Name: Studio comparativo di matrici di membrana basale per il mantenimento di cellule staminali umane e la generazione di organoidi intestinali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Scopri come integrare modelli in vitro e in silico per accelerare la scoperta di farmaci utilizzando organoidi e microfluidica. Questo metodo migliora la fedeltà fisiologica e la riproducibilità dei sistemi avanzati.

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Gli autori riconoscono la formazione precedente e le raccomandazioni generali riguardanti l'inizio del lavoro su hiPSC e organoidi da parte dei dottori Christina Pacak, Silveli Susuki-Hatano e Russell D'Souza. Ringraziano la dottoressa Chelsey Simmons per la sua guida nell'utilizzo dei sistemi di idrogel per il lavoro di coltura cellulare in vitro . Inoltre, gli autori desiderano ringraziare i dottori Christine Rodriguez e Thomas Allison di STEMCELL Technologies per la loro guida sulla coltura hiPSC. Gli autori ringraziano anche TheWell Bioscience per aver coperto i costi di pubblicazione.

Confronto di matrici per la generazione efficiente di organoidi intestinali umani da iPSC

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<li>Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix at a glance.</a> J Cell Sci. 123, Pt 24 4195-4200 (2010).</li>
<li>Hinz, B., Gabbiani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis%3A+Recent+advances+in+myofibroblast+biology+and+new+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22F1000+Biol+Rep%22%5BJournal%5D)">Fibrosis: Recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives.</a> F1000 Biol Rep. 2, 78(2010).</li>
<li>Pickup, M. W., Mouw, J. K., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+modulates+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix modulates the hallmarks of cancer.</a> EMBO Rep. 15 (12), 1243-1253 (2014).</li>
<li>Rozario, T., DeSimone, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extracellular+matrix+in+development+and+morphogenesis%3A+A+dynamic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The extracellular matrix in development and morphogenesis: A dynamic view.</a> Dev Biol. 341 (1), 126-140 (2010).</li>
<li>Even-Ram, S., Artym, V., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+control+of+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix control of stem cell fate.</a> Cell. 126 (4), 645-647 (2006).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Tran, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+extracellular+matrix+directs+trans-differentiation+of+mesenchymal+stem+cells+and+formation+of+salivary+gland-like+organoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Organ-specific extracellular matrix directs trans-differentiation of mesenchymal stem cells and formation of salivary gland-like organoids in vivo.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 306(2022).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. 585 (7826), 574-578 (2020).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+matrices+for+intestinal+stem+cell+and+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture.</a> Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).</li>
<li>Gjorevski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+geometry+drives+deterministic+organoid+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue geometry drives deterministic organoid patterning.</a> Science. 375 (6576), (2022).</li>
<li>Heo, J. H., Kang, D., Seo, S. J., Jin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+the+extracellular+matrix+for+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Engineering the extracellular matrix for organoid culture.</a> Int J Stem Cells. 15 (1), 60-69 (2022).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+Modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 1247125(2014).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+single+Lgr5%2B+liver+stem+cells+induced+by+Wnt-driven+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration.</a> Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).</li>
<li>Greenlee, A. R., Kronenwetter-Koepel, T. A., Kaiser, S. J., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Matrigel+and+gelatin+substrata+for+feeder-free+culture+of+undifferentiated+mouse+embryonic+stem+cells+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Comparison of Matrigel and gelatin substrata for feeder-free culture of undifferentiated mouse embryonic stem cells for toxicity testing.</a> Toxicol In Vitro. 19 (3), 389-397 (2005).</li>
<li>Geltrex LDEV-Free, HESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix User Guide (Pub.No. MAN0007336 3.0. Fisher Scientific. , Available from: 
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<li>biotechne R&D Systems. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultrex+Stem+Cell+Qualified+Reduced+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22biotechne+R%26D+Systems%22%5BJournal%5D)">Cultrex Stem Cell Qualified Reduced Growth Factor.</a> biotechne R&D Systems. , (2024).</li>
<li>VitroGel Organoid Protocol. TheWell Bioscience. , Available from: 
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<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Henderson, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preimplantation+human+embryos+and+embryonic+stem+cells+show+comparable+expression+of+stage-specific+embryonic+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Preimplantation human embryos and embryonic stem cells show comparable expression of stage-specific embryonic antigens.</a> Stem Cells. 20 (4), 329-337 (2002).</li>
<li>Haruna, N. F., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+dynamic+biophysical+properties+of+a+tunable+hydrogel+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cytol+Tissue+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the dynamic biophysical properties of a tunable hydrogel for 3D cell culture.</a> J Cytol Tissue Biol. 7, 30(2020).</li>
<li>Cherne, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+hydrogel%2C+VitroGel+ORGANOID-3%2C+improves+immune+cell-epithelial+interactions+in+a+tissue+chip+co-culture+model+of+human+gastric+organoids+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A synthetic hydrogel, VitroGel ORGANOID-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells.</a> Front Pharmacol. 12, 707891(2021).</li>
<li>Stewart, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+intestinal+stiffness+and+associations+with+fibrosis+in+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of intestinal stiffness and associations with fibrosis in human inflammatory bowel disease.</a> PLoS One. 13, e0200377(2018).</li>
<li>Hernandez-Gordillo, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+synthetic+matrices+for+in+vitro+culture+of+primary+human+intestinal+enteroids+and+endometrial+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fully synthetic matrices for in vitro culture of primary human intestinal enteroids and endometrial organoids.</a> Biomaterials. 254, 120125(2020).</li>
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<li>Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+alternatives+to+Matrigel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mater%22%5BJournal%5D)">Synthetic alternatives to Matrigel.</a> Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).</li>
</ol>

Il Dr. John Huang è fondatore e CEO di TheWell Bioscience.

La selezione del microambiente ottimale per il lavoro con cellule staminali e organoidi è un primo passo fondamentale quando si utilizzano queste piattaforme per un'ampia gamma di applicazioni. I nostri risultati rappresentativi mostrano che la matrice 4-XFO3, in combinazione con una maggiore concentrazione di fattori di crescita, porta a organoidi più grandi, suggerendo che le proprietà fisiche degli idrogel privi di xeno possono essere sfruttate per ottimizzare la generazione di organoidi utilizzando questi sistemi. È stato precedentemente dimostrato che le caratteristiche uniche della matrice extracellulare (ECM) sono strettamente intrecciate con l'identità delle cellule all'interno dell'organo12. Poiché le cellule percepiscono le forze esterne attraverso le integrine e altri recettori, le caratteristiche meccaniche della ECM influenzano profondamente le cellule staminali e, in risposta, le cellule staminali possono generare forze interne12. Le interazioni tra le cellule staminali e il loro microambiente sono fondamentali per avviare diverse vie di segnalazione12. Inoltre, è stato dimostrato che la MEC può fungere da serbatoio per immagazzinare e rilasciare fattori di crescita e altre molecole di segnalazione che influenzano il comportamento cellulare. Pertanto, i nostri risultati rappresentativi e decenni di ricerca sottolineano l'importanza di considerare gli aspetti biochimici e fisici del microambiente cellulare nativo e le proprietà dei tessuti nella selezione dei sistemi di matrici per le indagini in vitro 29,30.
Attraverso il protocollo sono stati spiegati diversi passaggi critici e raccomandazioni per avvisare gli utenti di potenziali problemi e modi per evitarli. Tuttavia, in questi metodi vengono presentati due passaggi critici che sono fondamentali per implementare con successo questo protocollo. In primo luogo, il controllo di marcatori specifici associati alla popolazione di cellule staminali è fondamentale per determinare il sistema di rivestimento ottimale per mantenere la popolazione di cellule staminali pronta per un'efficiente differenziazione controllata. Allo stesso modo, confermare l'espressione dei marcatori associati a ciascuna fase di differenziazione è essenziale per decidere quando procedere alla fase successiva. Questo protocollo fornisce una linea guida generale per quanto riguarda il tempo minimo richiesto in ogni fase. Tuttavia, il momento ottimale in ogni fase varierà a seconda delle diverse linee cellulari e delle condizioni sperimentali (ad esempio, genotipo, rigidità). Pertanto, la caratterizzazione di più marcatori stadio-specifici è l'approccio migliore per migliorare l'efficienza della generazione di hIO.
Il secondo passo critico è stato l'incorporazione di una maggiore concentrazione di fattori di crescita quando si utilizza il sistema Matrix 4-XF privo di xeno, che è della massima importanza. Un limite frequentemente evidenziato dei sistemi biomateriali privi di xeno è la mancanza di fattori di crescita31. Tuttavia, questa debolezza può diventare un punto di forza: il pieno controllo dei fattori di crescita nei sistemi per migliorarne la riproducibilità. Sebbene questo protocollo descriva l'utilizzo di un kit di integrazione di terreni e fattori di crescita disponibile in commercio, la stessa logica può essere utilizzata quando si realizzano internamente i terreni completi con i singoli componenti. Il rapporto specifico idrogel/terreno guida quanto più alta deve essere la concentrazione dei fattori di crescita; Ad esempio, un rapporto 2:1 potrebbe richiedere una concentrazione 3x di fattori di crescita per ottenere una concentrazione rappresentativa del terreno completo standard utilizzato. Il pieno controllo dei fattori di crescita presenti nel sistema è utile per rispondere a domande meccanicistiche ed evitare problemi normativi per molte applicazioni.
Le fasi di elaborazione delle immagini descritte nel passaggio 3 sono limitate dalla qualità delle immagini e dal tipo di immagini acquisite. Potrebbe essere necessario perfezionarlo per soddisfare i requisiti specifici di ogni tipo di immagine e qualità. Tuttavia, le fasi generali del processo e un campione di codice MATLAB del framework di base per l'analisi delle dimensioni degli organoidi da immagini in campo chiaro aiutano a definire un flusso di lavoro che può essere ulteriormente ottimizzato ed espanso. Inoltre, l'accesso a un microscopio a campo chiaro è più comune rispetto ad altri tipi di microscopi. Sebbene la mancanza di accesso e familiarità con MATLAB possa limitare l'uso di questo codice, le fasi generali del processo sono compatibili con software open source come Fiji di Image J. La sola dimensione dell'organoide non è una metrica consigliata per valutare la maturazione; si incoraggia a seguire una valutazione di marcatori specifici rappresentativi dell'organo bersaglio; alcuni di questi marcatori per il tessuto intestinale sono inclusi nella Tabella 4. La Figura 6 mostra un esempio di colorazione in immunofluorescenza di interi organoidi con la molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM), che è localizzata sulla superficie esterna (basolaterale) degli organoidi. Mentre l'EpCAM è stato visualizzato negli organoidi coltivati in tutti i sistemi ECM, c'erano differenze nelle dimensioni di questi organoidi. Pertanto, le informazioni sulle dimensioni degli organoidi aiutano a ottimizzare le condizioni di coltura. Inoltre, negli studi di risposta ai farmaci, la dimensione dell'organoide funge da metrica della risposta al composto testato; Le variazioni di dimensioni possono riflettere l'efficacia o la tossicità dei composti testati. È importante sottolineare che la generazione di più lotti di organoidi con dimensioni standardizzate è una sfida attuale nel campo, ma è una metrica importante della riproducibilità sperimentale in modo che i risultati possano essere confrontati tra diversi esperimenti o laboratori. Nel complesso, un flusso di lavoro automatizzato che consente l'estrazione di informazioni importanti sugli organoidi da immagini in campo chiaro è uno strumento vantaggioso per molti ricercatori.
Entrambi i sistemi, matrici di origine animale e idrogel privi di xeno, hanno i loro vantaggi e svantaggi. La matrice 2-AB che porta a un minor numero di rilasci di sferoidi durante lo stadio MH rispetto alle altre matrici di origine animale potrebbe derivare da variazioni da lotto a lotto, una caratteristica ampiamente nota delle matrici di derivazione animale disponibili in commercio. È importante notare che la concentrazione dei sistemi ECM disponibili in commercio varia; Ad esempio, i fattori di diluizione nelle schede tecniche dei prodotti sono stati utilizzati per preparare le soluzioni di rivestimento, il che potrebbe portare a concentrazioni leggermente diverse nel caso delle matrici di origine animale. Queste differenze nella concentrazione proteica possono avere un impatto significativo sulla differenziazione, portando a variazioni nell'efficienza di differenziazione quando si utilizza lo stesso prodotto da lotti diversi. Per scegliere tra questi sistemi, considerare fattori quali obiettivi sperimentali specifici, considerazioni etiche e requisiti normativi. Ad esempio, nei casi di confronto dei risultati sperimentali in vitro con un modello animale murino per rispondere a domande di biologia del tumore e del cancro, l'utilizzo di matrici derivate dal topo EHS Engelbreth-Holm Swarm può essere un'ottima scelta. Inoltre, poiché prodotti come Matrigel sono stati utilizzati per decenni, ci sono molti protocolli, dati e riferimenti. Tuttavia, l'utilizzo di matrici xeno-free ben definite che consentono la personalizzazione delle proprietà fisiche e chimiche potrebbe essere un'opzione più adatta quando la domanda di ricerca è associata a malattie o terapie umane. Inoltre, la maggior parte dei sistemi di idrogel privi di xeno sono progettati per soddisfare gli standard normativi, il che li rende una scelta adatta per la ricerca che richiede il rispetto delle buone pratiche di fabbricazione (GMP) o di altre linee guida normative.
In sintesi, mentre le matrici di origine animale sono state ampiamente utilizzate per il mantenimento delle iPSC e la generazione di organoidi grazie alla loro biocompatibilità, i sistemi idrogel privi di xeno offrono vantaggi in termini di riproducibilità, economicità, conformità normativa e considerazioni etiche. La scelta tra i due dipende dalle esigenze specifiche della ricerca o dell'applicazione clinica. I sistemi di idrogel privi di xeno stanno guadagnando popolarità come alternativa più versatile e sostenibile in grado di supportare l'utilizzo di organoidi e sistemi microfisiologici per la rosa preclinica di candidati terapeutici. Questa applicazione può migliorare significativamente lo sviluppo precoce di farmaci e aiutare ad affrontare le attuali sfide della traduzione clinica nell'industria farmaceutica.

La matrice extracellulare (ECM) è un componente dinamico e multifunzionale dei tessuti che svolge un ruolo centrale nella regolazione del comportamento e dello sviluppo cellulare. Essendo una rete complessa, fornisce supporto strutturale, ligandi adesivi cellulari1 e immagazzinamento di fattori di crescita e citochine che regolano la segnalazione cellulare. Ad esempio, durante la guarigione delle ferite, la MEC funge da impalcatura per le cellule in migrazione e da serbatoio di fattori di crescita coinvolti nella riparazione dei tessuti2. Allo stesso modo, la disregolazione nella MEC può portare ad un aumento della gravità di varie malattie come la fibrosi e il cancro 3,4. Durante lo sviluppo embrionale, la MEC guida la morfogenesi dei tessuti. Ad esempio, nello sviluppo del cuore, i componenti della MEC svolgono un ruolo nella creazione della corretta architettura e funzione del tessuto cardiaco5. Oltre un decennio di ricerca ha dimostrato che la rigidità del microambienteda sola 6,7 può controllare la specifica del lignaggio delle cellule staminali. Pertanto, non sorprende che durante la differenziazione cellulare in vitro, la ECM influenzi il destino delle cellule staminali fornendo segnali per la differenziazione.
Gli organoidi possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Per generare con successo gli organoidi è necessario partire da una linea iPSC correttamente caratterizzata. Tuttavia, la mancanza di segnali fisiologici nei materiali classici per colture cellulari ostacola l'efficiente differenziazione delle iPSC e la generazione di organoidi. Inoltre, recenti ricerche hanno sottolineato l'importanza della composizione della matrice extracellulare (ECM), delle interazioni tra le cellule e la ECM8, nonché dei segnali meccanici e geometrici 9,10,11 nel contesto dell'espansione e del differenziamento degli organoidi12. L'avanzamento della tecnologia degli organoidi attraverso il miglioramento della riproducibilità comporterà l'incorporazione di segnali fisici e chimici specifici del tessuto.
Gli organoidi mirano a ricapitolare il tessuto nativo all'interno di un microambiente fisiologicamente simile. La scelta di un sistema ECM che imiti fedelmente l'ECM del tessuto nativo è fondamentale per ottenere una rilevanza fisiologica per quanto riguarda il comportamento, la funzione e la risposta delle cellule agli stimoli13. La scelta dei componenti della ECM può influenzare la differenziazione delle cellule staminali in tipi cellulari specifici all'interno dell'organoide. Diverse proteine della ECM e le loro combinazioni possono fornire indizi che guidano il destino cellulare14. Ad esempio, gli studi hanno dimostrato che l'utilizzo di componenti specifici della MEC può promuovere la differenziazione delle cellule staminali intestinali in tipi di cellule intestinali mature, dando vita a organoidi intestinali fisiologicamente rilevanti15. Sebbene gli organoidi siano uno strumento prezioso durante la modellazione delle malattie e i test farmacologici, la selezione di un sistema ECM appropriato è fondamentale per questa applicazione. Un sistema ECM appropriato può migliorare l'accuratezza della modellazione della malattia creando un microambiente che assomiglia al tessuto interessato16. Inoltre, la MEC tessuto-specifica può aiutare a generare organoidi che ricapitolano meglio i fenotipi associati alla malattia e le risposte ai farmaci17. L'ottimizzazione del sistema ECM utilizzato nella differenziazione degli organoidi è fondamentale per ottenere i risultati di differenziazione desiderati.
I sistemi di membrane basali disponibili in commercio derivati da fonti animali di ECM (ad esempio, Matrigel, Cultrex) e idrogel privo di xeno (ad esempio, VitroGel) sono ampiamente utilizzati nella ricerca su iPSC e organoidi. Le aziende che li commercializzano e i ricercatori che li utilizzano hanno elaborato molte istruzioni per i loro prodotti e applicazioni specifici nel corso degli anni. Molte di queste istruzioni sono servite come guida per la generazione di questo protocollo. Inoltre, i benefici e le battute d'arresto associati alle loro proprietà intrinseche sono stati notati individualmente da molti 18,19,20,21. Tuttavia, non esiste un flusso di lavoro sistematico che guidi la selezione dei sistemi ottimali per il lavoro con iPSC e organoidi. In questo caso, viene fornito un flusso di lavoro per valutare sistematicamente l'equivalenza dei sistemi ECM provenienti da varie fonti per il lavoro con iPSC e organoidi. Questo è uno studio comparativo del mantenimento di due diverse linee di iPSC umane (hiPSC) e della generazione di organoidi intestinali umani (hIO) in quattro diverse matrici: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Per la coltura di organoidi, sono state utilizzate quattro versioni di VitroGel a matrice priva di xeno precedentemente ottimizzate per la coltura di organoidi: ORGANOID 1 (Matrix 4-O1), ORGANOID 2 (Matrix 4-O2), ORGANOID 3 (Matrix 4-O3), ORGANOID 4 (Matrix 4-O4). Inoltre, sono state utilizzate matrici di origine animale ottimizzate per organoidi: Matrigel High Concentration (Matrix 1-ABO) e Cultrex Type 2 (Matrix 3-ABO). Sono stati utilizzati terreni di coltura di cellule staminali disponibili in commercio (mTeSR Plus) e kit di differenziazione degli organoidi (STEMdiff intestinal organoid kit). Questo protocollo combina le istruzioni individuali dei produttori dei prodotti con le esperienze di laboratorio per guidare il lettore verso un'ottimizzazione di successo dell'ECM per il loro specifico lavoro iPSC e organoide. Nel complesso, questo protocollo e i risultati rappresentativi sottolineano l'importanza di selezionare il microambiente ottimale per il lavoro sulle cellule staminali e la differenziazione degli organoidi.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 24 pozzetti (trattata con coltura, sterile)</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>37 gradi C bagno d'acqua</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012931</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634</td><td></td></tr><tr><td>Risciacquo antiaderente Solutio</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>Armadio di sicurezza biologica (BSC)</td><td>Labconco&nbsp;</td><td>Microscopio</td><td></td></tr><tr><td>logico a campo chiaro</td><td>Echo Rebel</td><td>REB-01-E2</td><td></td></tr><tr><td>BXS0116</td><td>ATCC</td><td>ACS-1030</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga con controllo della temperatura (4 gradi; Capacità C)</td><td>ThermoScientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche, 15 mL, sterili</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche, 50 mL, sterili</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME, Tipo 2</td><td>Bio-techne</td><td>3533-005-02</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex Stem Cell Qualified RGF BME&nbsp;</td><td>Bio-techne</td><td>3434-010-02</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (senza Ca++ e Mg++)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>GeltrexSenza LDEV, qualificato hESC Riduce il fattore di crescita</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>A14133-02</td><td></td></tr><tr><td>Integratore GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore cellulare Guava Muse o un'altra apparecchiatura per citometria a flusso (opzionale)</td>Soluzione tampone HEPES <td>Luminex</td><td>0500-3115</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Heralcell Vios Incubatore per colture cellulari (37 ° ... C, 5% CO2)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>51033775</tr><tr><td>JMP Software</td><td>SAS Institute</td><td>JMP 16</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks, Inc</td><td>R2022b</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Matrice a membrana basale senza LDEV</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>356231</tr><tr><td>Matrigel Matrix Alta Concentrazione (HC), Fattore di Crescita Ridotto (GFR)</td><td>Senza LDEV Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>354263</tr><tr><td>mTeSR Plus Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>Nunclon Delta piastra a 24 pozzetti trattata in superficie</td><td>Thermo Scientific</td><td>144530</td><td></td></tr><tr><td>PE Topo Anti-umano CD326 (EpCAM)</td><td>BD Pharmingen</td><td>566841</td><td></td></tr><tr><td>PE Topo Anti-umano CDX2&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>563428</td><td></td></tr><tr><td>PE Topo Anti-umano FOXA2</td><td>BD Pharmingen</td><td>561589</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy 5.5 Topo Anti-umano SSEA4&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561565</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>SCTi003-A</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>200-0510</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (10 mL)&nbsp;</td><td>Pipette</td> sierologiche Fisher Scientific <td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>(5 ml)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Terreno di crescita di organoidi intestinali STEMCELL</td><td>Technologies</td><td>5145</td><td></td></tr><tr><td>Kit di organoidi intestinali STEMdiff</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5140</td><td></td></tr><tr><td>Matrice di idrogel Vitrogel</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM01</td><td></td></tr><tr><td>Kit di scoperta di organoidi VitroGel</td><td>TheWell Bioscience</td><td>VHM04-K</td><td></td></tr></tbody></table>

studio comparativo di matrici di membrana basale per il mantenimento di cellule staminali umane e la generazione di organoidi intestinali

Comparative Study of Basement-Membrane Matrices for Human Stem Cell Maintenance and Intestinal Organoid Generation

La matrice extracellulare (ECM) svolge un ruolo fondamentale nel comportamento e nello sviluppo cellulare. Gli organoidi generati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) sono sotto i riflettori di molte aree di ricerca. Tuttavia, la mancanza di segnali fisiologici nei materiali classici per colture cellulari ostacola un'efficiente differenziazione delle iPSC. L'integrazione della MEC disponibile in commercio nella coltura di cellule staminali fornisce spunti fisici e chimici utili per il mantenimento delle cellule. I prodotti di membrana basale di origine animale disponibili in commercio sono composti da proteine ECM e fattori di crescita che supportano il mantenimento cellulare. Poiché la ECM possiede proprietà tessuto-specifiche in grado di modulare il destino cellulare, le matrici prive di xeno vengono utilizzate per accelerare la traduzione verso gli studi clinici. Sebbene le matrici disponibili in commercio siano ampiamente utilizzate nel lavoro su hiPSC e organoidi, l'equivalenza di queste matrici non è stata ancora valutata. Qui, è stato condotto uno studio comparativo del mantenimento dell'hiPSC e della generazione di organoidi intestinali umani (hIO) in quattro diverse matrici: Matrigel (Matrix 1-AB), Geltrex (Matrix 2-AB), Cultrex (Matrix 3-AB) e VitroGel (Matrix 4-XF). Sebbene le colonie mancassero di una forma perfettamente rotonda, c'era una differenziazione spontanea minima, con oltre l'85% delle cellule che esprimevano il marcatore delle cellule staminali SSEA-4. La matrice 4-XF ha portato alla formazione di grumi rotondi 3D. Inoltre, l'aumento della concentrazione di integratori e fattori di crescita nei terreni utilizzati per produrre la soluzione di idrogel Matrix 4-XF ha migliorato l'espressione di SSEA-4 da parte di hiPSC di 1,3 volte. La differenziazione della hiPSC mantenuta con Matrix 2-AB ha portato a un minor numero di rilasci di sferoidi durante lo stadio medio/posteriore dell'intestino rispetto alle altre membrane basali di origine animale. Rispetto ad altre, la matrice di organoidi xeno-free (Matrix 4-O3) porta a hIO più grandi e più mature, suggerendo che le proprietà fisiche degli idrogel xeno-free possono essere sfruttate per ottimizzare la generazione di organoidi. Nel complesso, i risultati suggeriscono che le variazioni nella composizione di diverse matrici influenzano le fasi di differenziazione dell'IO. Questo studio aumenta la consapevolezza sulle differenze nelle matrici disponibili in commercio e fornisce una guida per l'ottimizzazione delle matrici durante il lavoro iPSC e IO.

Seguendo questo protocollo, le membrane basali disponibili in commercio e un sistema di idrogel privo di xeno sono stati utilizzati con successo per coltivare cellule hiPSC e differenziarle in hIO. L'obiettivo principale di questi esperimenti era quello di valutare sistematicamente l'equivalenza di matrici provenienti da varie fonti per il lavoro su hiPSC e hIO. La prima sezione di questo protocollo si è concentrata sul mantenimento e la caratterizzazione di una coltura sana di iPSC che produca un'efficiente generazione di organoidi intestinali. Il processo di rivestimento della coltura con le matrici di origine animale Matrix 1-AB, Matrix 2-AB e Matrix 3-AB è stato descritto e confrontato con un sistema di idrogel privo di xeno Matrix 4-XF.
Come mostrato nella Figura 3A, le hiPSC BXS 0116 (derivate da CD34+) mostrano una morfologia comparabile quando coltivate sulle tre matrici di origine animale. Tuttavia, il confronto della linea cellulare BXS 0116 con SCTi003-A (derivato da PBMC) coltivato su pozzetti rivestiti di Matrix 1-AB sottolinea che le differenze intrinseche tra le linee cellulari (mostrate nella Tabella 6) possono portare a variazioni riguardanti la proliferazione, la differenziazione e la morfologia cellulare. Ad esempio, mentre ci sono voluti 3 giorni per generare DE per le linee cellulari SCTi003-A, ci sono voluti 5 giorni per la linea BXS0116. Inoltre, come mostrato nella Figura 3B-C, la coltura di hiPSC nei sistemi di idrogel Matrix 4-XF porta alla formazione di colonie in una colonia 3D parzialmente incorporata che è drasticamente diversa dalla morfologia piatta della coltura di hiPSC su piastre rivestite con Matrix 1-AB o sistemi equivalenti. Inoltre, uno degli aspetti chiave da notare da questi esperimenti è che la realizzazione di un sistema di idrogel privo di xeno utilizzando fattori di crescita 3x può migliorare notevolmente la vitalità cellulare e l'espressione dei marcatori delle cellule staminali. Complessivamente, le colture di hiPSC su matrici di origine animale e la matrice 4-XF xeno-free prodotta con una concentrazione di fattori di crescita 3x hanno portato a un'espressione equivalente di SSEA-4 (marcatore di cellule staminali)22; tuttavia, il sistema idrogel favorisce la formazione di colonie 3D parzialmente incorporate.
La seconda sezione di questo protocollo si concentra sulla differenziazione delle hiPSC per generare hIO. Qui, un kit disponibile in commercio sviluppato sulla base di Spence et al.23 è stato utilizzato per differenziare in endoderma definito (DE), poi intestino medio/intestino posteriore (MH) e infine raccogliere sferoidi per maturare in IO (Figura 4C). Per una generazione efficiente di IO, è fondamentale esaminare che la coltura hiPSC abbia una differenziazione spontanea minima prima di iniziare il protocollo di differenziazione. Come mostrato nella Figura 4A, minore è l'espressione di marcatori di cellule staminali come SSEA-4 all'inizio della differenziazione DE, meno efficiente sarà il processo in ogni fase (cioè minore espressione di marcatori MH) e la successiva scarsa generazione di hIO. L'utilizzo di un dispositivo compatto per citometria a flusso da banco ha facilitato l'accesso rapido ai risultati della citometria a flusso e la decisione sulla qualità della differenziazione prima di passare alla fase successiva. Un'osservazione peculiare è stata che l'hiPSC mantenuta con Matrix 2-AB ha provocato un minor rilascio di sferoidi durante lo stadio medio-intestinale/posteriore rispetto agli altri sistemi di derivazione animale. Un altro aspetto chiave da notare è che, poiché le colonie di hiPSC mantenute nella Matrix 4-XF avevano già una struttura 3D all'inizio della differenziazione, questi sistemi hanno portato a sferoidi più grandi.
Gli sferoidi sono stati incorporati nella matrice 1-ABO, nella matrice 3-ABO e nella matrice 4-XFO1-Matrix 4-XFO4 e sono stati maturati in hIO utilizzando un kit. Dopo la maturazione degli sferoidi per 7 giorni, sono stati fatti passare e incorporati nei rispettivi sistemi di matrici. La crescita dell'organoide su ciascun sistema è stata monitorata per 7 giorni da immagini in campo chiaro. Mentre la coltura è iniziata con organoidi di dimensioni relativamente simili, dopo 5 giorni, la dimensione dell'hIO variava in funzione della matrice in cui erano incorporati (Figura 5). Dei quattro Matrix 4-XFO, la formulazione che ha portato a organoidi più grandi è stata Matrix 4-XFO3. I sistemi Matrix 4-XFO sono formulati con diversi leganti e proprietà meccaniche per adattarsi a una varietà di applicazioni24. In particolare, la rigidità25 di Matrix 4-XFO3 è più vicina alla rigidità intestinale26 umana rispetto alle altre formulazioni di Matrix 4-XFO, il che supporta le recenti scoperte sul ruolo delle proprietà meccaniche della ECM sull'espansione degli organoidi 12,27,28. I nostri risultati rappresentativi indicano che Matrix 1-ABO e Matrix 3-ABO facilitano ugualmente la crescita e l'espansione degli organoidi intestinali.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig03.jpg"> Figura 3: Selezione del sistema di matrici per il mantenimento delle iPSC. (A) Immagini rappresentative di due linee cellulari coltivate su colture rivestite con i tre diversi sistemi di matrici di origine animale. (B) Le immagini rappresentative che confrontano l'uso di Matrix 4-XF con l'integrazione di fattori di crescita 1x rispetto a 3x mostrano che l'aumento degli integratori di fattori di crescita migliora la vitalità di hiPSC su idrogel di Matrix 4-XF. (C) Il confronto della citometria a flusso dell'espressione di SSEA-4 della matrice 1-AB, della matrice 3-AB, della matrice 4-XF (3X) mostra un'espressione equivalente mentre la matrice 4-XF (1X) ha portato a una minore espressione di SSEA-4. Le barre rappresentano la media ± SD di n = 5; per i test di significatività sono stati utilizzati anova a due vie e test post-hoc con il metodo Wilcoxon non parametrico. Barra della scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig04.jpg"> Figura 4: Differenziazione delle iPSC in endoderma definito (DE) e intestino medio/intestino posteriore (MH). (A) Immagini rappresentative del differenziamento delle iPSC in DE a partire da diversi livelli del marcatore SSEA4 evidenziano l'importanza di iniziare il differenziamento con una popolazione di hiPSC con alta espressione di marcatori di cellule staminali. Le frecce rosse indicano aree di differenziazione spontanea prima dell'inizio della DE. (B) Esempio di analisi in citometria a flusso dell'espressione del marcatore delle cellule staminali SSEA4 prima di iniziare il differenziamento e del marcatore DE FOXA2 dopo 3 giorni di differenziamento DE per uno scarso differenziamento DE (a sinistra) e un buon differenziamento (a destra). Ogni grafico rappresenta l'analisi delle cellule estratte da 1; Per l'analisi statistica, si consiglia di calcolare la media dei risultati di almeno 3 cicli di citometria a flusso. (C) Immagini rappresentative della differenziazione di iPSC in hIO su tutte le matrici studiate. Barra della scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig05.jpg"> Figura 5: Selezione del sistema matriciale per l'inclusione di sferoidi e la maturazione dell'hIO. (A) Immagini di esempio della maturazione dell'hIO incorporata nella matrice 4-XFO 1-4. Il modulo elastico dei sistemi Matrix 4-XFO è di circa 50-300 Pa, con il più alto per Matrix 4-XFO3 &gt; Matrix 4-XFO4 &gt; Matrix 4-XFO2 &gt; Matrix 4-XFO1. La rigidità Matrix 1-ABO e Matrix 3-ABO varia da 440 a 800 Pa a seconda del lotto. (B) Immagini campione della maturazione di hIO sono state incorporate nella matrice 1-ABO, nella matrice 3-ABO e nella matrice 4-XFO3 il giorno dell'inclusione (giorno 0) e dopo 1 settimana di coltura (giorno 7). (C) Dati che mostrano il confronto delle dimensioni dell'hIO maturato sui diversi sistemi a matrice. Le barre rappresentano la media ± SD di n = 7; per i test di significatività sono stati utilizzati anova a due vie e test post-hoc con il metodo Wilcoxon non parametrico. Barra della scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66277/66277fig06.jpg"> Figura 6: Immagini rappresentative in immunofluorescenza di organoidi intestinali cresciuti nelle diverse matrici confermano la popolazione di cellule epiteliali. Gli organoidi intestinali interi cresciuti nelle diverse matrici sono stati fissati e colorati con la molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) (verde) e controcolorati per i nuclei cellulari DAPI (blu). Tutti gli organoidi mostrano cellule EpCAM-positive, confermando la popolazione di cellule epiteliali localizzate sulla superficie esterna degli organoidi. Barra della scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/66277fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Riepilogo della preparazione, conservazione e diluizione dell'aliquota delle matrici utilizzate per rivestire gli articoli di coltura utilizzati per iPSC. * Per un fattore di diluizione accurato, controllare il fattore di diluizione raccomandato e/o le concentrazioni proteiche nel certificato di analisi di ciascun lotto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%201_Summary%20of%20aliquot%20preparation_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Tabella di riferimento del volume delle soluzioni di rivestimento per superficie di colture e mTeSR Plus Medium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%202_Volume%20of%20coating%20solutions_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 3: Tabella di riferimento del volume delle soluzioni precursori di Matrix 4-XF per superficie di coltura e terreno completo di cellule staminali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%203_Reference%20table%20of%20the%20volume%20of%20Matrix4-XF_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 4: Elenco dei marcatori comuni raccomandati per caratterizzare hiPSC e hIO durante il processo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%204_List%20of%20common%20markers_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 5: Riassunto dei terreni necessari durante la differenziazione di hiPSC in organoidi intestinali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%205_Summary%20of%20media%20needed%20during%20hiPSC_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 6: Dettagli specifici sulle due linee hiPSC utilizzate in questo studio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Table%206_iPSC%20lines%20information_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Fascicolo supplementare 1: Codice MATLAB generale da modificare in base al tipo di immagine specifico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66277/Code%20image%20Processing_RE.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Gli organoidi sono diventati strumenti preziosi per la modellazione delle malattie. La matrice extracellulare (ECM) guida il destino cellulare durante la generazione degli organoidi e l'utilizzo di un sistema che assomiglia al tessuto nativo può migliorare l'accuratezza del modello. Questo studio confronta la generazione di organoidi intestinali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte in ECM di origine animale e idrogel privi di xeno.

Studio comparativo di matrici di membrana basale per il mantenimento di cellule staminali umane e la generazione di organoidi intestinali

Extracellular matrix (ECM) plays a critical role in cell behavior and development. Organoids generated from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) ...

La nostra ricerca mira all'integrazione di modelli in vitro e in silico per informare la scoperta e lo sviluppo di farmaci nelle prime fasi di sviluppo. In poche parole, combiniamo la tecnologia delle cellule staminali, gli organoidi e la microfluidica per studiare le interazioni farmaco-malattia, l'integrità della membrana e per prevedere l'assorbimento e il metabolismo dei farmaci. Nel nostro campo, le tecnologie all'avanguardia includono modelli fisiologici basati su silicio in combinazione con sistemi avanzati in vitro come sistemi microfisiologici, come organi su chip e organoidi.Oltre a questo, la biostampa 3D è attualmente in fase di studio per massimizzare la scalabilità di questi modelli in vitro più complessi. Le attuali sfide sperimentali includono il miglioramento dei microambienti tissutali e la fedeltà fisiologica di questi modelli in vitro, la minimizzazione della variabilità sperimentale e l'ottimizzazione delle capacità di alta produttività. Inoltre, stabilire protocolli standardizzati conformi agli standard normativi per lo sviluppo di farmaci.Con l'obiettivo di ridurre la variabilità sperimentale, imitare meglio il microambiente tissutale e aderire alle linee guida regolatorie per lo sviluppo di farmaci umani, questo protocollo descrive l'ottimizzazione della generazione di un organoide e il mantenimento di questo sistema di organoidi utilizzando un sistema di idrogel privo di cellule con una composizione di controllo e proprietà meccaniche di controllo. Siamo interessati allo sviluppo di micro sistemi fisiologici da modellare in popolazioni speciali, non ben rappresentate negli studi clinici, come ad esempio le persone che vivono con la sindrome di Down. Il nostro laboratorio sta anche lavorando per portare nuovi approcci terapeutici basati sull'immuno-oncologia in nuovi contesti per i tumori gastrointestinali e polmonari.

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Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

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Studio comparativo di matrici di membrana basale per il mantenimento di cellule staminali umane e la generazione di organoidi intestinali

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