Name: Interferenza dellRNA nel parassitoide delluovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Scopri il metodo di interferenza dell'RNA nel parassitoide Trichogramma dendrolimi per studiare la regolazione genica. Questa tecnica consente di analizzare le funzioni geniche in organismi di piccole dimensioni utilizzati nel controllo biologico dei parassiti.

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Questa ricerca è stata finanziata dai progetti della National Natural Science Foundation of China (32172476, 32102275), dal Programma di innovazione tecnologica e scientifica agricola (CAAS-ZDRW202203, CAAS-ZDRW202108) e dai Fondi centrali che guidano lo sviluppo scientifico e tecnologico locale (XZ202301YD0042C).

NOTA: Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, strumenti, software e reagenti utilizzati in questo protocollo.
1. Raccolta e mantenimento della coltura degli insetti
<ol><li>Far aderire un gruppo di ~5.000 uova di Corcyra cephalonica (Stainton) su un cartoncino di 9 cm per 16 cm utilizzando una soluzione 1:5 (v/v) di gomma arabica in polvere e acqua25,26. NOTA: Evitare di attaccare troppe uova ospiti alla scheda in quanto il sovraffollamento rende impraticabile le successive procedure di trasferimento e dissezione.</li>
	<li>Per evitare la schiusa delle uova dell'ospite, sottoporre le schede uovo dell'ospite a 30 minuti di irradiazione ultravioletta (UV) (Figura 1-i). Successivamente, tagliare la carta con le uova inattivate in cartoncini di 1 cm di spessore e 8 cm di diametro, ciascuno contenente circa 300-500 uova (Figura 1-ii)25,26,27.</li>
	<li>Introdurre una coorte di 80-120 vespe T. denrolimi in un tubo di vetro di 2 cm di diametro e 8 cm di lunghezza. Sigillare il tubo con del cotone. NOTA: Mantenere le vespe ad una temperatura di 25 ± 1 °C, con un ciclo luce/buio di 16 h di luce e 8 h di buio e mantenere un'umidità relativa di circa il 75%.</li>
	<li>Presentare una scheda uovo ospite alle vespe per la parassitazione (Figura 1-ii). Lasciare che le vespe depositino le uova nelle uova ospiti per 6 ore, dopodiché rimuovere prontamente le vespe. NOTA: Evitare di prolungare eccessivamente il periodo di parassitizzazione in quanto ciò può portare al sovraffollamento della prole di T. denrolimi all'interno di un uovo ospite, con conseguente aumento della mortalità delle vespe della prole28,29.</li>
</ol>2. Sintesi di dsRNA
<ol><li>Progetta set di primer contenenti un promotore T7 per la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA). Scegli un segmento di 300-400 bp dal gene bersaglio (Ferhch) per la sintesi di dsRNA.</li>
	<li>Acquisire set di primer sintetizzati commercialmente per la produzione di dsRNA per il gene bersaglio e dsGFP da utilizzare come controllo negativo.</li>
	<li>Estrarre il contenuto di RNA da 100 vespe T. denrolimi utilizzando il kit di riferimento seguendo il protocollo del produttore9. Controllare la qualità del contenuto di RNA; procedere se il valore di OD260/OD280 è compreso tra 1,8 e 2,09.</li>
	<li>Purificare il contenuto di RNA con 2 μL di tampone 5x (1 U/50 μL), 1 μL di DNAsi (1 U/50 μL) e 6,5 μL di RNA (~100 ng/μL), 0,5 μL di H2O a 42 °C per 2 min.</li>
	<li>Eseguire la reazione a catena della polimerasi con trascrittasi inversa (RT-PCR) per generare un modello di cDNA con 10 μL di RNA purificato (~100 ng/μL), 4 μL di tampone 5x (1 U/50 μL), 1 μL di miscela enzimatica I (1 U/50 μL) e 4 μL di H2O. Eseguire la RT-PCR utilizzando le seguenti impostazioni: 37 °C per 15 min, 85 °C per 5 s. Conservare il prodotto cDNA a -4 °C fino all'uso.</li>
	<li>Eseguire la reazione a catena della polimerasi (PCR) per amplificare le sequenze di dsRNA in conformità con la miscela principale di riferimento (10 μL di Taq II [1 U/50 μL], 0,8 μL di primer diretto [0,4 μM], 0,8 μL di primer inverso [0,4 μM], 0,8 μL di DNA stampo [40 ng/μL] e 7,6 μL di H2O). Eseguire la PCR utilizzando le seguenti impostazioni: 94 °C per 2 min; 35 cicli con 94 °C per 30 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 30; 72 °C per 2 min.</li>
	<li>Valutare la qualità dei prodotti PCR mediante elettroforesi su un gel di agarosio al 2,0% 5,9 e confermare la sequenza target attraverso il sequenziamento Sanger.</li>
	<li>Purificare il prodotto PCR utilizzando il kit di estrazione del gel secondo le linee guida del produttore 9,23.</li>
	<li>Utilizzare un sistema RNAi per sintetizzare dsRNA per il gene bersaglio con 10 μL di tampone 2x (0,02 U/μL), 8 μL di stampo di DNA (75 ng/μL) e 2 μL di miscela enzimatica (1 U/50 μL) con le seguenti impostazioni: 37 °C per 30 min, 70 °C per 10 min e 25 °C per 20 min. Eluire il dsRNA sintetizzato con 30 μL di acqua priva di nucleasi.</li>
	<li>Valutare la qualità del prodotto dsRNA visualizzandolo su un gel di agarosio all'1,0% 5,9. Diluire il dsRNA a 7.000 ng/μL. Controllare la qualità del prodotto dsRNA; procedere se il valore di OD260/OD280 è compreso tra 1,8 e 2,09. Conservare il prodotto dsRNA a -20 °C fino al momento dell'uso.</li>
</ol>3. Trapianto di pupe di T. denrolimi
<ol><li>Coltivare le uova ospiti parassitate per circa 8 giorni a 25 ± 1°C, mantenendo un ciclo di 16 ore di luce/8 ore di buio e un'umidità relativa di ~75%. Le uova dell'ospite parassitato si anneriranno dopo 5 giorni30 (Figura 1-iv,v).</li>
	<li>Trasferire la scheda dell'uovo ospite su un microscopio da dissezione. Utilizzare un paio di aghi di tungsteno (Figura 1-vi) per rimuovere meticolosamente il corion dalle uova ospiti (Figura 1-vii) e recuperare la pupa dall'interno (Figura 1-viii)5,17,18. NOTA: La punta dell'ago da dissezione deve essere inferiore a 0,05 mm.</li>
	<li>Preparare una piastra pulita per il substrato. Versare 10-15 mL di una soluzione di agar da 15 g/L, lasciandola raffreddare naturalmente (Figura 2-i). NOTA: Miscelare la soluzione di agar con 0,5 g di streptomicina per inibire la crescita di contaminanti in vitro.</li>
	<li>Utilizzare un bulino disinfettato per incidere diverse scanalature che misurano 0,2-0,3 mm di profondità e 0,4-0,8 mm di larghezza (Figura 2-ii).</li>
	<li>Utilizzare uno spazzolino (Figura 2-iii) per trapiantare una pupa dall'uovo ospite sezionato in una delle scanalature del substrato di agar (Figura 2-iv).</li>
	<li>Ripetere i passaggi 3.4 e 3.5, trapiantando 100-300 pupe singolarmente nei solchi una per una (Figura 2-v).</li>
</ol>4. Micro-iniezione di dsRNA nella pupa di T. denrolimi
<ol><li>Utilizzare un estrattore di aghi di vetro per tirare un capillare di vetro (Figura 3-i,ii). Impostare il calore su 280, la velocità su 170, il ritardo su 250 e il tiro su 30 su un estrattore ad ago (Figura 3-iii). Preparare più aghi di vetro capillare per la microiniezione (Figura 3-iv,v).</li>
	<li>Smussare la punta dell'ago di vetro utilizzando una piastra abrasiva (Figura 3-vi). NOTA: Assicurarsi che la punta dell'ago per iniezione rimanga affilata; in caso contrario, può causare la mortalità della pupa o impedire il flusso del reagente attraverso l'ago (Figura 3-vii).</li>
	<li>Caricare circa 2 μL della soluzione iniettabile di dsRNA con 7.000 ng/μL nell'ago di iniezione preparato utilizzando una pompa per microiniezione (Figura 3-vii).</li>
	<li>Trasferire il substrato di agar contenente centinaia di pupe sulla piattaforma di un microscopio composto (Figura 3-viii).</li>
	<li>Inserire con cautela l'ago per iniezione nell'addome di una pupa di T. denrolimi con un angolo di ~30° rispetto all'addome sotto la lente (Figura 3-ix).</li>
	<li>Iniettare gradualmente ~5 nL della soluzione iniettabile (fase 4.3) nella pupa di T. denrolimi il più delicatamente possibile. NOTA: La pupa di T. denrolimi può gonfiarsi leggermente quando viene iniettata la soluzione di dsRNA. L'iniezione di una quantità eccessiva di soluzione nella pupa o l'uso di aghi con aperture troppo grandi può provocare la morte prematura della pupa. Cambiare gli aghi quando si ostruiscono dopo aver iniettato da diverse a decine di pupe.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.5 e 4.6, iniettando dsRNA in 600 pupe una per una. NOTA: Per un'analisi RT-qPCR affidabile, il contenuto di RNA deve essere isolato da almeno 100 pupe. Iniettare almeno 600 pupe per tre repliche nel trattamento con dsRNA e tre repliche nel controllo negativo con dsGFP 9.</li>
</ol>5. Incubazione delle pupe di T. denrolimi
<ol><li>Trasferire il substrato contenente le pupe iniettate in un'incubatrice a 25 ± 1 °C con un ciclo luce/buio di 16 ore/8 ore e ~75% di umidità relativa.</li>
	<li>Incubare circa 700 pupe di T. denrolimi per trattamento per 24 o 48 ore. Estrarre il contenuto di RNA da un gruppo di 100 pupe per replicato9. NOTA: Rimuovere le pupe rimpicciolite (pupe morte) dai campioni; in caso contrario, potrebbero verificarsi errori nel rilevamento dell'espressione genica.</li>
	<li>Incubare ~50 pupe di T. denrolimi per trattamento fino a quando le vespe non emergono (Figura 3-x). Registrare il tasso di emergenza e il tasso di deformità.</li>
</ol>6. Rilevamento dell'espressione genica mirata
<ol><li>Progettare il set di primer per il gene bersaglio e i geni di riferimento per la RT-qPCR utilizzando uno strumento di progettazione. NOTA: Assicurarsi che le sequenze dei primer RT-qPCR non si sovrappongano alla regione bersaglio del dsRNA.</li>
	<li>Utilizzare il gene forkhead box O (FoxO) come gene di riferimento nell'analisi RT-qPCR; i primer di FoxO sono stati segnalati in precedenza9.</li>
	<li>Ottenere set di primer sintetizzati commercialmente. Eseguire la RT-qPCR con 10 μL di Taq II (1 U/50 μL), 0,8 μL di primer diretto (0,4 μM), 0,8 μL di primer inverso (0,4 μM), 0,8 μL di stampo (10 ng/μL) e 7,6 μL di H2O. Eseguire la RT-qPCR utilizzando le seguenti impostazioni: 95 °C per 30 s; 35 cicli con 95 °C per 5 s, 57 °C per 30 s, 72 °C per 30; 95 °C per 10 s; 60 °C per 5 sec. e 95 °C per 5 s.</li>
	<li>Calcolare il valore di espressione del gene bersaglio utilizzando il metodo 2-ΔΔCt 9,25.</li>
	<li>Utilizzare il test di Kruskal-Wallis per analizzare l'espressione del gene bersaglio sotto l'influenza di diversi trattamenti (dsFerhch, dsGFP, non iniettabile). NOTA: Evitare l'uso di test parametrici (ad esempio, t-test) per confronti post-hoc poiché l'eteroschedasticità e la non normalità dei dati possono portare a conclusioni errate25.</li>
</ol>

Avanzamento delle tecniche RNAi in Trichogramma dendrolimi per l'analisi della funzione genica

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<li>Ning, S. F., Zhou, J. C., Liu, Q. Q., Zhao, Q., Dong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradual%2C+temperature-induced+change+of+secondary+sexual+characteristics+in+Trichogramma+pretiosum+infected+with+parthenogenesis-inducing+Wolbachia%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Gradual, temperature-induced change of secondary sexual characteristics in Trichogramma pretiosum infected with parthenogenesis-inducing Wolbachia.</a> PeerJ. 7, e7567(2019).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+Wolbachia+titers+cause+gradual+change+in+masculinization+of+intersex+individuals+of+thelytokous+Trichogramma+dendrolimi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Decreased Wolbachia titers cause gradual change in masculinization of intersex individuals of thelytokous Trichogramma dendrolimi.</a> Entomol Gen. 42 (5), 751-759 (2022).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-parasitism%3A+A+promising+approach+to+simultaneously+produce+Trichogramma+chilonis+and+T.+dendrolimi+on+eggs+of+Antheraea+pernyi%5BTitle%5D)+AND+%22Entomol+Gen%22%5BJournal%5D)">Multi-parasitism: A promising approach to simultaneously produce Trichogramma chilonis and T. dendrolimi on eggs of Antheraea pernyi.</a> Entomol Gen. 41 (6), 627-636 (2021).</li>
<li>Zhou, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Thelytokous+parthenogenesis-inducing+Wolbachia+on+the+fitness+of+Trichogramma+dendrolimi+Matsumura+%28Hymenoptera%3A+Trichogrammatidae%29+in+superparasitised+and+single-parasitised+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Ecol+Evol%22%5BJournal%5D)">Effects of Thelytokous parthenogenesis-inducing Wolbachia on the fitness of Trichogramma dendrolimi Matsumura (Hymenoptera: Trichogrammatidae) in superparasitised and single-parasitised hosts.</a> Front Ecol Evol. 9, 730664(2021).</li>
<li>Flanders, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notes+on+the+life+history+and+anatomy+of+Trichogramma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Entomol+Soc+Am%22%5BJournal%5D)">Notes on the life history and anatomy of Trichogramma.</a> Ann Entomol Soc Am. 30 (2), 304-308 (1937).</li>
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Le vespe Trichogramma sono riconosciute come efficaci agenti di controllo biologico, mirati specificamente a una serie di parassiti lepidotteri in agricoltura e silvicoltura1. Queste minuscole vespe subiscono i loro stadi immaturi all'interno dell'uovo ospite, una caratteristica che presenta sfide nella conduzione di esperimenti RNAi 5,18. Questo studio offre una guida visiva completa per la conduzione di esperimenti di RNAi in <e...

Trichogramma spp. è un gruppo di parassitoidi delle uova che sono stati ampiamente utilizzati come agenti di controllo biologico altamente efficienti contro un ampio spettro di parassiti lepidotteri negli ecosistemi agricoli e forestali di tutto il mondo 1,2,3,4. L'applicazione di Trichogramma allevato in massa fornisce un approccio ecologico per la gestione sostenibile dei parassiti 5,6,7. La comprensione della biologia molecolare delle vespe Trichogramma fornisce preziose informazioni per migliorare l'efficienza dell'allevamento di massa e le prestazioni sul campo di questi agenti di controllo biologico 8,9 studiando la metodologia di regolazione genica e l'editing del genoma10.
Dalla scoperta dell'interferenza genetica specifica mediata da RNA a doppio filamento (dsRNA) in Caenorhabditis elegans nel 1998, il metodo dell'interferenza dell'RNA (RNAi) si è evoluto in un kit di strumenti genetici vitali per esplorare i meccanismi di regolazione degli organismi sopprimendo l'espressione dei geni bersaglio11. Gli esperimenti di RNAi sono diventati una metodologia standard ampiamente applicata per studiare la funzione genica in numerose specie di insetti12,13. Ciononostante, la manipolazione dell'RNAi rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi, in particolare tra quelle appartenenti alla famiglia degli endoparassiti Chalcidoidea 14,15,16. Il metodo RNAi è stato documentato in almeno 13 specie di parassitoidi 14,15,16,17,18,19. Tra questi, l'approccio RNAi è stato condotto in modo completo nelle vespe di Nasonia ed è applicabile in tutte le fasi di sviluppo, inclusi embrioni, larve, pupe e adulti 14,15,16. È interessante notare che le vespe Nasonia sono ectoparassitoidi, con la loro prole che si sviluppa nello spazio interstiziale tra la pupa ospite e il pupario, consentendo la loro coltivazione in vitro e facendo tollerare loro alcuni trattamenti, come la microiniezione. A differenza delle vespe Nasonia, gli individui di Trichogramma subiscono l'intero sviluppo embrionale, larvale e pupale all'interno dell'uovo ospite. Lo strato allo stadio embrionale e larvale (che può ostacolare la permeabilità del dsRNA), la vulnerabilità ai danni e la difficoltà di sopravvivere in vitro presentano ostacoli formidabili 20,21,22. Inoltre, le dimensioni ridotte degli individui di Trichogramma, circa ~ 0,5 mm di lunghezza adulta o pupale, li rendono estremamente intricati da manipolare 20,21,22.
Nel presente studio, delineiamo una procedura completa per condurre esperimenti di interferenza dell'RNA (RNAi) in Trichogramma denrolimi Matsumura. Questa procedura comprende le seguenti procedure: (1) la progettazione e la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA), (2) la microiniezione di pupe di T. denrolimi, (3) il trapianto e l'incubazione in vitro di queste pupe e (4) il rilevamento del knockdown del gene bersaglio attraverso l'analisi RT-qPCR. Il gene bersaglio selezionato per l'esperimento RNAi è l'omologia della catena pesante della ferritina (Ferhch). FerHCH, una proteina legante il ferro, contiene un centro ferroxidasico dotato di capacità antiossidanti, facilitando l'ossidazione di Fe2+ a Fe3+. Svolge un ruolo indispensabile nella crescita e nello sviluppo di vari organismi mantenendo l'equilibrio redox e l'omeostasi del ferro. La deplezione di FerHCH può provocare l'accumulo eccessivo di ferro, portando a danni irreversibili ai tessuti e spesso culminando in significative alterazioni fenotipiche, tra cui difetti di crescita, deformità e mortalità 23,24. Questo studio offre una guida passo-passo per la conduzione dell'RNAi in T. denrolimi, che sarà preziosa per studiare le funzioni geniche nel più ampio contesto delle vespe Trichogramma.

<table><tbody><tr><td>2x ES Taq MasterMix (Dye)</td><td>Cowin Biotech, China</td><td>CW0690H</td><td>Per amplificare le sequenze di dsRNA</td></tr><tr><td>20x PBS Buffer, trattato con DEPC (7.2-7.6)</td><td>Sangon Biotech, China</td><td>B540627-0500</td><td>Per diluire la striscia di agar dsRNA</td></tr><tr><td></td><td>Shishi Globe Agar Industries Co., Ltd, China</td><td>n/a</td><td>Per produrre terreno di coltura</td></tr><tr><td>Ampicillina sodica</td><td>Sangon Biotech, Cina</td><td>A610028</td><td>Per fare terreno di coltura</td></tr><tr><td>Bioer Bagno metallico a temperatura costante </td><td>BIOER, Cina</td><td>MB-102</td><td>Per sintetizzare il dsRNA</td></tr><tr><td>Capillare in vetro borosilicato </td><td>WPI, USA</td><td>1B100-4</td><td>Per tirare l'ago di vetro capillare</td></tr><tr><td>Banco pulito </td><td>Airtech, Cina</td><td>SW-CJ-1FD</td><td>Per estrarre l'RNA</td></tr><tr><td>Doppia acqua distillata</td><td>Sangon Biotech, Cina</td><td>A500197-0500</td><td>Per diluire la camera di test ambientale del cDNA</td></tr><tr><td> </td><td>Panasonic, Giappone</td><td>MLR-352H-PC</td><td>Per la coltura T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge </td><td>Eppendrof, Germania</td><td>5418R</td><td>Per conservare il contenuto di RNA</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet 4i</td><td>Eppendrof, Germania</td><td>FemtoJet 4i</td><td>Per iniettare T. denrolimi</td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuga refrigerata </td><td>Eppendrof, Germania</td><td>5810R</td><td>Soluzione</td></tr> di <tr><td>etanolo per centrifuga (75%, senza RNasi)</td><td>Aladdin, Cina</td><td>M052131-500ml</td><td>Per estrarre</td></tr> il <tr><td>kit di estrazione su gel</td> di RNA <td>Omega, USA</td><td>D25000-02</td><td>Per estrarre il cDNA</td></tr><tr><td>GUM Arabico</td><td>Solarbio, Cina</td><td>CG5991-500g</td><td>Per fare la carta dell'uovo</td></tr><tr><td>Isopropyl alchohol</td><td>Aladdin, China</td> 80109218 Per estrarre <td>l'RNA</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette basato su laser </td><td>SUTTER, USA</td><td>P-2000</td><td>Per tirare l'ago di vetro capillare</td></tr><tr><td>Microloader </td><td>Eppendrof, Germania</td><td>20 µ L</td><td>Per caricare dsRNA</td></tr><tr><td>Macinatore di tessuti multicampione </td><td>LICHEN, Cina</td><td>LC-TG-24</td><td>Per macinare T. denrolimi</td></tr><tr><td>Needle Grinder </td><td>SUTTER, USA</td><td>BV-10-E</td><td>Per macinare l'ago di vetro capillare</td></tr><tr><td>Acqua senza nucleasi</td><td>Sangon Biotech, Cina</td><td></td><td>Per diluire l'RNA</td></tr><tr><td>OLYMPUS Microscopio</td><td>OLYMPUS, Giappone</td><td>XZX16</td><td>Per osservare la macchina PCR di T. denrolimi</td></tr><tr><td> </td><td>Bio-rad, USA</td><td>S-1000</td><td>Per l'amplificazione del DNA</td></tr><tr><td>PowerPac Basic</td><td>Bio-rad, USA</td><td>PowerPacTM Basic</td><td>Per rilevare la qualità del dsRNA </td></tr><tr><td>Primer di dsGFP (Forward)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA</td></tr><tr><td>Primer di dsGFP (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG</td></tr><tr><td>Primer di Ferhch for qPCR (Forward)</td><td></td><td></td><td>TGAAGAGATTCTGCGTTCTCTCTCT</td></tr><tr><td>Primer di Ferhch for qPCR ( Reverse)</td><td></td><td></td><td>CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT</td></tr><tr><td>Primer di Ferhch for RNAi (Reverse)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC</td></tr><tr><td>Primer di Ferhch for RNAi(Forward)</td><td></td><td></td><td>[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG</td></tr><tr><td>Primer di FoxO for qPCR (Forward)</td><td></td><td></td><td>CTACGCCGATCTCATAACGC</td></tr><tr><td>Primer di FoxO per qPCR (inverso)</td><td></td><td></td><td>TGCTGTCGCCCTTGTCCT</td></tr><tr><td>Kit di reagenti PrimeScript RT con gomma per gDNA (Perfect Real Time)</td><td>TaKaRa, Giappone</td><td>RR047A</td><td></td></tr><tr><td>PCR quantitativa in tempo reale </td><td>Bio-rad, USA</td><td>CFX 96 Touch</td><td>Per eseguire la reazione a catena della polimerasi trascrittasi inversa (RT-PCR) </td></tr><tr>Strumento <td></td><td></td> di <td>progettazione di primer e sonde per PCR in tempo reale (TaqMan)</td><td>https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/</td></tr> <tr><td>T7 RiBoMAX Express RNAi System</td><td>Promega, USA</td><td>P1700</td><td>Per sintetizzare dsRNA   in vitro  </td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex TaqTM <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/66250/66250eq01.jpg" style="margine: auto; "> (Til RnaseH Plus)</td><td>TaKaRa, Giappone</td><td>RR820A</td><td>Per eseguire RT-qPCR</td></tr><tr><td>Triclorometano</td><td>KESHI, Cina</td><td>GB/T682-2002</td><td>Per estrarre</td></tr> il <tr><td>reagente RNA TRIzol</td><td>Ambion, USA</td><td>15596018</td><td>Per estrarre il contenuto totale di RNA dai campioni</td></tr><tr><td>Congelatore a bassissima temperatura </td><td>Thermo, USA</td><td>Forma 911</td><td></td></tr></tbody></table>

interferenza dell'rna nel parassitoide dell'uovo, trichogramma dendrolimi matsumura

RNA Interference in the Egg Parasitoid, Trichogramma dendrolimi Matsumura

I parassitoidi dell'uovo, Trichogramma spp, sono riconosciuti come efficaci agenti di controllo biologico contro vari parassiti lepidotteri in agricoltura e foreste. Gli stadi immaturi della prole di Trichogramma si sviluppano all'interno dell'uovo ospite, mostrando una notevole piccolezza (circa 0,5 mm di lunghezza da adulto). La metodologia dell'interferenza dell'RNA (RNAi) è emersa come uno strumento cruciale per chiarire le funzioni dei geni in numerosi organismi. Tuttavia, la manipolazione dell'RNAi in alcune piccole specie di parassitoidi, come Trichogramma, ha generalmente posto sfide significative. In questo studio, presentiamo un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La procedura delineata comprende l'acquisizione e l'isolamento di singoli campioni di T. dendrolimi da uova ospiti, la progettazione e la sintesi di RNA a doppio filamento (dsRNA), il trapianto e la coltivazione in vitro di pupe di T. dendrolimi , la micro-iniezione di dsRNA e la successiva valutazione del knockdown del gene bersaglio attraverso l'analisi RT-qPCR. Questo studio fornisce una procedura completa e visivamente dettagliata per condurre esperimenti di RNAi in T. dendrolimi, consentendo così ai ricercatori di studiare la regolazione genica in questa specie. Inoltre, questa metodologia è adattabile per studi di RNAi o micro-iniezioni in altre specie di Trichogramma con piccoli aggiustamenti, rendendola un prezioso riferimento per condurre esperimenti di RNAi in altre specie endoparassitarie.

Il tasso di emergenza delle pupe di T. denrolimi iniettate con dsFerhch è stato significativamente inferiore a quello di quelle iniettate con dsGFP o di quelle senza iniezione (Tabella 1). Tra le vespe emerse, il 51,85% delle vespe T. denrolimi sottoposte a dsFerhch ha sviluppato piccole ali deformate. Le vespe deformi non sono state osservate nelle vespe iniettate con dsGFP o senza alcuna iniezione (Tabella 1). Inoltre, gli addomi de...

La manipolazione dell'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi di dimensioni ridotte, come le vespe Trichogramma . Questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica nelle vespe Trichogramma .

Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

The egg parasitoids, Trichogramma spp, are recognized as efficient biological control agents against various lepidopteran pests in agriculture and ...

Le vespe Trichogramma sono un gruppo di parassitoidi delle uova utilizzati per controllare i parassiti dei lepidotteri in agricoltura. Il batterio intracellulare Wolbachia induce la partenogenesi del lytokous in alcune vespe Trichogramma. Stiamo cercando di rispondere al meccanismo di Wolbachia e ai sistemi di determinazione del sesso nelle vespe Trichogramma.Abbiamo sviluppato il metodo di interferenza dell'RNA nelle vespe Trichogramma. Questo metodo è un kit di strumenti genetici vitali per studiare le funzioni genetiche di Trichogramma. Gli stadi immaturi della prole di Trichogramma si sviluppano all'interno dell'uovo ospite.Le dimensioni del corpo di Trichogramma sono estremamente piccole e sono di circa 0,5 millimetri di lunghezza da adulto. La manipolazione di strumenti genetici come l'interferenza dell'RNA e l'editing del genoma rappresenta una sfida formidabile per queste minuscole vespe parassitoidi. Per decenni, le funzioni genetiche all'interno dell'intero genere Trichogramma sono state raramente esplorate.La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica durante lo sviluppo e le attività fisiologiche nelle vespe Trichogramma.

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RNA interference (RNAi) tecniche di gene knockdown basati sono al centro della ricerca Tribolium. Qui, forniamo una panoramica della nostra tecnica larvale RNAi in Tribolium castaneum. Larvale RNAi è una tecnica semplice, ma potente che consente di accedere rapidamente alla perdita-di-funzione di fenotipi, consentendo ai ricercatori di studiare le funzioni del gene in contesti diversi.

Larvali interferenza RNA nella Red Farina Beetle, Tribolium castaneum

Questo protocollo fornisce linee guida per l'esecuzione di esperimenti di rifiuto di uovo: tecniche relative alla struttura per pittura sperimentale uovo modelli da emulare i colori delle uova di uccello naturale, lo svolgimento di lavoro sul campo e analizzare i dati raccolti. Questo protocollo fornisce un metodo uniforme per lo svolgimento di esperimenti di rifiuto uovo comparabili.

Sondare i limiti del riconoscimento uovo utilizzando esperimenti di rifiuto uovo lungo gradienti fenotipiche

In questo protocollo, vengono descritti metodi per lo svolgimento di consanguineità croci e per valutare il successo di quelle croci, per la formica Vollenhovia emeryi. Questi protocolli sono importanti per esperimenti volti a comprendere le basi genetiche dei sistemi di determinazione del sesso in imenotteri.

Induzione e la valutazione di Inbreeding croci utilizzando la formica, Vollenhovia Emeryi

Vi presentiamo una semplice tecnica citogenetica usando 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per determinare il tasso di fertilizzazione e rapporto primario del sesso del parassita invasivo haplodiploid Bemisia tabaci.

Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.

Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat

Forniamo un protocollo dettagliato per l'interferenza dell'RNA mediato dall'elettroporazione negli insetti dell'ordine Odonata (libellule e damselflies) usando il damselfly dalla coda blu (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) e la libellula skimmer pied(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Metodo di interferenza dell'RNA mediato dall'elettroporazione in Odonata

Qui è presentato un protocollo di microiniezione embrionale Helicoverpa armigera (Hübner) e identificazione di mutanti knockout creati dall'editing del genoma CRISPR / Cas9. Gli insetti mutanti consentono ulteriori ricerche sulla funzione genica e sull'interazione tra diversi geni in vivo.

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

Il presente protocollo descrive il metodo di allevamento degli insetti nocivi tortricidi nei laboratori. Le procedure per distinguere il sesso degli insetti ed estrarre gli acidi nucleici per il sequenziamento ad alto rendimento sono stabilite utilizzando due parassiti tortricidi.

Allevamento di massa e studi molecolari negli insetti parassiti Tortricidae

Questo protocollo descrive un test di interferenza dell'RNA e ChIP per studiare l'ereditarietà epigenetica del silenziamento indotto dall'RNAi e le modificazioni della cromatina associate in C. elegans.

Analisi dell'ereditarietà epigenetica transgenerazionale in C. elegans utilizzando un reporter fluorescente e l'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

Qui presentiamo un protocollo per l'estrazione del veleno da Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale creato con film di polietilene e soluzione di amminoacidi.

Estrazione del veleno dalla vespa parassitoide Trichogramma dendrolimi utilizzando un ospite artificiale

Qui viene presentato un protocollo per la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA nelle larve di Bombyx mori del baco da seta per indurre il silenziamento genico attraverso l'ingestione.

Interferenza dell'RNA larvale nel baco da seta Bombyx mori attraverso la somministrazione di nanoparticelle di chitosano/dsRNA

Scopri il metodo di interferenza dell'RNA nel parassitoide Trichogramma dendrolimi per studiare la regolazione genica. Questa tecnica consente di analizzare le funzioni geniche in organismi di piccole dimensioni utilizzati nel controllo biologico dei parassiti.

Interferenza dell'RNA nel parassitoide dell'uovo, Trichogramma dendrolimi Matsumura

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