Predizione computazionale delle preferenze amminoacidiche di domini di legame peptidico potenzialmente multispecifici coinvolti nelle interazioni proteina-proteina
26 gennaio 2024
Descriviamo una metodologia basata sulla diversificazione delle sequenze per stimare le preferenze amminoacidiche dei siti di legame multispecifici nelle interazioni proteina-proteina (PPI). In questa strategia, migliaia di potenziali ligandi peptidici vengono generati e sottoposti a screening in silico, superando così alcune limitazioni dei metodi sperimentali disponibili.
Proponiamo un protocollo per la predizione computazionale delle preferenze amminoacidiche in interazioni proteina-proteina più specifiche. Questo protocollo può essere considerato come un primo passo nella progettazione di mediatori di queste interazioni. Siamo interessati ad utilizzare questi mediatori come potenziali inibitori di specifiche interazioni, in tecnologi immunologici.
Il nostro implementatore utilizzato per caratterizzare le preferenze di amminoacidi tra i siti di legame specifici è costoso e ingombrante. Il nostro protocollo è una tecnologia bio-supportata basata sull'efficienza e sulle operazioni in serie. Questa strategia ha il potenziale per elaborare un numero elevato di sequenze di linee, fornendo una differenza completa e coerente delle preferenze degli amminoacidi.
Il nostro protocollo offre un processo professionale ed economico elaborando un gran numero di sequenze di DNA preferite rispetto a un più completo dal numero tipicamente limitato di sequenze, processi negli approcci di laboratorio web. Oltre allo sviluppo di inibitori di prodotti immunologici, vorremmo confrontare le prestazioni di questa metodologia con altre famiglie di prodotti. Questo ci permetterà di comprendere meglio le basi strutturali della multispecificità, non solo in ambito immunologico, ma anche in altre funzioni cellulari, come la segnalazione e la comunicazione.
Inizia scaricando la struttura del complesso proteina-proteina. A tale scopo, accedere alla home page della banca dati delle proteine e immettere l'ID PDB nella casella di ricerca principale. Nella pagina principale della struttura, fare clic su Scarica file, quindi su Assemblaggio biologico 1 per scaricare i file in formato PDB gz.
Aprire la struttura scaricata in UCSF Chimera. Passare a Strumenti, quindi a Modifica struttura e fare clic su Modifica ID catena. Rinomina la seconda catena inizialmente etichettata come A, in B.Quindi, fai clic su Preferiti, seguito da Pannello modello.
Seleziona il modello con le due catene e fai clic sul pulsante raggruppa/separa per separare ogni catena in un modello diverso. Quindi, seleziona i due modelli e fai clic sul pulsante Copia/Combina. Immettere un nuovo nome per il modello combinato.
Selezionare Chiudi modelli di origine e fare clic su OK. Fare clic su Seleziona, quindi su Catena e confermare che le catene nel dimero sono ora identificate come A e B.Fare clic su File e salvare PDB per salvare la struttura modificata come nuovo file PDB. Per identificare il segmento target nella proteina ligando, accedere al server BUDE Alanine Scan. Fare clic sul pulsante Scegli file in Caricamento struttura e caricare il file PDB salvato.
Nella pagina successiva, verificare che la struttura sia stata caricata correttamente e immettere un nome per il lavoro nel server. Imposta le catene A come recettore e B come ligando, quindi fai clic sul pulsante Avvia scansione per inviare il lavoro. Una volta terminato il lavoro, fare clic su Mostra risultati per aprire la pagina Risultati.
Dall'elenco Residui, selezionare il tratto di residui che si prevede interagisca meglio con la superficie di legatura di destinazione. Utilizzando questo protocollo e il segmento di amminoacidi, è stato previsto l'interazione con la superficie di legame di IRF5. Utilizzando la mutagenesi computazionale a scansione di alanina, è stato previsto un segmento di 13 aminoacidi dalle posizioni 424 a 436, con il motivo p L x IS a partire dall'arginina 432.
Per iniziare, prepara l'interfaccia del peptide proteico per la diversificazione della sequenza. Apri il file PDB in Chimera e assicurati che la struttura delle subunità target sia intatta senza atomi o legami mancanti. Per rimuovere tutte le molecole non essenziali dalla struttura, fare clic su Seleziona, quindi su Residui, quindi selezionare tutte le molecole diverse dagli amminoacidi standard.
Quindi fare clic su Azioni seguito da Adams/Bonds ed eliminare. Quindi, fare clic su Preferiti, in Sequenza, quindi fare clic sulla catena considerata come ligando. Ritagliare la catena di leganti al segmento interagente identificato eliminando tutti i residui tranne quelli tra le posizioni selezionate.
Fare clic su File e salva PDB per salvare la struttura modificata in un file PDB diverso. Copiare questo file in un percorso Linux accessibile dalle applicazioni Rosetta. Utilizzare l'applicazione fixedbb di Rosetta per eseguire un reimpacchettamento di tutte le catene laterali di amminoacidi della struttura di base prima della diversificazione della sequenza, eseguendo questo comando.
Quindi rinominare il file PDB repack con un suffisso _ repack utilizzando il comando seguente. Quindi, eseguire pepspec in modalità progettazione per eseguire la diversificazione della sequenza utilizzando questo comando. Quindi, generare un pwm utilizzando il gen pepspec pwm.
script py incluso nella suite Rosetta. Per eseguire questo script, utilizzare il comando seguente. Per creare un logo di sequenza, apri il file con le sequenze peptidiche generate nel passaggio precedente con un editor di testo preferito e copia tutte le sequenze.
Passare al server WebLogo e incollare le sequenze nella casella di testo Allineamento sequenze multiple. Scegli il formato e la dimensione desiderati del logo in base alla lunghezza di input e fai clic su Crea logo. Utilizzando questo protocollo, sono state previste le preferenze degli amminoacidi per il motivo conservato p L x IS nella superficie di legame di IRF5.
La posizione, la matrice di peso e il logo della sequenza generati dalla diversificazione della sequenza hanno mostrato una preferenza per il glutammato alla posizione 432 e per la leucina e l'isoleucina alle posizioni 433 e 435. Le posizioni 427, 429 e 436, tipicamente occupate dalla Serina, hanno mostrato una maggiore preferenza per l'aspartato e il glutammato, evidenziando il ruolo della fosforilazione e della dimerizzazione di IRF5. La posizione 425 ha mostrato un'alta preferenza per la serina, suggerendo il suo coinvolgimento nell'interazione proteina-proteina nella sua forma non fosforilata.
Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per la previsione computazionale delle preferenze degli amminoacidi in specifiche interazioni proteina-proteina (PPI). La metodologia mira a facilitare la progettazione di mediatori in grado di inibire tali interazioni, in particolare in immunologia.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Interazioni proteina-proteina
- Biologia computazionale
- Immunologia
Sfondo
- Comprendere le preferenze degli amminoacidi è fondamentale per progettare inibitori efficaci delle interazioni proteina-proteina (PPI).
- I metodi attuali per caratterizzare queste preferenze sono spesso costosi e complessi.
- Questo studio propone un approccio computazionale più efficiente.
- Il protocollo consente l'elaborazione di numerose sequenze peptidiche.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo computazionale per prevedere le preferenze degli amminoacidi.
- Migliorare la progettazione di mediatori per inibire interazioni proteiche specifiche.
- Ottimizzare il processo di analisi delle caratteristiche dei siti di legame.
Metodi Utilizzati
- Generazione di migliaia di potenziali ligandi peptidici.
- Selezione in silico di ligandi peptidici.
- Analisi delle preferenze aminoacidiche in siti di legame multisppecifici.
- Utilizzo di tecnologia basata su dati biologici per un'elaborazione efficiente.
Risultati principali
- Il protocollo prevede con successo le preferenze degli amminoacidi nelle interazioni proteina-proteina (PPI).
- Dimostra la capacità di gestire un elevato volume di sequenze.
- I risultati indicano una differenziazione costante delle preferenze degli amminoacidi.
- Questo approccio potrebbe portare a inibitori più efficaci in immunologia.
Conclusioni
- La metodologia proposta offre un'alternativa promettente ai metodi sperimentali tradizionali.
- Ha il potenziale per far progredire in modo significativo lo studio delle interazioni proteiche.
- Applicazioni future potrebbero includere lo sviluppo di agenti terapeutici mirati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La previsione computazionale delle preferenze degli amminoacidi nei domini leganti peptidi affronta un collo di bottiglia fondamentale nella scoperta precoce di modulatori delle interazioni proteina-proteina (PPI). Questo approccio consente una rapida e conveniente priorizzazione di candidati peptidici per la validazione successiva, influenzando direttamente la validazione del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico nei processi biofarmaceutici. Sostenendo la progettazione di mediatori PPI multivalenti, aumenta la fiducia predittiva e il triage del portafoglio per l'innovazione terapeutica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi della specificità e della multispecificità nelle reti di interazione proteica.
- Supporta la validazione funzionale del target mappando le preferenze degli amminoacidi alle interfacce di legame chiave.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico chiarificando i determinanti di sequenza nella selettività delle interazioni proteina-proteina (PPI).
- Migliora l'affidabilità predittiva per lo sviluppo di modulatori peptidici.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prepara candidati peptidici validati per flussi di lavoro sperimentali di screening successivi.
- Standardizza la valutazione computazionale dell'affinità di legame e della diversità di sequenza.
- Genera output quantitativi come matrici ponderate per posizione per la progettazione di saggi.
- Consente una valutazione scalabile di grandi librerie peptidiche prima della sintesi.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea le previsioni computazionali con bersagli di interazioni proteina-proteina rilevanti per la malattia, garantendo continuità traslazionale.
- Supporta l'avanzamento dei candidati peptidici con valutazione del rischio verso la validazione preclinica.
- Fornisce approfondimenti meccanicistici sugli effetti delle modifiche post-traduzionali, come il mimetismo della fosforilazione.
- Facilita l'integrazione multidisciplinare dei dati per studi su biomarcatori e interazione con il bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo protocollo computazionale si integra nell'interfaccia tra la fase iniziale della scoperta e l'identificazione del composto attivo, collegando la progettazione in silico con la validazione sperimentale nel flusso di lavoro dei modulatori delle interazioni proteina-proteina.
- Biologia della scoperta: Permette la mappatura basata su ipotesi dei determinanti amminoacidici per la specificità e la multispecificità delle interazioni proteina-proteina (PPI).
- Screening: Fornisce dati quantitativi riproducibili sulle preferenze di sequenza per guidare lo screening ad alto rendimento di peptidi.
- Analisi: Offre matrici di pesi posizionali e logo di sequenza per l'analisi comparativa dei motivi di legame.
- Ricerca traslazionale: Collega le previsioni computazionali a interazioni proteina-proteina rilevanti per le malattie e agli effetti delle modifiche post-traduzionali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro computazionale scalabile e riutilizzabile per diverse famiglie di target di interazioni proteina-proteina (PPI).
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella progettazione di modulatori delle interazioni proteina-proteina.
- Valore operativo: Standardizza e accelera l'analisi delle preferenze di sequenza su più bersagli.
- Valore strategico: Permette decisioni di avanzamento o interruzione del progetto più informate e una gestione del portafoglio efficiente in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione di candidati terapeutici peptidici basati su un'adeguata valutazione del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in biologia computazionale e bioinformatica strutturale.
- Richiede l'accesso a software per la modellizzazione molecolare (ad esempio, Rosetta) e a strumenti analitici complementari.
- Necessita di formati dati standardizzati e di un'armonizzazione dei protocolli tra i diversi gruppi di lavoro.
- Adattabile a diversi bersagli di interazioni proteina-proteina per i quali siano disponibili informazioni strutturali.
- Limitato dall'accuratezza delle strutture di input e degli algoritmi computazionali di docking.
