Isolamento delle cellule primarie di Müller gliali retiniche di topo

Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato per isolare le cellule di Müller gliali retiniche dagli occhi di topo. Il protocollo inizia con l'enucleazione e la dissezione degli occhi di topo, seguita dall'isolamento, dalla semina e dalla coltura delle cellule di Müller.

Le cellule di Muller sono le principali cellule gliali della retina. Svolgono un ruolo molto importante per mantenere i neuroni della retina altamente attivi dal punto di vista metabolico. Il nostro laboratorio ha messo a punto una tecnica per isolare le cellule di Muller dagli occhi dei topi. Questa tecnica consentirà di studiare il ruolo delle cellule di Muller in diverse malattie retiniche, di comprendere la patogenesi delle malattie e anche di sviluppare bersagli terapeutici.

[Narratore] Sopprimere eticamente il topo secondo i metodi approvati dalla tua istituzione. Enucleare gli occhi premendo una pinzetta stile 5/45 sull'area orbitale per indurre la proptosi, seguita dall'estrazione dell'occhio posizionando i bracci delle pinzette nella parte posteriore dell'occhio, seguita da una leggera trazione dall'area orbitale. Mettere gli occhi in 10 ml della soluzione oculare a cellule Muller e lasciarli riposare per una notte o per circa 18 ore a temperatura ambiente. Dopo 18 ore, decantare la soluzione oculare versandola fuori dal tubo da scartare. Lavare gli occhi con soluzione salina tamponata con fosfato riscaldato o PBS. Decantare nuovamente il PBS versandolo fuori dal tubo per essere scartato. Quindi posizionare gli occhi in una capsula di Petri da 100 millimetri contenente 10 ml di soluzione di tripsina. Metti la piastra in un'incubatrice e incuba per 1,5-2 ore a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Dopo l'incubazione, trasferire gli occhi in una piastra di Petri da 60 millimetri contenente circa cinque mL di terreno di crescita cellulare Muller primario completo. Vale la pena notare che il video è stato registrato all'esterno del cofano per una migliore visibilità e una chiara dimostrazione. Per gli esperimenti reali, dovrebbero essere condotti in una cappa a flusso laminare come mostrato. Metti gli occhi sotto un microscopio da dissezione e inizia a dissezionare. Usa le pinzette in stile M5S e le forbici Vannas per rimuovere il tessuto connettivo, i muscoli extraoculari e il nervo ottico. Qui, il nervo ottico viene tagliato con le forbici di Vannas. Afferra l'occhio con una pinzetta stile M5S e fai un'incisione nella sezione ora serrata con le forbici Vannas o l'ago di una siringa. Afferra l'incisione con due pinzette stile M5S e inizia a tirare o strappare la cornea dalla parte posteriore dell'occhio. Tirare piccoli incrementi per garantire che l'integrità della retina rimanga intatta. Ecco una dimostrazione su come rimuovere la cornea dalla parte posteriore della conchiglia oculare. Una volta che il cristallino e la retina neurale sono esposti, rimuovere lo strato pigmentato dell'occhio, a cui probabilmente ha aderito l'iride. Quindi rimuovere la retina neurale dal cristallino. Rimuovere qualsiasi tessuto pigmentato dalla retina neurale per migliorare la purezza dell'isolamento. Data la natura appiccicosa della retina neurale, sarà improbabile rimuovere tutto il tessuto pigmentato. Raccogli tutte le retine neurali e strappale in pezzi più piccoli. Placcare le retine neurali in una fiaschetta T25 contenente quattro mL di terreno di coltura cellulare Muller primario completo. Infine, posizionare il pallone in un incubatore e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di CO2. Il pannello A mostra una coltura cellulare Muller sana al passaggio zero e al passaggio uno. La mancanza di pigmento indica l'assenza di cellule RPE, che è il contaminante principale nell'isolamento. Questo è rinforzato nel pannello B con RP65, un marcatore specifico RP.