg, significativamente più bassa rispetto ai ~500 mmHg dopo la toracotomia fittizia (Figura 7A, n=6-7). Da notare che sono state eseguite toracotomie fittizie in topi B6 con misurazione ABG presa dopo 4 minuti di clamping ilare destro, che rappresentano valori attribuiti al solo polmone sinistro. La colorazione H&amp;E del polmone sinistro con clamping ilare ha dimostrato l'infiltrazione di cellule infiammatorie che riempiono le vie aeree e l'ingorgo dei vasi sanguigni con eritrociti, mentre questi risultati sono assenti nel polmone sinistro naive (Figura 7B, n=2). Questi risultati dimostrano l'immediato danno tissutale e l'infiltrazione cellulare dopo un periodo di ischemia e riperfusione.
Come discusso nella fase 6, i neutrofili intravascolari e interstiziali possono essere differenziati con l'iniezione endovenosa di anticorpi anti-Ly6G marcati con FITC 5 minuti prima del sacrificio, seguita dalla marcatura di tutti i neutrofili con anticorpi APC-Ly6G18,24. Grafici rappresentativi mostrano che ~75% dei neutrofili sono intravascolari (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) e ~25% sono interstiziali (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) dopo il clampaggio ilare del polmone sinistro (Figura 7C, n=4). Questi risultati dimostrano un modo affidabile per valutare lo stravaso dei neutrofili e possono essere adattati ad altri tipi di cellule a seconda degli anticorpi utilizzati (ad esempio, anti-Ly6C per i monociti, anti-CD19 per le cellule B). Questa tecnica è utile per lo studio della dinamica cellulare in seguito a IRI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2.jpg"> Figura 1: Intubazione del topo. (A) Topo con torace sinistro e addome rasati. (B) Tubo endotracheale collegato al tubo del ventilatore. (C) Una volta confermata l'intubazione, fissare il tubo circonferenzialmente al naso del topo. (D) Topo intubato con tubo di afflusso e deflusso da e verso il ventilatore per piccoli animali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig1v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig02.jpg"> Figura 2: Toracotomia sinistra. (A) Incisione cutanea sul 4°spazio intercostale (ICS). (B) Strati muscolari divisi nel 4°spazio intercostale . (C) Praticando una piccola incisione appena soprala 5a costola. (D) Estensione dell'incisione anteriormente e posteriormente nel 4° ICS . (E) Polmone visualizzato nel 4° ICS. (F-G) Divaricatori di costole posizionati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig03.jpg"> Figura 3: Morsetto ilare sinistro. (A) Polmone sinistro mobilizzato con tamponi di cotone. (B) Legamento polmonare inferiore (IPL) visualizzato. (C) Con il polmone sinistro capovolto anteriormente, la fascetta di seta viene posizionata posteriormente all'ilo. (D) Con la sinistra capovolta posteriormente sulla cravatta di seta, viene visualizzato l'ilo anteriore. (E) Legatura strumentale del nodo scorsoio sopra l'ilo sinistro. (F) Slipknot sull'ilo. (G) Con l'occlusione manuale del deflusso, il polmone sinistro non si gonfia, indicando un corretto clampaggio ilare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig04.jpg"> Figura 4: Rilascio del morsetto ilare sinistro e chiusura del torace sinistro. (A) Con il nodo scorsoio rilasciato, il polmone sinistro viene rigonfiato. (B) Chiusura delle costole con un morso appena soprala 4a costola e (C) un morso appena soprala 6a costola. (D-E) Petto chiuso con un punto legato alla fine dell'inspirazione. (F) Chiusura della pelle con punti interrotti (dopo la chiusura dello strato muscolare con punto corrente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig05.jpg"> Figura 5: Laparotomia, toracotomia bilaterale a conchiglia e prelievo di sangue arterioso. (A) Topo regolato in posizione supina. (B) Incisione cutanea praticata sulla linea mediana dell'addome. (C) Laparotomia che si estende dallo xifoideo al pube, con estensione a sinistra e a destra lungo la costola più inferiore. (D-E) Apertura del diaframma per entrare nella cavità toracica, con estensione dell'incisione del diaframma a sinistra e a destra lungo la costola più inferiore (linea tratteggiata). (F) Toracotomia bilaterale a conchiglia con incisioni nelle linee ascellari anteriori (linea tratteggiata) verso l'apice del torace. (G) Lobo accessorio del polmone destro che si estende nel torace sinistro posteriormente alla vena cava inferiore. (H) Lobo accessorio mobilizzato e riportato al torace destro. (I) Aspirazione di sangue arterioso dal ventricolo sinistro (riquadro: differenziale di colore tra ventricoli destro e sinistro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig06.jpg"> Figura 6: Iniezione endovenosa nella vena cava inferiore. (A) Rotazione viscerale mediale destra per esporre la vena cava inferiore (IVC). (B) Iniezione di soluzione in IVC. (C) Applicare pressione sull'IVC per raggiungere l'emostasi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66232/66232fig07.jpg"> Figura 7: Risultati rappresentativi dell'ossigenazione polmonare, dell'istologia e dello stravaso dei neutrofili dopo clamp ilare sinistro. (A) Pressione parziale dell'ossigeno nel sangue arterioso di un topo C57BL/6 sottoposto a toracotomia fittizia rispetto a clamp ilare. I risultati sono presentati come media ± SEM, n=6-7. p calcolati mediante test U di Mann-Whitney. **p &lt;0,01. (B) Colorazione H&amp;E di una sezione polmonare fissata in formalina e inclusa in paraffina di un topo C57BL/6 sottoposto a toracotomia fittizia rispetto a morsetto ilare. La barra della scala rappresenta 250 μm. (C) Figura rappresentativa della distribuzione dei neutrofili Ly6G+ intravascolari (APC-Ly6G+FITC-Ly6G+) rispetto a quelli extravascolari (APC-Ly6G+FITC-Ly6G-) in un topo C57BL/6 che segue il morsetto ilare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/66232fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Introduttore per tubo endotracheale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66232/Supplemental_Figure_1_updated.pdf" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Il protocollo delinea un metodo fattibile, affidabile e riproducibile di clampaggio ilare polmonare sinistro che può essere utilizzato per studiare il danno da ischemia-riperfusione polmonare in modelli murini.

Modello murino di morsetto ilare polmonare sinistro di lesione da riperfusione da ischemia polmonare

Ischemia reperfusion injury (IRI) during lung transplantation is a major risk factor for post-transplant complications, including primary graft ...

Siamo interessati a studiare gli effetti del danno da ischemia-riperfusione sugli esiti dopo il trapianto di polmone con l'obiettivo di comprendere i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti. I neutrofili che entrano nel polmone contribuiscono al danno da ischemia-riperfusione, o IRI. Recentemente abbiamo scoperto che le cellule B precedono i neutrofili nell'ingresso nel polmone e svolgono un ruolo nel reclutamento dei neutrofili dopo l'IRI.Il trapianto di polmone sinistro nel topo è tecnicamente impegnativo e richiede una formazione dedicata a tempo pieno per diversi mesi per ottenere risultati coerenti. Inoltre, introduce allergenicità e trauma anastomotico chirurgico. Pertanto, abbiamo bisogno di una tecnica più accessibile che possa isolare lo studio del danno da ischemia-riperfusione.Utilizzando il nostro modello di clamp ilare, abbiamo scoperto che le cellule B entrano nel polmone precocemente dopo il danno da ischemia-riperfusione e reclutano monociti classici in un recettore delle cellule B in modo dipendente da TLR4. Ciò si traduce in un aumento dello stravaso dei neutrofili nel polmone. Il nostro protocollo prevede la legatura reversibile della sutura dell'ilo polmonare sinistro con un nodo scorsoio.La natura flessibile e discreta della sutura consente la chiusura del torace, utile per studiare periodi più lunghi di ischemia calda, poiché la chiusura del torace riduce al minimo il calore e le perdite di liquidi insensibili nel topo.

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Trauma chirurgico induce una risposta infiammatoria. Citochine e ligandi endogeni sono noti per modulare dimensione miocardio a seguito di ischemia e riperfusione. Vi presentiamo una versione modificata del chiuso petto modello di ischemia e di riperfusione murino con pesi appesi per minimizzare gli effetti di toracotomia.

A Murine chiuso del torace modello di ischemia miocardica e riperfusione

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Un modello murino di ischemia miocardica e riperfusione lesioni da legatura della arteria discendente anteriore sinistra

Un modello di morsetto ilare unico fegato di ratto è stato sviluppato per studiare l'impatto di molecole farmacologiche nel migliorare danno da ischemia-riperfusione. Questo modello include incannulazione diretta della fornitura portale per il segmento epatico ischemico tramite un ramo della vena porta, consentendo la consegna epatica diretta.

Metodo di consegna diretta segmentale intra-epatico utilizzando un modello di fegato di ratto Hilar morsetto

Qui descriviamo una procedura chirurgica che mostra come ottenere una legatura permanente dell'arteria coronaria discendente sinistra-anteriore nei topi. Questo modello è di grande rilevanza per studiare la fisiofisiologia dell'infarto miocardico e i processi biologici concomitanti.

Modello di infarto miocardico Murine utilizzando la legatura permanente dell'arteria coronaria discendente anteriore sinistra

Descriviamo in dettaglio un modello tumorale del cancro colorettale clinicamente rilevante (CRLM) e l'influenza della reperfusione di ischemia epatica (I/R) nella crescita tumorale e nella metastasi. Questo modello può aiutare a comprendere meglio i meccanismi alla base della promozione metastatica del fegato indotta da un intervento chirurgico.

Modello Murine dei tumori metastatici del fegato nell'impostazione della lesione alla riperfusione dell'ischemia

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Modello di roditore migliorato di ischemia miocardica e danno da riperfusione

Un modello chirurgico murino per creare lesioni da ischemia polmonare sinistra (IR) mantenendo la ventilazione ed evitando l'ipossia.

Un modello murino di intubazione orotracheale e chirurgia ventilata di ischemia polmonare riperfusione

Presentato qui è una procedura chirurgica per la legatura permanente dell'arteria coronaria sinistra nei topi. Questo modello può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia e la risposta infiammatoria associata dopo infarto miocardico.

Legatura coronaria sinistra: un modello chirurgico murino di infarto miocardico

Questo studio descrive un modello di danno polmonare acuto a seguito di ischemia-riperfusione viscerale durante il cross-clampaggio aortico sopraceliaco tramite laparotomia nei ratti. Consente di studiare gli effetti clinici e biologici del clampaggio aortico, nonché l'impatto dell'ischemia-riperfusione sugli organi sottostanti e sulle lesioni polmonari remote.

Un modello di danno polmonare acuto a seguito di ischemia-riperfusione viscerale mediante clampaggio della croce aortica sopraceliaca nei ratti

Descriviamo modelli di danno renale da ischemia-riperfusione indotta moderata e grave in cui i topi sottoposti unilaterale peduncolo renale serraggio seguita da nefrectomia controlaterale simultaneo o ritardato, rispettivamente. Questi modelli sempre danno luogo a disfunzione renale e fibrosi post-infortunio, ma la gravità delle lesioni e la sopravvivenza dipendono da sfondo, età e attrezzature chirurgiche mouse.

Ischemia-riperfusione Modello di danno renale acuta e post Infortunio fibrosi nei topi

Impara il protocollo di clamping ilare polmonare sinistro nei modelli murini per studiare la lesione da ischemia-riperfusione. Questo metodo riproducibile aiuta a comprendere i meccanismi cellulari e molecolari del danno polmonare.

Modello murino di morsetto ilare polmonare sinistro di lesione da riperfusione da ischemia polmonare

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