Name: Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 4 min 39 s
Description: Impara l'isolamento delle cellule gliali di Müller retiniche primarie di topo per studiare la biologia cellulare e le malattie retiniche. Questo metodo consente di ottenere colture pure per ricerche sulle patologie oculari.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Eye Institute (NEI), dal fondo R01 EY029751-04 del National Eye Institute (NEI). Ringraziamo la Dott.ssa Sylvia B. Smith in quanto questo protocollo è stato modificato in base al suo protocollo di isolamento cellulare di Müller.

Tutti gli esperimenti con gli animali sono conformi alla dichiarazione ARVO per l'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva e sono stati eseguiti seguendo il nostro protocollo sugli animali approvato dall'Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) e dalle politiche dell'Università di Oakland (numero di protocollo 2022-1160)
1. Preparazione dei terreni e della soluzione
<ol><li>Preparare la soluzione Müller cell eye integrando il Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, dettagli nella tabella dei materiali) con penicillina/streptomicina alla diluizione di 1:1000. Ad esempio, per 10 ml di DMEM, aggiungere 10 μl di penicillina/streptomicina. NOTA: Questo è un semplice terreno di coltura senza siero preparato. Inoltre, riscaldare l'intero terreno in un bagno d'acqua a 37 °C prima di utilizzarlo per il lavoro di coltura cellulare.</li>
	<li>Preparare un terreno di coltura cellulare Müller primario completo integrando DMEM con il 10% di siero fetale bovino (FBS, inattivato termicamente) e l'1% di penicillina/streptomicina. Ad esempio (500 ml di terreno DMEM + 50 ml di FBS + 5 ml di penicillina/streptomicina).</li>
	<li>Preparare una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,05% con collagenasi IV a una concentrazione di 200 U/mL (la tripsina-EDTA viene utilizzata per sciogliere la quantità calcolata di collagenasi IV polvere per raggiungere la concentrazione necessaria).</li>
</ol>2. Enucleazione
<ol><li>Sopprimere eticamente il topo utilizzando l'inalazione di CO2 seguendo le linee guida IACUC.<ol><li>In breve, posizionare l'animale (o gli animali) nella camera CO2 per introdurre il 100% di CO2 a una velocità di riempimento del 30-70% del volume / min della camera con CO2 per raggiungere l'obiettivo di una rapida perdita di coscienza entro 2-3 minuti con il minimo disagio per i topi.</li>
		<li>Poiché i topi sono in giovane età (~ 10 giorni), eseguire la lussazione cervicale come metodo secondario per garantire una corretta eutanasia.</li>
	</ol></li>
	<li>Dopo aver sterilizzato l'area di lavoro con etanolo al 70%, posizionare il mouse su un sottopiede sterile.</li>
	<li>Estrarre gli occhi posizionando le braccia delle pinzette nella parte posteriore dell'occhio, tirando delicatamente dall'area orbitale ed enucleando gli occhi applicando pressione con una pinzetta stile 5/45 sull'area orbitale per causare la proptosi. NOTA: Sterilizzare gli strumenti di dissezione con etanolo al 70% seguito da soluzione salina tampone fosfato prima della dissezione.</li>
	<li>Assicurarsi che il nervo ottico sia ancora collegato all'occhio enucleando lentamente l'occhio. Assicurati di tirare il nervo ottico (identificato visivamente come un cordone bianco) dietro l'occhio. NOTA: Questo passaggio non deve essere eseguito al microscopio e può essere eseguito su un banco sterilizzato.</li>
</ol>3. Trattamento degli occhi enucleati
<ol><li>Coprire una provetta da centrifuga da 15 mL con un foglio di alluminio e riempire la provetta con 10 mL della soluzione oculare cellulare Müller.</li>
	<li>Porre gli occhi sezionati nella provetta da 15 mL contenente la soluzione per l'occhio cellulare di Müller e lasciarli riposare per una notte, o circa 18 ore, a temperatura ambiente.</li>
	<li>Dopo 18 ore, decantare la soluzione oculare e sciacquare brevemente gli occhi con 2-3 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) riscaldata (37 °C).</li>
	<li>Decantare il PBS e spostare gli occhi su una piastra di Petri da 100 mm contenente 10 ml di soluzione di tripsina. (preparato al punto 1.3). NOTA: La tripsina viene utilizzata su tutto l'occhio enucleato, agendo come agente dissociativo per facilitare la separazione cellulare dagli strati retinici durante la dissezione. La retina sezionata ha molte cellule, comprese le cellule RPE, che sono appiccicose e hanno maggiori probabilità di contaminare la coltura cellulare di Müller14. L'esame microscopico ha dimostrato chiaramente che dopo 5 giorni di isolamento (durante il primo cambio di terreno), le cellule RPE si sono staccate dalla piastra e sono morte13. Il terreno utilizzato per l'isolamento dell'RPE è il DMEM/F-12, con una composizione diversa rispetto al DMEM (utilizzato nell'isolamento delle cellule di Müller), contenente piruvato di sodio e basso contenuto di glucosio.</li>
	<li>Mettere la capsula in un'incubatrice e incubare per 1,5-2 ore a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, trasferire gli occhi in una piastra di Petri da 60 mm contenente circa 5 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo.</li>
</ol>4. Dissezione
NOTA: Questa procedura deve essere eseguita all'interno dell'ambiente sterile della cappa di coltura. Pertanto, è essenziale sterilizzare accuratamente le superfici della cappa con alcol al 70%, insieme a tutti gli strumenti e al microscopio di dissezione. Vale la pena notare che il video è stato registrato all'esterno del cofano per una migliore visibilità e una dimostrazione più chiara.
<ol><li>Metti un piccolo pezzo di tessuto sterilizzato da laboratorio nel piatto per aiutare a stabilizzare gli occhi durante la dissezione. Posizionare gli occhi sotto un microscopio da dissezione per iniziare la dissezione. NOTA: L'uso di tessuto di laboratorio facilita la manovra degli occhi in un piatto pieno di liquido (terreno completo), garantendo una dissezione precisa.</li>
	<li>Usa le forbici Vannas e le pinzette in stile M5S per rimuovere il tessuto connettivo, i muscoli extraoculari e il nervo ottico.<ol><li>Afferra l'occhio con una pinzetta stile M5S e fai un'incisione nella sezione ora serrata con le forbici Vannas o l'ago di una siringa. NOTA: C'è una linea circolare azzurra tra la parte anteriore e quella posteriore dell'occhio chiamata ora serrata, che può essere utilizzata come punto di riferimento per una direzione accurata durante la dissezione.</li>
		<li>Afferrare l'incisione con una pinzetta stile M5S e tirare o strappare la cornea dalla parte posteriore dell'occhio. Tirare in piccoli incrementi per garantire che l'integrità della retina rimanga intatta. NOTA: Questi passaggi servono a rimuovere la parte anteriore dell'occhio (cornea, iride e cristallino) dalla parte posteriore della conchiglia oculare (retine neurali e pigmentate).</li>
		<li>Per mantenere l'integrità degli strati retinici, tirare delicatamente e rimuovere l'epitelio pigmentato retinico dalla retina neurale. La retina neurale dovrebbe essere priva di macchie nere per garantire il più possibile la purezza dell'isolamento, poiché lo strato di RPE è solitamente appiccicoso e attaccato alla retina neuronale.</li>
		<li>Tagliare la retina neurale sezionata in piccoli pezzi prima di raccoglierla in una piastra per garantire una diffusione omogenea delle cellule sulla piastra.</li>
	</ol></li>
	<li>Placcare le retine neurali in un pallone T25 contenente 4 mL di terreno di crescita delle cellule Müller primarie complete.</li>
	<li>Infine, porre il matraccio in un incubatore e incubare a 37 °C e 5% di CO2.</li>
</ol>5. Coltura di cellule gliali primarie di Müller
<ol><li>Non spostare il pallone per 3-5 giorni per favorire la crescita cellulare.</li>
	<li>Cambiare il terreno dopo il quinto giorno e successivamente a giorni alterni fino a quando le celle non sono confluenti al 90%.</li>
</ol>6. Passaggio di cellule gliali primarie di Müller
<ol><li>Aspirare il terreno di coltura cellulare Müller, seguito da 2 mL di lavaggio in PBS, e aspirare il PBS. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% (1x), o quanto basta per coprire la piastra.</li>
	<li>Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Assicurarsi che le cellule siano staccate dalla piastra al microscopio. Quindi, raccogliere la sospensione cellulare e aggiungere 4 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo preriscaldato (37 °C) (preparato nella fase 1.2) nella provetta di raccolta.</li>
	<li>Centrifugare per 7 min a 300 x g. Dopo aver aspirato il surnatante, risospendere il pellet in 10 mL di terreno di coltura cellulare Müller primario completo. Poiché il numero di cellule può variare in base al numero di occhi sezionati, quindi, è meglio contare le cellule prima della semina e dell'incubazione. La densità di semina consigliata è di 3,0 x 106 celle in un pallone T75. NOTA: Le celle possono essere passate fino a 4-5 volte. Tuttavia, i risultati più coerenti dell'esperimento si trovano dopo 1-2 passaggi.</li>
</ol>7. Immunofluorescenza
NOTA: Utilizzare il protocollo di immunofluorescenza per colorare e convalidare la specificità delle cellule di Müller. Ecco una breve panoramica del protocollo di immunofluorescenza. Questo passaggio viene eseguito dopo il primo passaggio12.
<ol><li>Seminare le cellule in un vetrino per camera di coltura cellulare (30.000 cellule per pozzetto per un vetrino da 8 pozzetti).</li>
	<li>Coltura delle cellule isolate per 24-48 ore in un terreno di coltura cellulare Müller completo (preparato nella fase 1.2) a 37 °C e 5% di CO2.</li>
	<li>Aspirare il terreno e lavare il vetrino della camera con 250-300 μl di 1x PBS su ciascun pozzetto quando le celle sono confluenti all'80-90%.</li>
	<li>Fissare il vetrino per 10-15 minuti in 250-300 μl di paraformaldeide al 4% su ciascun pozzetto, quindi lavare con PBS/TX-100 (5 minuti ciascuno/3x).</li>
	<li>Aggiungere il tampone di blocco per 1 ora a 37 °C (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Aspirare la soluzione bloccante, quindi aggiungere gli anticorpi primari specifici per le cellule di Müller per confermare la purezza delle cellule isolate utilizzando glutammina sintetasi e vimentina 5,12. Incubare per 3 ore a 37 °C (utilizzando una concentrazione di anticorpi di 1:100-1:200 in tampone bloccante in un volume di 150-200 μL/vetrino). Lavare il vetrino con lavaggi PBS/TX-100 (5 e 10 minuti ciascuno). NOTA: Questi anticorpi sono stati scelti in quanto sono segni distintivi per identificare le cellule di Müller e garantire il successo e la purezza della coltura cellulare di Müller.</li>
	<li>Aggiungere l'anticorpo secondario (con una concentrazione di anticorpi compresa tra 1:1000 in tampone bloccante in un vetrino da 150-200 μl/vetrino) e incubare per 1 ora a 37 °C. Quindi, lavare con PBS/Triton X-100, tre volte (5-10 minuti ciascuna).</li>
	<li>Applicare una goccia di terreno di montaggio DAPI per etichettare i nuclei prima di coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti. Evitare la formazione di bolle d'aria quando si posiziona il vetrino coprioggetti.</li>
	<li>Utilizzare un microscopio a fluorescenza per controllare il vetrino e acquisire le immagini (vedi Tabella dei materiali). NOTA: le celle sono localizzate con DAPI a ex/em 359/461 con ingrandimento 10x per localizzare le celle; Un ingrandimento più elevato può catturare le cellule. Altre lunghezze d'onda dipenderebbero dal colore scelto. Colore verde (GFP) - ex/em 488/510. Colore rosso (Cy3) - ex/em 555/569.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare che siano rilevanti per il contenuto di questo articolo.

L'isolamento dell'epitelio pigmentato retinico primario (RPE) dai topi è stato precedentemente documentato dal nostro laboratorio. Questo manoscritto descrive un protocollo dimostrativo dettagliato per l'isolamento delle cellule primarie di Müller. Questa procedura prevede l'enucleazione, il trattamento, la dissezione, la raccolta, la semina, la coltura e la caratterizzazione delle cellule di Müller isolate dagli occhi di topo. Si basa su un protocollo precedentemente riuscito trovato in pubblicazioni precedenti e sul nostro protocollo modificato che abbiamo utilizzato in una recente pubblicazione1 2,13. Sebbene i passaggi siano semplici, il successo dell'isolamento delle cellule Müller richiede il rispetto di restrizioni specifiche e requisiti essenziali. Dopo numerosi tentativi ed errori di ottimizzare questo protocollo, sono stati identificati diversi fattori che ne hanno influenzato il successo.
L'età ideale del topo, come osservato nei nostri esperimenti, è risultata essere compresa tra 5-11 giorni per far crescere le cellule isolate fino a quattro passaggi. La cultura è influenzata anche dal numero di occhi isolati e acculturati. Per l'isolamento singolo, sono necessari almeno due occhi per ottenere un numero sufficiente di cellule per poter crescere e moltiplicarsi. Un altro aspetto importante è la durata tra l'enucleazione e la placcatura; Pertanto, questo passaggio deve essere eseguito in tempi relativamente brevi. È stato osservato che la manipolazione prolungata del tessuto oculare ha un effetto dannoso sulla capacità delle cellule di aderire al pallone e moltiplicarsi. Per assicurarsi che la vicinanza delle cellule isolate sia sufficientemente vicina da favorire la proliferazione, si consiglia di utilizzare un pallone T25. Una volta effettuato il primo passaggio, le celle possono essere placcate su un T75. Inoltre, le cellule non devono essere disturbate dopo l'isolamento e la semina rimuovendo il pallone di coltura tissutale dall'incubatore o cambiando il terreno per almeno 5 giorni. Infine, le cellule possono essere passate solo circa quattro volte prima che smettano di aderire. Sebbene questa procedura sia semplice e facile da eseguire, presenta alcune limitazioni tra cui l'età dei topi, il numero limitato di passaggi cellulari, ecc.
Non ci sono molti protocolli per l'isolamento delle cellule Müller, ma ci sono alcune differenze notevoli tra questo protocollo e i protocolli disponibili 5,14. In primo luogo, il tempo tra l'enucleazione e l'isolamento è significativamente diverso. Altri protocolli suggeriscono la dissezione subito dopo l'enucleazione, in genere entro 10 minuti. Mentre il protocollo attuale suggerisce un periodo di riposo di almeno 18 ore in quanto ciò ha fornito i migliori risultati per l'isolamento in questo protocollo. Un'altra differenza significativa tra questo protocollo e altri protocolli è il punto in cui gli occhi vengono trattati con enzimi. In questo protocollo, gli occhi vengono trattati prima che venga eseguita qualsiasi dissezione, anche prima della rimozione del tessuto connettivo e dei muscoli extraoculari. Mentre altri protocolli isolano la retina dall'occhio prima del trattamento enzimatico. Inoltre, anche la ricetta dell'enzima è diversa. In questo protocollo, la soluzione enzimatica è costituita da tripsina e collagenasi di tipo IV. In protocolli simili, la papaina e la DNasi sono utilizzate per la digestione dei tessuti. Inoltre, il recipiente di coltura è diverso, questo protocollo suggerisce la coltura su un T25 e poi su un T75 dopo il primo passaggio. Mentre altri protocolli utilizzano piastre di Petri o piastre a più pozzetti. Infine, questo protocollo suggerisce che il pallone non deve essere disturbato (per 5-7 giorni) per favorire la crescita cellulare. Mentre in altri protocolli, il cambio dei supporti viene eseguito dopo un giorno.

Le cellule di Müller (MC) sono le principali e più abbondanti cellule gliali presenti nel tessuto retinico. Sono i principali attori nel fornire integrità strutturale e funzioni metaboliche all'interno della retina1. La struttura strategica delle MC è distribuita su tutto lo spessore della retina, fornendo così supporto alla retina. Oltre alle loro proprietà simili a impalcature, hanno funzioni metaboliche per i neuroni retinici, fornendo loro substrati energetici, tra cui glucosio e lattato. Queste funzioni sono fondamentali per mantenere una sana funzione neuronale. È stato riportato che le MC compromesse contribuiscono a varie malattie della retina, tra cui la degenerazione maculare legata all'età, la retinopatia diabetica e il glaucoma 2,3. Le MC possono essere fonti cellulari endogene per la terapia rigenerativa nella retina1. Comprendono anche una parte significativa della retina e forti prove suggeriscono che in diverse specie, queste cellule possono essere stimolate a sostituire i neuroni mancanti2. Collaborano in modo benefico con i neuroni e le estremità delle cellule di Müller, ramificate coniche, disintegrano densamente i vasi sanguigni e collegano i componenti neurali della retina. Al fine di mantenere lo sviluppo neuronale e la plasticità neuronale, le cellule di Müller agiscono come un substrato morbido per i neuroni, proteggendoli dai traumi meccanici3. Inoltre, in circostanze patologiche, le cellule di Müller possono differenziarsi in progenitori neurali o cellule staminali che replicano o rigenerano i fotorecettori e i neuroni persi 2,3,4. Le cellule di Müller conservano le caratteristiche delle cellule staminali retiniche, inclusi diversi livelli di potenziale di autorinnovamento e differenziazione 5,6. La cellula gliale di Müller ha un significativo lignaggio retinico che produce fattori neurotrofici, assorbe e ricicla i neurotrasmettitori, tampona spazialmente gli ioni e mantiene la barriera emato-retinica per mantenere la retina in omeostasi 7,8,9. Ciò evidenzia il potenziale delle cellule di Müller come strumento promettente nelle terapie cellulari per il trattamento di malattie legate alla degenerazione retinica. Le cellule di Müller sono la glia primaria distribuita in tutta la retina, che si collega sia ai neuroni che ai vasi sanguigni. Svolgono un ruolo protettivo cruciale, fornendo un supporto strutturale e metabolico essenziale per mantenere la vitalità e la stabilità delle cellule retiniche. Purtroppo, in letteratura si trovano pochissimi protocolli per l'isolamento primario delle cellule di Müller dalla retina10,11.
Presentiamo un approccio avanzato per isolare e coltivare in modo affidabile le cellule primarie di Müller di topo. Questo protocollo è stato utilizzato nel nostro gruppo per isolare le cellule di Müller dai topi C57BL/6 wild-type e dai topi transgenici12,13. Per questo protocollo vengono utilizzati topi di età compresa tra 5 e 11 giorni, senza preferenze di sesso. Le celle sono state attraversate fino a 4 volte; tuttavia, a P4 smettono di aderire al pallone e diventa difficile coltivare una coltura sana. La coltura è spesso contaminata da cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), quindi le cellule devono essere fatte passare almeno una volta prima di eseguire ulteriori esperimenti sulla linea cellulare. Il passaggio consente un ulteriore isolamento dai contaminanti. Pertanto, il protocollo presentato offre un modo rapido ed efficace per isolare le cellule di Müller di topo, che possono quindi essere utilizzate come piattaforma affidabile per la ricerca di bersagli terapeutici e la valutazione di potenziali trattamenti per le malattie della retina14.

<table><tbody><tr><td>Becher : 100mL</td><td>KIMAX</td><td>14000</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004188</tr><tr><td>Pipette monouso a trasferimento graduato: 3,2 ml sterili</td><td></td><td>13-711-20</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1X)&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>11885084</td><td>Media per la crescita di M&uuml; celle di levare&nbsp;</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>gibco</td><td>26140079</td><td>Per terreni di coltura cellulare Muller completi</td></tr><tr><td>Glutammina sintasi</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>80636</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VISO 160i Incubatore a CO2</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Siringa Luer-Lok con ago collegato 21 G x 1 1/2 pollici, sterile, monouso, 3 mL</td><td>B-D</td><td></td><td></td>309577</tr><tr><td>Micro Centrifuga Provetta: 2 mL</td><td>Grainger</td><td>11L819</td><td></td></tr><tr><td>Penna Strep</td><td>gibco</td><td>15140-122</td><td>Per M&uuml completo; terreni di coltura cellulare</td></tr><tr><td>ller Phosphate Buffer salino (PBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>J62851. </td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta AP ad azione positiva, stile 5/45</td><td>Dumont</td><td>72703-DZ</td><td></td></tr><tr><td>forbici Iris Standard Dritta 11,5 cm</td><td>GARANA INDUSTRIES</td><td>2595</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga Sorvall St8</td><td>ThermoScientific</td><td>75007200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Stemi 305</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lama chirurgica, #11, acciaio inossidabile</td><td>Bard-Parker</td><td>371211</td><td></td></tr><tr><td>Piatto di coltura a sospensione 60 mm x 15 mm Piatto</td> di coltura <td>tissutale 430589</td><td></td><td>Corning</td></tr><tr><td>: 100x20 mm Tubi</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Tornado: 15 ml</td><td>Midsci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tornado Tubi: 50 ml Midsci</td><td></td><td>C50R</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette 5MS, 8,2 cm, dritte, 0,09x0,05 mm Punte</td><td>Dumont</td><td>501764</td><td></td></tr><tr><td>Pinzetta Azione positiva Stile 5, biologico, Dumostar, finitura lucida, 110 mm OAL</td><td>Microscopia elettronica Scienze Dumont</td><td>50-241-57</td><td></td></tr><tr><td>Sottocuscinetti, moderati: 23" x 36"</td> <td>McKesson</td><td>4033</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Forbici a molla - 2,5 mm Tagliente</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>MA5-11883</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioImager Z2</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Zen Blue 2.6</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento delle cellule primarie di müller gliali retiniche di topo

Isolation of Primary Mouse Retinal Glial M&#252;ller Cells

La principale cellula di supporto della retina è la cellula gliale retinica di Müller. Coprono l'intera superficie retinica e sono in prossimità sia dei vasi sanguigni retinici che dei neuroni retinici. A causa della loro crescita, le cellule di Müller svolgono diversi compiti cruciali in una retina sana, tra cui l'assorbimento e il riciclaggio di neurotrasmettitori, composti dell'acido retinoico e ioni (come il potassio K+). Oltre a regolare il flusso sanguigno e a mantenere la barriera emato-retinica, regolano anche il metabolismo e l'apporto di sostanze nutritive alla retina. In questo manoscritto viene presentata una procedura consolidata per l'isolamento delle cellule primarie di Müller di topo. Per comprendere meglio i processi molecolari sottostanti coinvolti nei vari modelli murini di disturbi oculari, l'isolamento delle cellule di Müller è un approccio eccellente. Questo manoscritto delinea una procedura dettagliata per l'isolamento delle cellule di Müller dai topi. Dall'enucleazione alla semina, l'intero processo dura circa poche ore. Per 5-7 giorni dopo la semina, il terreno non deve essere cambiato per consentire alle cellule isolate di crescere senza ostacoli. La caratterizzazione cellulare utilizzando la morfologia e i distinti marcatori di immunofluorescenza viene dopo nel processo. I passaggi massimi per le celle sono 3-4 volte.

Validazione della specificità, della purezza e della funzione barriera delle cellule di Müller isolate Per confermare la vitalità, la morfologia e le qualità distintive delle cellule di Müller isolate, le cellule sono state esaminate al microscopio ottico. Sono state registrate immagini P0 e P1 (Figura 1A). Per verificare la contaminazione delle cellule Müller isolate con le cellule RPE e confermarne la purezza, è stata eseguita la colorazione in immunofluorescenza (IF) utilizzando anticorpi specifici per il marcatore cellulare RPE, RPE65. Le cellule pigmentate della retina umana (ARPE-19) sono state utilizzate come controllo positivo. Le celle RPE colorate con RPE65 (rosso e blu per la colorazione nucleare) sono mostrate nella Figura 1B (pannello inferiore). Gli anticorpi specifici RPE65 non hanno colorato le cellule di Müller isolate (Figura 1B, pannello superiore). Il fatto che l'RPE65 abbia colorato le cellule ARPE-19 (rosso) e non abbia colorato le cellule isolate, indica che le cellule isolate non sono cellule RPE. La presenza di piruvato e basso glucosio nei terreni stabilisce condizioni sfavorevoli per la crescita delle cellule RPE. Di conseguenza, anche in caso di contaminazione delle cellule RPE, esse finiranno per staccarsi dal pallone.
Inoltre, per confermare l'identità delle cellule isolate, è stata utilizzata una colorazione in immunofluorescenza con cellule di Müller per marcatori specifici per le cellule di Müller per confermare il successo dell'isolamento delle cellule di Müller. È stata utilizzata la proteina del filamento intermedio del citoscheletro chiamata vimentina12,13. Inoltre, èstata utilizzata anche la glutammina sintetasi (GS), che catalizza la reazione di condensazione del glutammato e dell'ammoniaca per formare glutammina, come funzione chiave delle cellule di Müller gliali retiniche5.
Collettivamente, le cellule isolate sono risultate negative per RPE65 (rosso, Figura 1B), positive per vimentina (verde, Figura 1C) e GS (verde, Figura 1D). La colorazione IF conferma il successo dell'isolamento (purezza e specificità) delle cellule di Müller isolate. La Figura 1E, è un controllo negativo per vimentina (pannello superiore) e GS (pannello inferiore), che conferma la specificità degli anticorpi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66237/66237fig01.jpg"> Figura 1: Validazione dell'isolamento cellulare di Müller (purezza e specificità). (A) Immagine al microscopio ottico per passaggi: passaggio zero (P0) e (P1) morfologia. (B) Immunocolorazione RPE65 combinata con colorazione nucleare DAPI. (C) Immunocolorazione con vimentina con colorazione nucleare DAPI ad alto ingrandimento. (D) Immunocolorazione GS allo stesso alto ingrandimento. (E) controlli negativi per confermare la specificità della vimentina e della colorazione degli anticorpi GS. barra di scala = 300 μm, 300 μm, 50 μm, 20 μm, 20 μm, 50 μm, 50 μm, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66237/66237fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

The primary supporting cell of the retina is the retinal glial M&#252;ller cell. They cover the entire retinal surface and are in close proximity to both ...

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In questo video ci dimostra come isolare le cellule staminali della retina dalla epitelio ciliare dell'occhio del mouse e farle crescere in coltura per formare clonale sfere della retina. Le sfere che sono isolati possiedono le caratteristiche cardine delle cellule staminali: l'auto-rinnovamento e multipotenzialità.

Isolamento di cellule staminali della retina dalla Eye mouse

Questo video dimostra la coltura di cellule gliali di Müller (MG) isolate da retine di topo. Le retine sono dissociate in una sospensione unicellulare utilizzando enzimi digestivi. Le cellule vengono quindi coltivate in un terreno con un fattore di crescita che promuove la proliferazione delle cellule MG e la mortalità delle cellule neuronali. Le cellule neuronali morte vengono rimosse durante il passaggio e le cellule MG vengono coltivate per ulteriori analisi.

Stabilire una coltura cellulare gliale Müller ottenuta da retine di topo

Milioni di persone soffrono di malattie degenerative della retina che provocano cecità irreversibile. Un elemento comune di molte di queste malattie è la perdita delle cellule del ganglio retinico (RGC). Questo protocollo dettagliato descrive l'isolamento di RGC murine primari mediante selezione positiva e negativa con citometria a flusso.

Isolamento delle cellule della ganglioma della retina primaria (RGC) mediante citometria a flusso

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Descriviamo l'isolamento immunomagnetica degli oligodendrociti primario del mouse, che permette l'isolamento rapido e specifico delle cellule per coltura in vitro .

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Qui, descriviamo l'isolamento di cellule glial-enterico dal submucosa intestinale utilizzando le incubazioni EDTA sequenziale per chelare cationi bivalenti e quindi l'incubazione in soluzione di recupero delle cellule non-enzimatici. La sospensione cellulare risultante su poli-D-lisina e laminin di placcatura si traduce in una cultura altamente arricchita delle cellule glial submucosal per l'analisi funzionale.

Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto

Qui, presentiamo un protocollo per isolare e purificare la microglia primaria in modelli animali di malattie demielinizzanti, utilizzando lo smistamento cellulare magnetico-attivato colonnare.

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Questo manoscritto descrive un protocollo semplificato per l'isolamento delle cellule dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) dagli occhi dei topi in modo graduale. Il protocollo include l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule RPE.

Isolamento delle cellule primarie dell'epitelio pigmentato retinico del topo

Le colture primarie di glia di Müller ottenute da retine di topo rappresentano uno strumento molto robusto e affidabile per studiare la conversione gliale in cellule progenitrici retiniche dopo il trattamento con microRNA. Singole molecole o combinazioni possono essere testate prima della loro successiva applicazione di approcci in vivo .

Colture cellulari primarie per studiare il potenziale di rigenerazione di Murine Müller Glia dopo il trattamento con microRNA

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) agisce come una barriera cruciale tra la coroide e la retina, promuovendo la salute e la funzione dei tipi di cellule retiniche, come i fotorecettori. In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice ed efficace per isolare e coltivare l'EPR murino adulto.

Un metodo semplificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali pigmentate retiniche da topi adulti

Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule primarie di Müller retiniche da ratti neonatali di Sprague-Dawley (SD). La procedura comprende l'enucleazione dei bulbi oculari, la dissezione del tessuto retinico, l'estrazione e l'identificazione delle cellule e le considerazioni chiave per la successiva coltura cellulare.

Isolamento e coltura di cellule primarie di Müller retiniche da ratti Sprague-Dawley (SD)

Impara l'isolamento delle cellule gliali di Müller retiniche primarie di topo per studiare la biologia cellulare e le malattie retiniche. Questo metodo consente di ottenere colture pure per ricerche sulle patologie oculari.

Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

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