Predizione computazionale delle preferenze amminoacidiche di domini di legame peptidico potenzialmente multispecifici coinvolti nelle interazioni proteina-proteina
January 26th, 2024
Descriviamo una metodologia basata sulla diversificazione delle sequenze per stimare le preferenze amminoacidiche dei siti di legame multispecifici nelle interazioni proteina-proteina (PPI). In questa strategia, migliaia di potenziali ligandi peptidici vengono generati e sottoposti a screening in silico, superando così alcune limitazioni dei metodi sperimentali disponibili.
Proponiamo un protocollo per la predizione computazionale delle preferenze amminoacidiche in interazioni proteina-proteina più specifiche. Questo protocollo può essere considerato come un primo passo nella progettazione di mediatori di queste interazioni. Siamo interessati ad utilizzare questi mediatori come potenziali inibitori di specifiche interazioni, in tecnologi immunologici.
Il nostro implementatore utilizzato per caratterizzare le preferenze di amminoacidi tra i siti di legame specifici è costoso e ingombrante. Il nostro protocollo è una tecnologia bio-supportata basata sull'efficienza e sulle operazioni in serie. Questa strategia ha il potenziale per elaborare un numero elevato di sequenze di linee, fornendo una differenza completa e coerente delle preferenze degli amminoacidi.
Il nostro protocollo offre un processo professionale ed economico elaborando un gran numero di sequenze di DNA preferite rispetto a un più completo dal numero tipicamente limitato di sequenze, processi negli approcci di laboratorio web. Oltre allo sviluppo di inibitori di prodotti immunologici, vorremmo confrontare le prestazioni di questa metodologia con altre famiglie di prodotti. Questo ci permetterà di comprendere meglio le basi strutturali della multispecificità, non solo in ambito immunologico, ma anche in altre funzioni cellulari, come la segnalazione e la comunicazione.
Inizia scaricando la struttura del complesso proteina-proteina. A tale scopo, accedere alla home page della banca dati delle proteine e immettere l'ID PDB nella casella di ricerca principale. Nella pagina principale della struttura, fare clic su Scarica file, quindi su Assemblaggio biologico 1 per scaricare i file in formato PDB gz.
Aprire la struttura scaricata in UCSF Chimera. Passare a Strumenti, quindi a Modifica struttura e fare clic su Modifica ID catena. Rinomina la seconda catena inizialmente etichettata come A, in B.Quindi, fai clic su Preferiti, seguito da Pannello modello.
Seleziona il modello con le due catene e fai clic sul pulsante raggruppa/separa per separare ogni catena in un modello diverso. Quindi, seleziona i due modelli e fai clic sul pulsante Copia/Combina. Immettere un nuovo nome per il modello combinato.
Selezionare Chiudi modelli di origine e fare clic su OK. Fare clic su Seleziona, quindi su Catena e confermare che le catene nel dimero sono ora identificate come A e B.Fare clic su File e salvare PDB per salvare la struttura modificata come nuovo file PDB. Per identificare il segmento target nella proteina ligando, accedere al server BUDE Alanine Scan. Fare clic sul pulsante Scegli file in Caricamento struttura e caricare il file PDB salvato.
Nella pagina successiva, verificare che la struttura sia stata caricata correttamente e immettere un nome per il lavoro nel server. Imposta le catene A come recettore e B come ligando, quindi fai clic sul pulsante Avvia scansione per inviare il lavoro. Una volta terminato il lavoro, fare clic su Mostra risultati per aprire la pagina Risultati.
Dall'elenco Residui, selezionare il tratto di residui che si prevede interagisca meglio con la superficie di legatura di destinazione. Utilizzando questo protocollo e il segmento di amminoacidi, è stato previsto l'interazione con la superficie di legame di IRF5. Utilizzando la mutagenesi computazionale a scansione di alanina, è stato previsto un segmento di 13 aminoacidi dalle posizioni 424 a 436, con il motivo p L x IS a partire dall'arginina 432.
Per iniziare, prepara l'interfaccia del peptide proteico per la diversificazione della sequenza. Apri il file PDB in Chimera e assicurati che la struttura delle subunità target sia intatta senza atomi o legami mancanti. Per rimuovere tutte le molecole non essenziali dalla struttura, fare clic su Seleziona, quindi su Residui, quindi selezionare tutte le molecole diverse dagli amminoacidi standard.
Quindi fare clic su Azioni seguito da Adams/Bonds ed eliminare. Quindi, fare clic su Preferiti, in Sequenza, quindi fare clic sulla catena considerata come ligando. Ritagliare la catena di leganti al segmento interagente identificato eliminando tutti i residui tranne quelli tra le posizioni selezionate.
Fare clic su File e salva PDB per salvare la struttura modificata in un file PDB diverso. Copiare questo file in un percorso Linux accessibile dalle applicazioni Rosetta. Utilizzare l'applicazione fixedbb di Rosetta per eseguire un reimpacchettamento di tutte le catene laterali di amminoacidi della struttura di base prima della diversificazione della sequenza, eseguendo questo comando.
Quindi rinominare il file PDB repack con un suffisso _ repack utilizzando il comando seguente. Quindi, eseguire pepspec in modalità progettazione per eseguire la diversificazione della sequenza utilizzando questo comando. Quindi, generare un pwm utilizzando il gen pepspec pwm.
script py incluso nella suite Rosetta. Per eseguire questo script, utilizzare il comando seguente. Per creare un logo di sequenza, apri il file con le sequenze peptidiche generate nel passaggio precedente con un editor di testo preferito e copia tutte le sequenze.
Passare al server WebLogo e incollare le sequenze nella casella di testo Allineamento sequenze multiple. Scegli il formato e la dimensione desiderati del logo in base alla lunghezza di input e fai clic su Crea logo. Utilizzando questo protocollo, sono state previste le preferenze degli amminoacidi per il motivo conservato p L x IS nella superficie di legame di IRF5.
La posizione, la matrice di peso e il logo della sequenza generati dalla diversificazione della sequenza hanno mostrato una preferenza per il glutammato alla posizione 432 e per la leucina e l'isoleucina alle posizioni 433 e 435. Le posizioni 427, 429 e 436, tipicamente occupate dalla Serina, hanno mostrato una maggiore preferenza per l'aspartato e il glutammato, evidenziando il ruolo della fosforilazione e della dimerizzazione di IRF5. La posizione 425 ha mostrato un'alta preferenza per la serina, suggerendo il suo coinvolgimento nell'interazione proteina-proteina nella sua forma non fosforilata.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per prevedere computazionalmente le preferenze degli aminoacidi in specifiche interazioni proteina-proteina (PPI). La metodologia mira a facilitare la progettazione di mediatori che possono inibire queste interazioni, in particolare in immunologia.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Interazioni proteina-proteina
- Biologia computazionale
- Immunologia
Sfondo
- Comprendere le preferenze degli aminoacidi è cruciale per progettare inibitori efficaci delle PPI.
- I metodi attuali per caratterizzare queste preferenze sono spesso costosi e macchinosi.
- Questo studio propone un approccio computazionale più efficiente.
- Il protocollo consente l'elaborazione di numerose sequenze peptidiche.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un protocollo computazionale per prevedere le preferenze degli aminoacidi.
- Migliorare la progettazione di mediatori per inibire specifiche interazioni proteiche.
- Semplificare il processo di analisi delle caratteristiche del sito di legame.
Metodi utilizzati
- Generazione di migliaia di potenziali ligandi peptidici.
- Screening in silico dei ligandi peptidici.
- Analisi delle preferenze degli aminoacidi nei siti di legame multispecifici.
- Utilizzo di tecnologia basata sulla biologia per un'elaborazione efficiente.
Principali risultati
- Il protocollo prevede con successo le preferenze degli aminoacidi nelle PPI.
- Dimostra la capacità di gestire un elevato volume di sequenze.
- I risultati indicano una differenziazione coerente delle preferenze degli aminoacidi.
- Questo approccio potrebbe portare a inibitori più efficaci in immunologia.
Conclusioni
- La metodologia proposta offre un'alternativa promettente ai metodi sperimentali tradizionali.
- Ha il potenziale per far progredire significativamente lo studio delle interazioni proteiche.
- Le future applicazioni potrebbero includere lo sviluppo di agenti terapeutici mirati.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Computational prediction of amino acid preferences in peptide-binding domains addresses a critical bottleneck in early-stage protein-protein interaction (PPI) modulator discovery. This approach enables rapid, cost-effective prioritization of peptide candidates for downstream validation, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in biopharma pipelines. By supporting the design of multispecific PPI mediators, it enhances predictive confidence and portfolio triage for therapeutic innovation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of binding specificity and multispecificity in protein interaction networks.
- Supports functional target validation by mapping amino acid preferences at key binding interfaces.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying sequence determinants of PPI selectivity.
- Improves predictive confidence for advancing peptide-based modulators.
Screening & Assay Development
- Prepares validated peptide candidates for downstream experimental screening workflows.
- Standardizes computational assessment of binding affinity and sequence diversity.
- Generates quantitative outputs such as position-weight matrices for assay design.
- Enables scalable evaluation of large peptide libraries prior to synthesis.
Translational & Preclinical Research
- Aligns computational predictions with disease-relevant PPI targets for translational continuity.
- Supports risk-adjusted advancement of peptide candidates into preclinical validation.
- Provides mechanistic insights into post-translational modification effects, such as phosphorylation mimicry.
- Facilitates cross-functional data integration for biomarker and target engagement studies.
Pipeline & Workflow Integration
This computational protocol integrates at the interface of early discovery and lead identification, bridging in silico design with experimental validation in the PPI modulator workflow.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven mapping of amino acid determinants for PPI specificity and multispecificity.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative sequence preference data to inform high-throughput peptide screening.
- Analytics: Provides position-weight matrices and sequence logos for comparative analysis of binding motifs.
- Translational Research: Connects computational predictions to disease-relevant PPIs and post-translational modification effects.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable computational workflow for diverse PPI target families.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in PPI modulator design.
- Operational Value: Standardizes and accelerates sequence preference analysis across multiple targets.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of peptide-based therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in computational biology and structural bioinformatics.
- Depends on access to molecular modeling software (e.g., Rosetta) and supporting analytical tools.
- Necessitates standardized data formats and cross-team protocol harmonization.
- Adaptable to various PPI targets with available structural information.
- Limited by the accuracy of input structures and computational docking algorithms.
