Name: Quantificazione di Acanthamoeba spp. Motilità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Scopri metodi di microscopia e analisi delle immagini per quantificare la motilità di Acanthamoeba spp. Questa tecnica avanzata aiuta a comprendere la cheratite da Acanthamoeba e migliorare l'igiene delle lenti a contatto.

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1. Preparazione dell'acanthamoeba 
NOTA:Questo protocollo è stato verificato per ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 e PRA-411. Questo è un agente patogeno BSL2 e dovrebbe essere lavorato all'interno di una cappa e di un laboratorio BSL2.
<ol><li>Creare una coltura master da una fiala di campione o da un tappo20 preparato riempiendo un pallone T75 con 30 ml di terreno AC6 e aggiungervi in modo asettico un tappo o il contenuto di una fiala di campione. Incubare il matraccio per 3-5 giorni a 26-30 °C fino a quando il pallone è confluente dal 50% all'80%.</li>
	<li>Il passaggio delle cellule il giorno prima è necessario per creare una popolazione omogenea di trofozoiti.<ol><li>A seconda delle esigenze del ceppo, agitare e/o colpire energicamente la coltura master 2 volte per rimuovere i trofozoiti aderiti.</li>
		<li>Riempire un matraccio T75 con 30 mL di terreno AC6. Aggiungere 2 ml di coltura master al passaggio. Incubare il matraccio per 18-24 ore a 26-30 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Prima del raccolto, ispezionare visivamente la popolazione di trofozoiti con un ingrandimento di 4x al microscopio. Assicurarsi che i trofozoiti siano aderenti e uniformi.</li>
	<li>Colpisci energicamente la fiaschetta 2 volte per rimuovere i trofozoiti aderenti. Versare il contenuto in una provetta conica da 50 mL.</li>
	<li>Centrifugare la provetta a 500 x g per 5 minuti in una centrifuga bilanciata per pellettare l'ameba. Versare o pipettare il mezzo surnatante e gettarlo. Diluire il pellet in 2-10 mL di 1/4 di soluzione di Ringer.</li>
	<li>Agitare il campione. Aggiungere 10 μL di campione a un emocitometro monouso e contare le CFU/mL dell'Acanthamoeba.</li>
	<li>Sulla base della conta dell'emocitometro, diluire il pellet di ameba a una concentrazione di 7,5 x 103 cellule/mL in 1/4 di soluzione di Ringer.</li>
	<li>Seme l'ameba su una superficie, che può essere di vetro, plastica o agar non nutriente, e una varietà di forme di pozzetti a seconda delle esigenze sperimentali come descritto di seguito.<ol><li>Piastra a 96 pozzetti: seminare ogni pozzetto con 200 μl di sospensione di Acanthamoeba e racchiudere la piastra con il coperchio.</li>
		<li>Piastra a 48 pozzetti: seminare ogni pozzetto con 1 mL di sospensione di Acanthamoeba e racchiudere la piastra con il coperchio.</li>
		<li>Cella a flusso: aggiungere lentamente 4 mL di sospensione di Acanthamoeba attraverso le porte sterili di una cella a flusso sterile in alluminio, evitando la formazione di bolle nella camera. Bloccare le porte chiuse dopo che la sospensione è stata aggiunta.</li>
	</ol></li>
	<li>Prima dell'imaging, lasciare che l'ameba aderisca alla superficie per almeno 30 minuti prima di iniziare la registrazione microscopica.</li>
</ol>2. Visualizzazione e registrazione di Acanthamoeba
<ol><li>Visualizza l'ameba con un ingrandimento 4x in campo chiaro. Lo sfondo dovrebbe apparire grigio chiaro e l'ameba dovrebbe essere nera. Regolare la luce e la messa a fuoco in modo che le amebe siano occhiaie solide invece che traslucide (quindi, leggermente sfocate, Figura 1.). NOTA: L'ingrandimento ottimale è 4x per l'inseguimento per diversi motivi: Le amebe che escono o entrano nel campo visivo durante l'inseguimento non devono essere incluse nell'analisi dei dati, quindi l'ingrandimento inferiore supporta al meglio il numero massimo di ameba incluse nell'analisi in un periodo di tempo. L'ameba dovrebbe apparire come cerchi neri solidi in campo chiaro per convertirli in binari per l'analisi di tracciamento. Questo è più facile da ottenere con un ingrandimento inferiore, poiché ingrandimenti più elevati rivelano facilmente la natura traslucida e le strutture interne dell'ameba. In generale, è possibile catturare più ameba in un singolo campo visivo con un ingrandimento inferiore, supportando un'analisi dei dati più robusta.</li>
	<li>Impostare i programmi di registrazione nel software di imaging per registrare un'immagine a intervalli regolari per tracciare l'ameba. Il tempo più lungo tra le immagini che consentirà un tracciamento accurato è di 30 s, il tempo ottimale per le dimensioni del file e i dettagli di tracciamento è suggerito a 12 s o 24 s.</li>
	<li>Le amebe possono essere monitorate per più giorni alla volta, ma fai attenzione alle dimensioni del file che questo tipo di registrazione creerà e alla difficoltà intrinseca di manipolare file estremamente grandi. Per evitare ciò, registra le amebe per tratti di tempo a determinati intervalli. Ad esempio, registra per 1 ora ogni 12 ore per 5 giorni.</li>
	<li>Se il microscopio e il programma lo consentono, registrare più pozzetti in un'unica sessione utilizzando le coordinate XY dei pozzetti della piastra o più posizioni di una cella di flusso. Se necessario, unire più sezioni di un pozzetto o di una cella di flusso per creare un campo visivo più ampio con un ingrandimento di 4x. NOTA: L'unico vincolo sul numero di posizioni che possono essere registrate è la velocità con cui il tavolino del microscopio può spostarsi tra le posizioni entro l'intervallo di tempo dell'immagine (ad esempio, scattando un'immagine ogni 12 s, 24 s, ecc.). Tuttavia, questo non è necessario e il monitoraggio dei video realizzati da un'unica posizione può comunque avere un numero sufficiente di tracce per un'analisi statistica affidabile. In questo studio è stato utilizzato un microscopio Nikon Eclipse Ti-U e il tavolino mobile automatizzato è stato utilizzato per registrare immagini in più pozzetti alla volta. Tuttavia, qualsiasi microscopio con una capacità di registrazione programmabile funzionerà. Il microscopio deve essere collegato a un computer ed essere in grado di registrare immagini su un programma o su un disco rigido.</li>
</ol>3. Analisi delle dimensioni dell'ameba
<ol><li>Aprire il file del microscopio nel software di imaging. Si apriranno le opzioni di importazione dei bioformati. Nella finestra di dialogo, assicurati che siano soddisfatte le seguenti condizioni: Visualizzazione in pila; Visualizza con: Selection-Hyperstack; Gestione della memoria: selezionare Usa stack virtuale; Modalità colore: predefinita.</li>
	<li>Assicurarsi che nessuno degli altri menu a discesa o caselle di controllo sia attivato. Fare clic su OK.</li>
	<li>Apri le opzioni della serie di bioformati. Scegli la serie necessaria. Se viene registrata una sola posizione alla volta, probabilmente ci sarà solo un'opzione qui. Fare clic su OK.</li>
	<li>Scegliete Immagine &gt; Duplica per duplicare il singolo pozzetto con cui si sta lavorando alla volta scegliendo un solo canale C e un solo canale Z.</li>
	<li>Da qui in poi, lavora solo con l'immagine duplicata per la manipolazione e l'analisi, non con l'originale. Scegli Tipo di &gt; immagine &gt; 8 bit. Scegli Elabora &gt; Sottrai sfondo.</li>
	<li>Imposta la palla che rotola su 10.0. Controlla lo sfondo chiaro. Controllare il paraboloide scorrevole.</li>
	<li>Scegli Elabora &gt; migliora il contrasto. Imposta i pixel saturi su 0,1% per i trofozoiti o 0,3% per un gruppo di cellule e aggregati.</li>
	<li>Scegliete Immagine &gt; Regola &gt; soglia (predefinito &gt; bianco e nero). Si aprirà il processo Make Binary. Seleziona Predefinito e seleziona Sfondo nero (delle maschere binarie).</li>
	<li>Seleziona la soglia in modo aggressivo in modo che la maggior parte delle macchie di sfondo non siano visibili, ma sia visibile una parte di ciascuna ameba.</li>
	<li>Se il software di imaging ha invertito l'immagine e lo sfondo è bianco e l'ameba è nera, vai su Modifica &gt; Inverti per fissarla su uno sfondo nero e un'ameba bianca.</li>
	<li>Scegliere Processo&gt; Binario &gt; Chiudi, nel caso in cui le cellule abbiano un leggero spazio nella membrana esterna a causa dell'essere fuori fuoco o della motilità della cellula.</li>
	<li>Scegliete Elabora &gt; binario &gt; Riempi buchi. Rimuovi gli artefatti non amebani utilizzando gli strumenti di disegno delle forme e Modifica &gt; Riempi. Se, a questo punto, lo sfondo è bianco e l'ameba è nera, scegli Modifica &gt; Inverti. A questo punto, l'immagine dovrebbe rappresentare le immagini binarie nella Figura 2.</li>
	<li>Per registrare le dimensioni di ciascuna ameba, scegliere Analizza &gt; Analizza particelle. Dimensione del set: 10-Infinitiy, Circolarità: 0-1, Spettacolo: Niente. Selezionare Solo Visualizza risultati e Riepiloga.</li>
	<li>Salva i file CSV visualizzati. Scegliete File &gt; Salva con nome &gt; Tiff e modificate il nome in base alla specifica desiderata.</li>
</ol>4. Preparazione di file per microscopio per l'inseguimento (analisi della motilità)
<ol><li>Aprire il file del microscopio nel software di imaging. Si apriranno le opzioni di importazione dei bioformati.</li>
	<li>Nella finestra di dialogo, assicurati che siano soddisfatte le seguenti condizioni: Visualizzazione in pila; Visualizza con: Selection-Hyperstack. Per la gestione della memoria, selezionare Usa stack virtuale. Fare clic su OK.</li>
	<li>Si apriranno le opzioni della serie Bio-Formats. Scegli la serie necessaria. Se viene registrata una sola posizione alla volta, probabilmente ci sarà solo un'opzione qui. Fare clic su OK.</li>
	<li>Scegli Immagine &gt; Duplica. Da qui in poi, lavora solo sulla sezione duplicata del video invece di lavorare sul file originale. NOTA: Duplica la sezione del video che viene tracciata in quel momento. Per fare ciò, è necessario conoscere i fotogrammi che corrispondono ai minuti necessari per l'esperimento. Ad esempio, se si desidera tenere traccia dellaprima ora e scattare immagini ogni 24 secondi, dovrebbero esserci 150 fotogrammi nellaprima ora. Pertanto, la1a ora sarà i fotogrammi 1-150, la2a ora sarà 151-300 e così via.</li>
	<li>Scegli Tipo di immagine &gt; &gt; 8 bit. Scegli Elabora &gt; Sottrai sfondo. Imposta la palla che rotola su 10.0.</li>
	<li>Controlla lo sfondo chiaro. Controllare il paraboloide scorrevole. Scegli Elabora &gt; migliora contrasto e impostalo su 0,1%.</li>
	<li>Selezionare Tutte le sezioni x# (ad esempio, tutte le 150 sezioni). Deseleziona Normalizza. Scegliete Immagine &gt; Regola &gt; soglia (impostazione predefinita &gt; bianco e nero).</li>
	<li>Si aprirà il processo Make Binary. Seleziona Predefinito. Controlla lo sfondo nero (delle maschere binarie).</li>
	<li>Soglia in modo aggressivo, quindi la maggior parte delle macchie di sfondo non sono visibili, ma alcune parti dell'ameba sono visibili. A questo punto, se lo sfondo è bianco e l'ameba è nera, scegli Modifica &gt; Inverti. Lo sfondo dovrebbe essere nero e l'ameba dovrebbe essere bianca.</li>
	<li>Scegliere Elabora &gt; binario &gt; Chiudi. Selezionate Processo &gt; binario &gt; Riempi buchi (Fill Holes). Scegliete File &gt; Salva con nome &gt; Tiff e modificate il nome con la specifica desiderata. Il file è ora pronto per il tracciamento.</li>
</ol>5. Analisi della motilità attraverso il tracciamento
<ol><li>Dal software di imaging con il file tiff necessario per la traccia, vai su Plug-in &gt; Tracking &gt; Trackmate. Si aprirà la versione di Trackmate.</li>
	<li>Scegliere Successivo. Selezionare il rilevatore LoG dal menu a discesa del rilevatore. Impostare il diametro stimato del blob: 35,0 micron, soglia 1,0. Deseleziona Usa filtro mediano ed Esegui localizzazione sub-pixel.</li>
	<li>Fate clic su Anteprima in corrispondenza della prima, della parte centrale e della fine. Assicurati che tutte le amebe siano catturate da un cerchio viola e che i difetti di sfondo o gli artefatti non siano inclusi.</li>
	<li>Scegliere Successivo. Inizierà l'elaborazione e questo passaggio potrebbe richiedere alcuni minuti. Una barra di rilevamento nella parte superiore dello schermo indicherà la parte del processo completata.</li>
	<li>Scegliere Avanti quando richiesto. Nella soglia iniziale scegliere di nuovo Avanti senza selezionare alcun elemento. Selezionare Hyperstack Displayer quando si seleziona una visualizzazione. Scegliere Successivo.</li>
	<li>Imposta il filtro sui punti e scegli Avanti senza selezionare nulla. Seleziona un tracker; a tale scopo, selezionare LAP Tracker (anziché LAP Tracker semplice). Scegliere Successivo.</li>
	<li>Durante il collegamento da fotogramma a fotogramma, impostare la distanza massima su 40 μm. Sulla chiusura del segmento di binario, selezionare Consenti chiusura gap. Impostare la distanza massima a 100 μm e la distanza massima tra i fotogrammi a 4. Non selezionare alcun elemento per Suddivisione segmento traccia o Unione segmento traccia.</li>
	<li>Scegliere Successivo. L'esecuzione del tracciamento può richiedere molto tempo. Al termine, la finestra dovrebbe dire: Tracciamento fatto in x s in basso. Scegliere Successivo.</li>
	<li>Al termine del monitoraggio, selezionare nuovamente Avanti . Imposta filtri sulle tracce: seleziona il segno + in basso a sinistra per aggiungere un filtro per il numero di punti nelle tracce. Imposta il filtro su Sopra per almeno il 93% dei fotogrammi (ad esempio, 150 fotogrammi richiederebbero un minimo di 140 punti). NOTA: Alcune versioni di questo software richiedono la selezione dell'equivalente opposto, ad esempio Inferiore ad almeno il 7%, che può essere eseguita trascinando una riga a sinistra o a destra per raggiungere il numero desiderato.</li>
	<li>Scegliere Successivo. Verranno visualizzate le opzioni di visualizzazione. Assicurati che le tracce in ogni fotogramma non siano deformate o strane nel modo in cui si muove l'ameba prima di salvare il file XML di Trackmate o il file CSV di Trackmate.</li>
	<li>Se è necessario eliminare una traccia, fare clic su TrackScheme. TrackScheme mostrerà tutte le tracce e i punti di contatto per l'ameba in tutti i fotogrammi. NOTA: I possibili motivi per eliminare una traccia sono un'ameba che ha camminato dentro/fuori dal campo visivo durante la registrazione, una traccia è sagomata in modo inappropriato rispetto al percorso effettivo dell'ameba, o per qualche motivo, la traccia o l'ameba è un valore anomalo nei dati secondo i parametri sperimentali, ecc.</li>
	<li>Fare clic sull'ameba per evidenziare il punto verde sullo schermo e in Trackscheme il punto avrà un quadrato verde che lo circonda. Questo indicherà quale traccia o punto deve essere rimosso.</li>
	<li>Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla traccia che deve essere rimossa e selezionare Traccia intera. Premere il pulsante Elimina .</li>
	<li>Dopo aver esaminato tutte le tracce, salva il file di tracciamento facendo clic su Salva in basso a sinistra nel popup del software di tracciamento. Salva il file XML utilizzando il nome del video. Fare clic su Riprendi per tornare al popup del software di tracciamento.</li>
	<li>Fai clic su Tracce e seleziona Tracce a sinistra. Fai clic su Esporta in CSV e salva il file CSV.</li>
	<li>Se il foglio di calcolo non riconosce il file CSV risultante, eseguire la procedura seguente.<ol><li>Apri il file CSV salvato in Blocco note. Fare clic su Ctrl + A e Ctrl + C per copiare tutto il contenuto.</li>
		<li>Apri il foglio di calcolo e fai clic su Ctrl + V per incollarlo nel foglio di calcolo. Tutti i dati saranno in una cella.</li>
		<li>Con le celle con i dati ancora selezionati, vai su Dati &gt; Testo in colonne. Scegliere Delimitato &gt; successivo. Selezionate Virgola &gt; Successivo &gt; Fine. Salvare questo file come nuovo file CSV.</li>
	</ol></li>
	<li>Il CSV di tracciamento avrà molti parametri disponibili per l'analisi (Figura 3). Copiare e incollare i parametri desiderati in un nuovo file CSV (Figura 4) da analizzare. I parametri utilizzati qui sono descritti di seguito.<ol><li>Distanza totale percorsa: distanza totale percorsa da un'ameba in μm.</li>
		<li>Distanza massima percorsa: la distanza massima sul percorso di un'ameba dal suo punto di partenza - questo potrebbe non essere necessariamente il punto finale <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq01.jpg" style="margin: auto;"> Dove dij è la distanza da qualsiasi punto I a qualsiasi punto j sulla pista.</li>
		<li>Rapporto di confinamento: il rapporto di confinamento indica l'efficienza di un'ameba nell'allontanarsi dal suo punto di partenza: ha viaggiato in linea retta lontano dal suo punto di partenza (un valore vicino a 1) o è rimasta relativamente vicina al suo punto di partenza (un valore vicino a 0). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq02.jpg" style="margin: auto;"></li>
		<li>Velocità media della traccia: Velocità media dell'ameba sulla distanza totale percorsa in micron al secondo. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66268/66268eq03.jpg" style="margin: auto;"></li>
		<li>Spostamento della traccia: la distanza tra il punto iniziale di un'ameba e il punto finale in micron. NOTA: Tutti i parametri di analisi del software di imaging e le relative definizioni sono disponibili qui: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. Ricorda che ogni file salvato è un riepilogo delle tracce analizzate in quel momento. Per produrre un'analisi dei dati robusta, sarà necessario combinare in modo appropriato i risultati di più repliche, ore, ecc., come è adatto ai dati (Figura 5 e Figura 6).</li>
	</ol></li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Monitoraggio e quantificazione a lungo termine della motilità delle specie di Acanthamoeba

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<li>Crary, M. J., Walters, R., Shannon, P., Gabriel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+affecting+the+recovery+of+Acanthamoeba+trophozoites%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Variables affecting the recovery of Acanthamoeba trophozoites.</a> Pathogens. 10 (2), 221(2021).</li>
<li>imagej. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started">https://imagej.net/plugins/trackmate/tutorials/getting-started</a> (2024).</li>
<li>Cherstvy, A. G., Nagel, O., Beta, C., Metzler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-Gaussianity%2C+population+heterogeneity%2C+and+transient+superdiffusion+in+the+spreading+dynamics+of+amoeboid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Non-Gaussianity, population heterogeneity, and transient superdiffusion in the spreading dynamics of amoeboid cells.</a> Phys Chem Chem Phys. 20 (35), 23034-23054 (2018).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&frac14; Suoneria' s soluzione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BR0052G</td><td>Oxoid Ringers soluzione compresse. Segui le indicazioni per fare un quarto di forza invece di suonerie a piena forza.</td></tr><tr><td>10 &micro; L. pipetta</td><td>Eppendorf Research</td><td>3123000039</td><td>2 &micro; L-20 & micro; L singolo canale</td></tr><tr><td>10 &micro; L puntali per pipette</td><td>Neptune Scientific, San Diego, CA, USA</td><td>BT10.N</td><td>10 & micro; L Puntale barriera universale Piastra</td></tr><tr><td>a 48 pozzetti</td><td>Millipore Sigma,&nbsp;</td><td>Piastra a</td><td>pozzetti multipli trattata con TC CLS3548 Corning Corning: piastra in polistirene, pozzetti a fondo piatto, sterile, con coperchio</td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL (1 per ogni campione, 1 per ogni passaggio di 2 campioni)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Falcon 352098</td><td>Falcon 50 mL Provette per centrifuga coniche ad alta chiarezza, piastra</td></tr> a <tr><td>96 pozzetti</td><td>in polipropilene Millipore Sigma, Burlington, MA, USA</td><td>CLS3596</td><td>Piastra a pozzetti multipli trattata con TC Corning Costar: piastra in polistirene, pozzetti a fondo piatto, sterile, con coperchio</td></tr><tr><td>Acanthamoeba&nbsp; </td><td>American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA</td><td>ATCC 30461</td><td>Questo protocollo è stato verificato per ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 e PRA-411</td></tr><tr><td>Terreni di coltura axenic (AC6)</td><td>Prodotto in casa</td><td>n/a</td><td>Contenente 20 g di peptone biosato, 5 g di glucosio, 0,3 g di KH2PO4, 10 e micro; g di vitamina B12 e 1 bicchiere5 mg L-metionina per litro di acqua distillata deionizzata. Regolare il pH a 6,6-6,95 con 1 M NaOH e autoclavare a 121 gradi C per 20 minuti, conservare a temperatura ambiente per un massimo di 3 mesi.</td></tr><tr><td>Centrifuga e rotore appropriato</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>Sorvall ST 40R</td><td>Qualsiasi centrifuga e rotore equivalenti sono accettabili, purché siano in grado di centrifugare provette coniche da 50 mL a 500 x g per 5 minuti</td></tr><tr><td>Chemiotassi e strumento</td><td></td><td></td> di migrazione <td>Software gratuito basato su ImageJ, disponibile all'indirizzo https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</td></tr><tr><td>Emocitometro</td> <td>monousoBulldog Bio, Portsmouth, NH, USA</td><td>DHC-N01</td><td>Neubauer Emocitometro monouso a 2 chip migliorato, confezionato singolarmente, software ImageJ non pirogeno</td></tr><tr><td>con plug-in Trackmate (questo protocollo è stato scritto con Trackmate versione 6.0.2.)</td><td></td><td></td><td>Software gratuito sviluppato dal National Institutes of Health, disponibile all'indirizzo imagej.net. Plug-in Trackmate disponibile presso https://imagej.net/plugins/trackmate/</td></tr> <tr><td>Microscope, preferibilmente con tavolino mobile automatizzato</td><td>Nikon, Tokyo, Giappone</td><td></td><td>In questo studio è stato utilizzato un microscopio Nikon Eclipse Ti-U e il tavolino mobile automatizzato è stato utilizzato per poter registrare immagini in più pozzetti alla volta.</td></tr><tr><td>Software NIS-Elements</td><td>Pipetta</td> sierologica Nikon <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH, USA</td><td>BrandTech 26331</td><td>BrandTech accu-jet pro Controller per pipette per pipette</td></tr><tr><td>sierologiche</td><td>VWR</td><td>5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088</td><td>Pipetta sierologica VWR, non pirogena</td></tr><tr><td>Cella a flusso sterile in alluminio</td><td>Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA</td><td>FC 81-AL</td><td>Cella di flusso a trasmissione a canale singolo in alluminio anodizzato con impronta della piastra a 96 pozzetti per l'uso con un microscopio invertito</td></tr><tr><td>Palloni T75 VWR</td><td>, Radnor, PA, USA</td><td>734-2316</td><td>VWR Pallone per colture tissutali, 182,5 cm, Trattamento superficiale, Tappo di chiusura, Sterile</td></tr></tbody></table>

quantificazione di acanthamoeba spp. motilità

Quantification of Acanthamoeba spp. Motility

Per raggiungere il successo utilizzando questo metodo, ci sono diversi elementi cruciali da considerare. Il primo è la configurazione fisica dell'ameba e del microscopio, il secondo è l'utilizzo corretto del software di imaging e il terzo è l'esportazione e l'analisi dei dati di imaging in modo significativo.
Prima di iniziare la registrazione microscopica, è fondamentale assicurarsi che l'ameba sia correttamente messa a fuoco sul tavolino del microscopio (Figura 1). Piuttosto che concentrarsi sull'ameba sul piano Z ottimale per i singoli dettagli, qui è ideale vederli leggermente sfocati in modo che diventino punti neri solidi invece del loro stato traslucido quando visti in dettaglio. Visualizzarli in questo modo consentirà al software di imaging e al software di tracciamento di trovare ogni singola ameba molto più facilmente quando il file viene convertito in binario (Figura 2). Sapere qual è l'obiettivo nel software di imaging, ovvero che ogni ameba appaia come un cerchio bianco ben definito, può aiutare il lettore a trovare la messa a fuoco corretta quando scatta le immagini originali in campo chiaro. Quindi, con ogni cerchio chiaramente definito, il software di tracciamento sarà in grado di tracciare correttamente la motilità e raccogliere le metriche di motilità individuali per ciascuna ameba.
Dopo aver seguito le istruzioni dettagliate nel protocollo sopra elencato per il software di imaging e il software di tracciamento e aver fatto riferimento al video associato per assistere nei primi passaggi cruciali dell'utilizzo del software di imaging, è il momento di esportare i dati del software di imaging per la quantificazione e l'analisi dei dati. L'output grezzo del software di tracciamento sarà simile a quello mostrato nella Figura 3. Qui, è importante verificare che il numero di spot nelle tracce esportate sia corretto per ciò che ci si aspetta (ad esempio, se si chiede che il 93% dei fotogrammi sia presente in ogni traccia e si hanno 100 fotogrammi totali nel video, ogni traccia esportata dovrebbe avere un numero maggiore o uguale a 93 spot). Se i punti non soddisfano i requisiti, potrebbe essere necessario tornare indietro attraverso i passaggi del software di tracciamento per assicurarsi che i parametri richiesti siano stati impostati correttamente.
Dall'esportazione non elaborata, iniziare a creare il foglio di analisi dei dati (Figura 4). È importante ricordare che ogni traccia rappresenta una singola ameba all'interno di una singola replica. Pertanto, come mostrato nella Figura 4, Figura 5 e Figura 6, è necessario calcolare la media di tutte le tracce per un set di fotogrammi o un punto temporale (Figura 4) e questo processo deve essere eseguito per ogni set di fotogrammi o punto temporale in un'intera serie (ad esempio, se vengono riprese un totale di 3 ore di video e i punti dati vengono divisi per l'ora, quindi ci saranno tre set di fotogrammi/ora da analizzare per replica, Figura 5). Infine, da questa combinazione di medie in ogni set di frame in ogni replica, i dati medi devono essere combinati da ogni replica in un unico spazio in modo che i dati di più repliche possano essere analizzati per determinare la media reale e la deviazione standard per punto temporale (Figura 6).
Le medie di ciascuna replica verranno utilizzate per l'analisi dei dati e la media combinata e la deviazione standard o l'errore standard di tutte le repliche verranno utilizzate per la rappresentazione grafica (come mostrato in un esempio nella Figura 7). Se si analizzano i dati come abbiamo fatto qui, che sono più campioni seguiti su più punti temporali, è più appropriato analizzarli utilizzando un'ANOVA di misura ripetuta a 2 vie con un test di Tukey post hoc. Questo ci permette di determinare le differenze tra i campioni in ogni punto temporale e anche di determinare le differenze all'interno di ciascun campione nel tempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig01.jpg"> Figura 1: L'ameba appare come forme scure opache nella microscopia a campo chiaro. Ingrandita l'immagine rappresentativa dell'ameba con ingrandimento 4x, leggermente sfocata per apparire come occhiaie solide. Barra della scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig02.jpg"> Figura 2: Ameba ripresa al microscopio in campo chiaro convertita in binaria e tracciata. L'ameba con ingrandimento 4x, in campo chiaro (a sinistra), è stata convertita in binaria con gli artefatti rimossi (al centro) e, dopo l'inseguimento, con tracce selezionate visualizzate (a destra). Riga superiore: un intero pozzetto ripreso unendo insieme 4 immagini, barra di scala = 1000 μm. Riga inferiore: la dimensione di una singola immagine prima della cucitura, barra della scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig03.jpg"> Figura 3: L'output dell'analisi immediata dei dati del software di imaging e tracciamento contiene un'ampia varietà di tipi di dati. L'output rappresentativo del tracciamento è mostrato nella Figura 2, che è un singolo video. Prendere nota dei numeri di traccia (freccia rossa) che indicano che il software di tracciamento ha rimosso correttamente le tracce che non erano allineate con i parametri. In questo esempio, solo 71 delle 5385 tracce identificate sono allineate ai parametri. Questo rapporto è normale, date linee guida così rigide. Questo numero di tracce è anche in linea con il numero di amebe utilizzate in questo protocollo (ad esempio, se una piastra da 96 pozzetti viene seminata con 200 μL di 7,5 x 103 CFU/mL per pozzetto, allora ci si dovrebbe aspettare circa 1.500 amebe nel pozzetto e all'incirca altrettante visibili in un campo visivo di 4 punti. Probabilmente ci saranno molte più tracce di quante siano le amebe poiché l'ameba cammina dentro e fuori dal campo visivo, generando nuove tracce). Questo numero di traccia è di nuovo evidente nella Figura 2, dove sono visibili solo poche tracce rispetto a un gran numero di punti. Controllare sempre il numero di punti nel binario (riquadro rosso) per assicurarsi che siano incluse solo le lunghezze corrette del binario. Ad esempio, qui, includiamo più del 93% dei fotogrammi e c'erano 127 fotogrammi in questa sezione, quindi tutti i numeri di spot dovrebbero essere superiori a 118. Evidenziate in giallo sono le misure menzionate nel protocollo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig04.jpg"> Figura 4: Dati riorganizzati secondo necessità dopo l'output iniziale dei dati. Organizzazione dei dati desiderati dopo l'esportazione. (A) Le misurazioni pertinenti scelte per la quantificazione sono state copiate dall'esportazione del software di tracciamento (Figura 3) e incollate in un nuovo foglio di calcolo. (B) Dopo che le misurazioni desiderate sono state organizzate nel nuovo foglio di calcolo, dovrebbe essere calcolata la media di ciascuna traccia. Pertanto, in questo esempio rappresentativo, la distanza totale, la distanza massima, il confinamento, la velocità media e lo spostamento di ogni traccia utilizzabile in questo singolo video sono stati mediati a un numero singolare per ogni misurazione. Si noti ancora una volta che un totale di 71 tracce ha soddisfatto i parametri per i fotogrammi 1-127. Probabilmente ci sarà un numero diverso di tracce adatte da ogni video o set di fotogrammi analizzato, come evidente nella Figura 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig05.jpg"> Figura 5: Fotogrammi sequenziali impostati per l'analisi di un'intera serie di immagini o video. Questa è un'immagine rappresentativa dell'aggiunta di video sequenziali all'analisi dei dati. Supponendo che i fotogrammi 1-127 costituiscano l'ora 1 del video (qui, 1 ora è composta dallo scattare un'immagine una volta ogni 28 s). I fotogrammi 128-254 saranno l'ora 2 del video e i fotogrammi 255-381 saranno l'ora 3 del video. Combinare i dati esportati (come è stato esportato nella Figura 3) da tutte le ore in un unico foglio per lavorare tutti in una volta. Come è stato fatto nella Figura 4, verrà calcolata la media dei dati di tutte le tracce utilizzabili per ogni set di fotogrammi/h. Tutto ciò che è riportato nella Figura 5 è costituito dai dati di una replica o di un campione. Se sono presenti 3 repliche, ci saranno 3 schede di fogli di calcolo separate disposte in modo identico e i dati di queste verranno inseriti in una nuova scheda, come illustrato nella Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig06.jpg"> Figura 6: Dati compositi di tutte le ameba in ciascun set di telai utilizzati per rappresentare una singola replica. (A) Tutte le medie di ciascun fotogramma di cui alla Figura 5 devono essere raccolte in una posizione centrale in modo che l'analisi finale dei dati possa essere completata. In questa immagine rappresentativa, vengono mostrate le medie della distanza totale dei primi tre set di fotogrammi (o ore). Questa operazione deve essere ripetuta per ogni campione/condizione/replica in esecuzione. Quindi, è necessario calcolare la media delle medie di ciascun campione di ciascun set di fotogrammi (riquadro giallo). Questo è il punto dati finale da cui è possibile calcolare la deviazione standard e l'errore standard. Le medie individuali di ciascun campione (qui, i numeri in B3, B4 e B5 per il campione di distanza totale 1; C3, C4 e C5 per il campione di distanza totale 2, ecc.) verrà utilizzato per eseguire l'analisi statistica. Questo processo verrà ripetuto per tutte le misurazioni richieste (distanza massima, confinamento, velocità media, spostamento, ecc.) (B) Per fare una rappresentazione grafica della quantificazione, utilizzare i numeri nella casella gialla come punti dati da utilizzare per il grafico finale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66268/66268fig07.jpg"> Figura 7: Dati grezzi sulla motilità per ATCC 30461 e ATCC 50370. I dati grezzi (qui rappresentati come media ± SE per ogni ora) sono stati precedentemente raccolti e non pubblicati per studi precedenti 18,19. Questa quantificazione della motilità dimostra che queste due amebe sono simili nelle loro prime 6 ore di motilità (misurata dalla distanza totale in micron percorsa in quell'ora) in 1/4 della soluzione di Ringer su una superficie di vetro. Ogni punto temporale rappresenta tre repliche separate, ciascuna composta da 20-200 tracce di ameba. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66268/66268fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Quantificazione di Acanthamoeba spp. Motilità

Acanthamoeba keratitis is a severe ocular infection that poses treatment challenges and can lead to blindness. Despite its ubiquity and potential ...

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Biology

Biologia

Il saggio traccia phagokinetic motilità è un metodo utilizzato per valutare il movimento delle cellule. Specificamente, il saggio misura chemochinesi (motilità cellulare casuale) nel tempo in modo quantitativo. Il saggio sfrutta la capacità delle cellule di creare una traccia misurabile della loro movimento oro colloidali rivestite coprioggetto.

Una valutazione quantitativa della migrazione cellulare con il Test Phagokinetic motilità Traccia

Fonte: Morales-Soto, N. et. al., Preparazione, imaging e quantificazione dei saggi di motilità della superficie batterica. J. Vis. Exp. (2015)Questo video mostra un test di sciamatura utilizzando batteri che esprimono la proteina fluorescente verde per osservare la motilità superficiale sull'agar molle. L'imaging time-lapse cattura l'espansione coordinata e la formazione dei viticci, evidenziando la motilità della superficie batterica.

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