Misurazione dell'apprendimento associativo nella chemiotassi del nematode Caenorhabditis elegans

Una delle domande più affascinanti nelle neuroscienze è come emerga la memoria di apprendimento dalla plasticità dei neuroni. Sia la plasticità che l'apprendimento diminuiscono con l'età. Ma non è in gran parte chiaro perché indagiamo i meccanismi responsabili di questo declino.

Utilizzando gli organismi modello nematodi nella neurite elegans. È diventato chiaro che quasi ogni comportamento di C. elegans dipende dal contesto e dall'esperienza, e che condividono meccanismi di apprendimento associativo e non associativo con altri organismi. Determinanti straordinariamente chiave dell'apprendimento di C. elegans, come l'attività neurale e la segnalazione dell'insulina, sono anch'essi implicati nella regolazione dei processi di prurito del cervello e persino dell'intero organismo.

La tecnologia di base viene utilizzata nello studio delle piastre di Petri divise della chemiotassi, come tramite microscopi. Utilizziamo anche telecamere con software di tracciamento e camere comportamentali personalizzate per il tracciamento della traiettoria e l'imaging del calcio con microfluidica per visualizzare i meccanismi fisiologici dietro i comportamenti che osserviamo sulla piastra di Petri. Attualmente i saghi di chemitassi di ordinamento C. elegans sono stati eseguiti su piastre gradienti o su piastre quadranti.

Le piastre a gradiente possono essere impegnative da eseguire perché il gradiente cambia nel tempo e le piastre a quadrante sono state usate solo per confrontare due diverse concentrazioni di sale. Ecco perché abbiamo introdotto l'uso di piastre bianche per questo saggio. Vogliamo capire perché la capacità di apprendere, che dipende dalla plasticità neurale, diminuisce con l'età.

Miriamo a utilizzare il saggio chemotassi per verificare se specifici percorsi di segnalazione siano responsabili di questo declino. Sulla base di ciò, puntiamo a sviluppare trattamenti che mirino a questo declino cognitivo legato all'età. Per iniziare la crescita dei nematodi, si usano piastre medie a coclea alimentate con Escherichia coli vivente OP 50.

Aggiungi Caenorhabditis elegans N 2 sul piatto e manteni tutta la notte a 20 gradi Celsius capovolto per minimizzare la perdita di umidità. Il giorno successivo, trasferire 30 giovani adulti di Caenorhabditis elegans sulla piastra di crescita del nematode. Permettere agli animali di deporre le uova per circa otto ore a 20 gradi Celsius.

Dopo la deposizione a tempo di deposizione, rimuovere tutti i vermi adulti dal piatto. Coltiva la piastra capovolta a 20 gradi Celsius per tre giorni. Per il saggio, semina metà del lotto dei gruppi desiderati di piastre di condizionamento con 200 microlitri di OP 50 per piastra di testa.

Lascia asciugare le piastre con semi durante la notte a 20 gradi Celsius in un incubatore insieme a quelle non seminate. Prepara la concentrazione desiderata di un litro di soluzione di cloruro di sodio in una bottiglia di vetro. Autoclave le bottiglie per 15 minuti a 121 gradi Celsius.

Poi lascia raffreddare le bottiglie per 30 minuti a 55 gradi Celsius in un bagno d'acqua. Nel frattempo, etichetta la parte inferiore della sezione della piastra YP con la corrispondente concentrazione di cloruro di sodio e disegna un cerchio di raggio di cinque millimetri attorno al centro della placca dove si incontrano le pareti. Metti ogni bottiglia una alla volta su un mescolatore magnetico riscaldato.

Aggiungi 25 millilitri di una soluzione molare di fosfato di potassio a pH sei per ogni bottiglia. Mescola bene per due minuti. Poi aggiungi successivamente cloruro di calcio, colesterolo e solfato di magnesio durante la mescola.

Successivamente, si inserisce il mezzo millimolare zero in uno scomparto di una piastra di Petri a Y fino a raggiungere la parte superiore della parete interna. E lascia solidificare il substrato per circa cinque minuti. Aliquota il mezzo da 100 millimolari nel secondo compartimento della piastra di Petri a Y fino a toccare la sezione millimolare solidificata a zero adiacente.

Poi usa una punta sterile da 10 microlitri per rompere la tensione superficiale lungo la parete a Y e collegarla alla sezione a zero millimolari cloruro di sodio. Lascia solidificare il substrato per cinque minuti. Aliquota il mezzo da 50 millimolari nel compartimento rimanente della piastra di Petri a Y fino a toccare le sezioni solidificate a zero millimolari e a 100 millimolari.

Poi usa una punta sterile da 10 microlitri per rompere la tensione superficiale lungo la parete a Y e collegare la sezione di cloruro di sodio da 50 millimolari alle altre due sezioni. Dopo aver lasciato solidificare il substrato per cinque minuti, conserva i piatti durante la notte a 20 gradi Celsius. Per iniziare la pipetta, un millilitro di tampone sterile M nine su una piastra di crescita contenente Caenorhabditis elegans.

Fai ruotare delicatamente la piastra per spostare i vermi dal prato batterico OP 50 e dalla coclea formando una sospensione. Inclina la piastra per raccogliere la sospensione a vite senza fine nel buffer M nine usando una punta di pipetta in plastica da un millilitro con la parte superiore tagliata. Trasferisci la sospensione a un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Lasciare che i vermi si depositino sul fondo dei tubi della microcentrifuga per circa 60 secondi formando una pellet. Poi rimuovi il surnante usando una pipetta da un millilitro senza disturbare il pellet. Lava il pellet con due volte un millilitro di tampone sterile M nove.

Per rimuovere l'OP 50 residuo. Reese sospende il pellet in 300 microlitri di buffer M nove. Dopo l'ultimo lavaggio.

Far ruotare la sospensione per una distribuzione uniforme dei lunetti e trasferire lentamente 50 microlitri di sospensione contenenti circa 200-300 vermi a ciascuna piastra di condizionamento. Per i piatti con l'op 50, deposita la goccia di verme lontano dal prato batterico e lascia che venga assorbita nella copera. Tieni i piatti capovolti in un incubatore a 20 gradi Celsius per quattro ore.

Dopo il condizionamento, pipettare un millilitro di tampone sterile M nove su una piastra di condizionamento e farla ruotare delicatamente per slogare i vermi che formano una sospensione. Poi inclina la piastra per raccogliere la sospensione a viti con una punta di pipetta in plastica da un millilitro e trasferiscila in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. In 60 secondi, i vermi si calmano e formano una pallina.

Dopo aver rimosso il surnadante, lavare i vermi due volte con un millilitro di tampone sterile M nine. Poi riempi il tubo della microcentrifuga con il buffer M nine fino al millilitro. Una volta formata la pellet di verme, rimuovere 960 microlitri del sovrandante senza disturbare la pellet.

Ora fai roteare o scuotere delicatamente il tubo per risospendere i vermi. Trasferire 20 microlitri di questa sospensione contenente circa 100-150 vermi al centro di una piastra di prova dove si incontrano i segmenti della parete Y. Lascia che i vermi vaghino per 30 minuti a 20 gradi Celsius.

Poi contate il numero di vermi in ogni sezione della piastra di prova e contateli di nuovo dopo 30 minuti. Calcola l'indice di Chemotaxis per piastra per un momento di tempo usando la formula specificata. Il comportamento del tipo selvatico di Caenorhabditis elegans è stato significativamente influenzato da un condizionamento di quattro ore su piastre con diversi livelli di cloruro di sodio, con o senza cibo.

Dopo 30 minuti sulla piastra di saggio, i vermi condizionati con alte concentrazioni di cloruro di sodio e cibo, così come quelli condizionati senza cloruro di sodio e senza cibo, hanno mostrato un indice chemotassi positivo che indica una preferenza per concentrazioni più elevate di cloruro di sodio. Al contrario, i vermi condizionati con alte concentrazioni di cloruro di sodio e senza cibo, concentrazioni medie di cloruro di sodio e senza cibo e senza cloruro di sodio con il cibo hanno mostrato un indice chemotassi negativo, indicando una preferenza per concentrazioni più basse di cloruro di sodio. La Sodium chloridde Food Association persisteva dopo 60 minuti con l'indice Chemotaxi, spesso cambiato nei vermi condizionati dal cibo, indicando un apprendimento associativo dinamico mentre gli animali aggiornano questa associazione mentre vagano e cercano cibo.