Name: Istituzione di un modello murino sperimentale di endometrioma per studiarne linfertilità correlata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Impara a stabilire un modello murino di endometrioma utilizzando topi C57BL/6J per studiare i meccanismi patofisiologici dell'infertilità correlata. Questo metodo offre uno strumento avanzato per la ricerca in medicina riproduttiva.

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<meta charset="utf8"></head><body>Sviluppo di un nuovo modello murino che simula l'endometrioma

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 cc con ago da 25 G</td><td>BD Bioscienze</td><td>301320</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale da 10 mm</td><td>FALCONE</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>10% Formalina tamponata</td><td>Fisher Scientifico</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>10x tampone salino tamponato con fosfato (PBS)</td><td>Fisher Scientifico</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Ferri da 30 g</td><td>BD Bioscienze</td><td>305107</td><td></td></tr><tr><td>5-0 sutura intrecciata nera in seta non assorbibile</td><td>Ethicon Inc.</td><td>W500H</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini adesivi per microscopio</td><td>Marienfeld</td><td>810401</td><td></td></tr><tr><td>Iniezione di buprenorfina&nbsp;</td><td>Med-Vet Internazionale</td><td>RXBUPRENOR5</td><td></td></tr><tr><td>Batuffolo di cotone a doppia testa</td><td>SANYO Co., LTD.</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>Pinze fini</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Alfasan International b.v</td><td>2203095-08</td><td></td></tr><tr><td>Microprovette</td><td>Corning&nbsp;</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>Società Excelta</td><td>2827-NH-35-SE-ND</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico</td><td>Principali prodotti farmaceutici</td><td>10033691</td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione periodica per acido Schiff (PAS)&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>Codice ab150680</td><td></td></tr><tr><td>Guanti sterili senza polvere</td><td>Fisher Scientifico</td><td>19020558</td><td></td></tr><tr><td>Cassette di elaborazione/inclusione</td><td>Fisher Scientifico</td><td>15-197-700A</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi misura 3</td><td>Fisher Scientifico</td><td>22-079-657</td><td></td></tr><tr><td>Piccola pinza semicurva seghettata</td><td>Roboz Strumenti Chirurgici Co.</td><td>RS-5135</td><td></td></tr><tr><td>Piccole forbici chirurgiche</td><td>Roboz Strumenti Chirurgici Co.</td><td>RS-5850</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico standard</td><td></td><td></td><td>Per la valutazione di strisci di citologia vaginale e analisi istologiche.</td></tr><tr><td>Lame per bisturi in acciaio #10</td><td>B.Braun</td><td>BB510</td><td></td></tr><tr><td>Garza sterile</td><td>MEDICOM</td><td>HMWS 077</td><td></td></tr><tr><td>Piastre di Petri in vetro pyrex sterilizzate</td><td>Corning</td><td>70160-101</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodisco termoregolato</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura assorbibile VICRYL RAPIDE (polyglactin 910)</td><td>Ethicon Inc.</td><td>W9918</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina&nbsp;</td><td>Alfasan International b.v</td><td>2110333-10</td><td></td></tr></tbody></table>

istituzione di un modello murino sperimentale di endometrioma per studiarne l'infertilità correlata

Establishment of an Experimental Mouse Model of Endometrioma to Study its Related Infertility

Il successo della creazione di OMA Dei 12 topi sottoposti al protocollo di trapianto, 10 presentavano lesioni OMA caratteristiche, sia a livello anatomico macroscopico che istologico, che si traducono in un tasso di successo dell'83%. L'esame macroscopico ha rivelato lesioni piene di liquido aderenti alle ovaie, che ricordano le presentazioni cliniche di OMA (Figura 2). L'esame istopatologico, come illustrato nella Figura 3, ha confermato il successo dell'impianto del tessuto endometriale ectopico. Inoltre, l'infiltrazione di lesioni endometriosiche ha indotto una massiccia atresia dei follicoli accanto alle protesi, indicando la sua interferenza con l'ambiente ovarico.
Specificità del modello Fondamentale per la validità del modello era la sua specificità per l'endometriosi ovarica. Dopo un esame approfondito, non sono state identificate protesi endometriosiche estranee in nessun altro organo pelvico o addominale, sottolineando la precisione del modello e il suo potenziale come strumento robusto per studiare l'endometrioma e la sua infertilità correlata.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig01.jpg"> 
Figura 1: Generazione di modelli di endometrioma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig02.jpg"> 
Figura 2: Anatomia macroscopica dell'endometrioma. Rispetto al gruppo di controllo fittizio, la crescita cistica endometriale ectopica era visibile in associazione con la morfologia ovarica 4 settimane dopo il trapianto nel gruppo OMA in morfologia. Contorno tratteggiato blu: lesione endometriosica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66240/66240fig03.jpg"> 
Figura 3: Sezione istologica colorata di una lesione endometriale dal modello murino. Rispetto al gruppo di controllo fittizio, la crescita cistica ectopica endometriale era visibile in associazione con l'ovaio 4 settimane dopo il trapianto nel gruppo OMA in istologia. Le frecce nere indicano i follicoli atretici. Barre di scala = 0,5 mm. Abbreviazione: OMA = endometrioma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66240/66240fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Istituzione di un modello murino sperimentale di endometrioma per studiarne l'infertilità correlata

Endometrioma (OMA), a subtype of endometriosis characterized by the formation of endometriotic cysts in the ovaries, affects 17-44% of individuals ...

L'ambito della nostra ricerca è focalizzato sulla comprensione dei meccanismi alla base dell'infertilità associata all'endometrioma. Il nostro obiettivo è quello di colmare il divario di conoscenze sviluppando un modello murino che simula l'endometrioma e studiando il suo impatto sulla fertilità. Nel campo della ricerca sull'endometriosi, gli sviluppi recenti includono il progresso nella comprensione dei meccanismi molecolari alla base dell'endometriosi, l'identificazione di nuovi marcatori per la diagnosi e il trattamento e lo sviluppo di modelli innovativi per studiare sottotipi specifici come l'endometrioma. Questi sviluppi contribuiscono a migliorare le conoscenze e le potenziali strategie terapeutiche per l'endometriosi. Le attuali sfide sperimentali nella ricerca sull'endometrioma includono la mancanza di un modello animale affidabile, la comprensione limitata della patogenesi e dell'impatto sulla fertilità e la necessità di studi di recidiva e test diagnostici. Il modello murino di endometrioma e l'incorporazione dei risultati affrontano queste sfide e fanno progredire il campo.Il nostro protocollo offre vantaggi distinti rispetto ad altre tecniche. Si concentra in particolare sull'imitazione dell'endometrioma, mentre nessun altro sottotipo è stato stabilito con questo metodo. Con un alto tasso di successo, consente modifiche genetiche e replica le caratteristiche riproduttive simili agli esseri umani, rendendolo uno strumento prezioso per studiare l'infertilità correlata all'endometrioma. I nostri risultati hanno aperto la strada a una nuova era della ricerca sull'endometriosi. Colmando una lacuna di lunga data, il nostro modello promette intuizioni trasformative, rivoluzionando la nostra comprensione, il trattamento e potenzialmente la prevenzione dell'endometrioma. Integrando i risultati degli studi diagnostici e di recidiva, la nostra ricerca migliora il contesto più ampio della ricerca sull'endometriosi e della cura del paziente.[Narratore] Dopo aver raccolto la lettiera contenente feromoni maschili, introdurla nella gabbia del topo femmina per 48 ore. Versare 10 millilitri di PBS in una capsula di Petri e immergervi un'estremità di un batuffolo di cotone per assorbire il liquido. Estrai delicatamente un topo dalla sua gabbia e posizionalo sul coperchio. Inserire delicatamente il batuffolo di cotone inumidito nella vagina e ruotare delicatamente il tampone di 45 gradi rispetto all'asse lungo del corpo dell'animale. Dopo aver raccolto le cellule dalle pareti luminanti vaginali, prelevare con cura il tampone. Far rotolare delicatamente la punta del tampone su un vetrino di vetro pulito e pre-etichettato per trasferire le cellule raccolte. Esaminare il vetrino al microscopio per la presenza di cellule epiteliali cornificate che indicano lo stadio di estro. Per iniziare, disinfettare l'area addominale del topo femmina allo stadio di estro soppresso da donatore con etanolo al 70%. Utilizzare forbici chirurgiche sterili per praticare un'incisione di un centimetro lungo la linea mediana del peritoneo, esponendo lo strato muscolare. Quindi, usa un paio di forbici diverse per tagliare lo strato muscolare e rivelare la cavità pelvica. Chiudere le punte delle pinze e sollevare delicatamente l'intestino utilizzando la parte centrale smussata. Dopo aver localizzato l'utero, sezionare sterilemente l'intero corno uterino, assicurando la rimozione di entrambe le corna uterine. Mettere i tessuti asportati in una capsula di Petri contenente PBS e rimuovere i tessuti adiposi in eccesso. Usando un bisturi sterile, seziona minuziosamente i tessuti in pezzi cubizzati di un millimetro. Aggiungere periodicamente PBS per mantenere umidi i tessuti. Posizionare il topo ricevente anestetizzato in posizione supina su una tavola chirurgica sterile. Identificare il sito chirurgico manipolando delicatamente le zampe posteriori per sentire una prominenza ossea sotto la pelle. Disinfettare l'area chirurgica con un tampone di etanolo al 70% e successivamente con Betadine. Nel sito prescelto, praticare un'incisione laterale precisa tra i tre e i cinque millimetri. Stabilizzare l'ovaio con una pinza manuale non dominante e iniettare 100 microlitri di PBS nella borsa ovarica osservando una leggera separazione. Fai una piccola fessura nella borsa e, usando una micro pinza, trapianta i frammenti di tessuto uterino cubizzato di un millimetro. Dopo l'intervento chirurgico, suturare gli strati muscolari con suture riassorbibili e la pelle con suture non assorbibili. Dopo quattro settimane, rimuovere il topo ricevente trapiantato dalla gabbia di alloggiamento. Praticare un'incisione sulla linea mediana sul topo ricevente soppresso ed esporre la cavità addominale per l'ispezione dell'organo. Ispezionare accuratamente la cavità addominale per verificare la presenza di lesioni endometriosiche estranee. Quindi, estrarre le ovaie con lesioni visibili per la fotografia. Fissare le ovaie con lesioni in formalina tamponata neutra al 10%. Dopo aver sezionato e montato le sezioni di tessuto su un vetrino, posizionare la soluzione di xilene del vetrino per rimuovere la paraffina. Reidratare le sezioni di tessuto posizionando il vetrino in una serie di concentrazioni decrescenti di etanolo. Trattare le sezioni di tessuto con acido periodico all'1% per cinque-10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, sciacquare accuratamente il vetrino con acqua distillata per rimuovere eventuali residui di acido periodico. Ora, colorare le sezioni di tessuto con la soluzione shift per 15 minuti. Sciacquare il vetrino in acqua calda del rubinetto per rimuovere la macchia in eccesso e poi in acqua distillata. Controcolorare le sezioni di tessuto con l'ematossilina di Mayer per due o tre minuti. Sciacquare il vetrino con acqua corrente del rubinetto prima di applicare il reagente azzurrante per 30 secondi. Dopo aver risciacquato il vetrino in acqua distillata, disidratare le sezioni in concentrazioni crescenti di etanolo. Immergi le sezioni nello xilene per renderle trasparenti. Applicare un mezzo di montaggio alle sezioni e posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti evitando bolle d'aria. Dopo l'asciugatura, esaminare il vetrino al microscopio ottico per verificare la presenza di ghiandole endometriali, stroma e cisti emorragiche che confermano l'endometriosi nell'ovaio. Rispetto al gruppo di controllo fittizio, la crescita cistica ectopica dell'endometrio era visibile in associazione con la morfologia ovarica quattro settimane dopo il trapianto nel gruppo endometriale. Un ulteriore esame istopatologico ha confermato il successo dell'impianto del tessuto endometriale ectopico nel gruppo endometriale.

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