Un flusso di lavoro per la valutazione quantitativa dei microbiomi batterici endofitici ed epifiti della corteccia di Populus trichocarpa

[Presentatore] Un flusso di lavoro per la valutazione quantitativa dei microbiomi batterici endofitici ed epilitici della corteccia di Populus trichocarpa. Qui abbiamo progettato e testato un flusso di lavoro dettagliato per studiare il microbioma che colonizza i tessuti interni o le superfici della corteccia di Populus trichocarpa. Questo flusso di lavoro descrive in dettaglio il campionamento dei microbiomi endofitici ed epitetici della corteccia di Populus trichocarpa, l'elaborazione dei materiali raccolti, l'estrazione del DNA genomico, l'amplificazione PCR delle regioni target, la preparazione di librerie di DNA e il sequenziamento dei microbiomi batterici endofitici ed epitetici tramite tecnologia di sequenziamento di nuova generazione. Forniamo anche una breve procedura analitica per i dati di sequenziamento ottenuti. Questo flusso di lavoro collaudato fornirà un approccio efficace per studiare empiricamente le comunità di microbiomi endofitici ed epitetici della corteccia di Populus trichocarpa e di altre specie forestali. Coltiva gli alberelli di Populus trichocarpa di tre mesi in una camera di crescita, taglia i segmenti del fusto lunghi 10 centimetri di Populus trichocarpa da due a 12 centimetri sopra la superficie del terreno sterilizzato usando un potatore sterilizzato. Mettere i segmenti del gambo in una capsula di Petri quadrata sterilizzata. Strofinare ripetutamente l'epidermide dello stelo sulla capsula di Petri quadrata sterilizzata utilizzando cotone sterile allo 0,1%. Interpolazione 20. Conservare ogni pezzo di cotone contenente microrganismi, campioni epitetici, in una provetta da centrifuga sterile da 1,5 millilitri a meno 80 gradi centigradi. Dopo aver pulito la superficie del gambo, tagliare la corteccia con un bisturi sterile, staccare la corteccia e metterla in una capsula di Petri quadrata. Tagliare la corteccia strappata dal gambo in segmenti di circa un centimetro con un bisturi sterile. Sterilizzare le superfici dei segmenti immergendole in alcol al 70% per due minuti, quindi immergere i segmenti in ipoclorito di sodio allo 0,1%, Tween 80 per cinque minuti. Infine, sterilizzare gli spicchi in alcol al 70% per 30 secondi. Quindi lavare tutti i campioni tre volte con acqua distillata sterile e posizionarli su un banco pulito per l'asciugatura all'aria. Conservare ogni campione endofitico sterilizzato della corteccia dello stelo in una provetta da centrifuga sterile da due millilitri a meno 80 gradi centigradi. Posizionare le sezioni di corteccia dello stelo in tubi rigidi sterili da cinque millilitri e aggiungere tre perline di acciaio sterilizzate in ciascun tubo. Congelare le provette dure contenenti i campioni in azoto liquido per 10 minuti. Schiacciare i campioni di corteccia per cinque minuti con un battitore di perline. Quindi congelare nuovamente il tubo duro in azoto liquido per un minuto e ripetere la fase di battitura del tallone per cinque minuti. Aggiungere la corteccia del gambo schiacciata di Populus trichocarpa e le comunità batteriche epitetiche aderenti al cotone, 0,25 grammi ciascuna, a ciascuno dei tubi di perline e quindi aggiungere 60 microlitri di soluzione C1 fornita da un kit commerciale, e delicatamente miscelata per inversione. Successivamente, omogeneizzare i campioni endofitici ed epitetici utilizzando un battitore di microsfere in quattro esecuzioni di un minuto. Dopo ogni corsa, posizionare i campioni sul ghiaccio per 30 secondi. Centrifugare le provette a 10.000 volte la gravità per un minuto, estrarre i campioni endofitici ed epitetici, utilizzando un kit seguendo le istruzioni del produttore, aggiungere 30 microlitri di soluzione C6 al centro della membrana filtrante bianca e incubare a 25 gradi centigradi per cinque minuti. Centrifugare a 10.000 volte la gravità a temperatura ambiente per un minuto. Misurare le concentrazioni del DNA genomico estratto da campioni epitetici ed endofitici utilizzando uno spettrofotometro a micro volume. Diluire ogni campione di DNA con ddH2O sterile a due nanogrammi per microlitro per ottenere il modello di DNA per l'amplificazione PCR. Amplificare la regione da V5 a V7 del gene batterico 16S rRNA utilizzando il primer diretto 799F e il primer inverso 1193R. Nel frattempo, amplificare la regione V4 del gene batterico 16S rRNA utilizzando il primer diretto 5115F e il primer inverso 806R. Miscelare accuratamente ogni campione e centrifugare per eliminare le bolle. Eseguire l'amplificazione della regione da V5 a V7 o V4 dei geni batterici 16S rRNA su un termociclatore. Caricare cinque microlitri di ogni campione di Amplicon su un gel di agarosio all'1% ed eseguire l'elettroforesi a 120 volt per 30 minuti. Visualizza il gel sotto le luci UV per convalidare il successo dell'amplificazione PCR. Per ogni campione, mescolare tre repliche dei prodotti di amplificazione PCR in una provetta PCR. Determinare la concentrazione dei prodotti amplificati utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore. Misura la fluorescenza utilizzando un lettore di micropiastre. Traccia una curva del DNA standard e usala per calcolare le concentrazioni di DNA dei prodotti amplificati. In base alla loro concentrazione misurata, mescolare i prodotti PCR ottenuti dai campioni endofitici o epifiti dalla corteccia di Populus trichocarpa in uguale concentrazione per costruire la libreria Amplicon. Condurre l'elettroforesi su gel di agarosio utilizzando un apparecchio per elettroforesi. Preparare brevemente un gel di agarosio all'1,3%, 1,3 grammi di polvere di agarosio in 100 millilitri di tampone una volta TAE. Rimuovere i pettini dopo la solidificazione del gel e posizionare il gel in una vasca di elettroforesi con un tampone TAE una volta. Quindi, aggiungere un'unità di volume di sei volte il tampone di carico arancione a cinque unità di volume di ciascun prodotto PCR con 100 microlitri di scala caricati in ciascun pozzetto. Aggiungere 30 microlitri di scala del DNA in un pozzetto. Dopo aver collegato i fili positivo e negativo, eseguire l'elettroforesi a 80 volt per 50 minuti. Asportare i frammenti di DNA dal gel di agarosio utilizzando un bisturi pulito e affilato. Pesare la fetta di gel e trasferirla in un tubo incolore. Aggiungere il tampone per immergere la fetta di gel. Eseguire l'estrazione del gel utilizzando il kit di estrazione del gel seguendo le istruzioni del produttore. Determinare la concentrazione della libreria di Amplicon purificata su un fluorimetro utilizzando un kit commerciale seguendo il protocollo del produttore per la profilazione del sequenziamento. Leggere le provette standard e campione utilizzando un fluorimetro e confermare la qualità della libreria visualizzando una singola banda. Analizza e annota le sequenze geniche dell'rRNA 16S utilizzando CHAM II. Effettuare annotazioni tassonomiche utilizzando il Silver Database in base alle sequenze di riferimento. Visualizza questi risultati utilizzando il pacchetto ggplot2 in R. È stato ottenuto DNA genomico di alta qualità dei microbiomi batterici endofitici ed epilitetici della corteccia di Populus trichocarpa. L'amplificazione PCR di tutti i 12 campioni ha prodotto singole bande forti con la dimensione corretta. La libreria Amplicon è stata ulteriormente costruita con un singolo picco che soddisfaceva i requisiti di pre-sequenziamento. Per i microbiomi endofitici, sono state ottenute letture di alta qualità utilizzando rispettivamente le coppie di primer 799F/1193R e 515F/806R. La coppia di inneschi 799F/1193R ha prodotto un numero significativamente inferiore di letture di piante amplificate. Il numero di ASV dal microbioma epitetico della corteccia di Populus trichocarpa era significativamente più alto quando si utilizzavano i primer 799F/1193R rispetto ai primer 515F/806R. Si stima che l'indice di Shannon sia più basso nella comunità batterica epifita della corteccia rispetto alla comunità batterica endofitica utilizzando la coppia di primer 799F/1193R. Le caratteristiche tassonomiche delle comunità batteriche nelle porzioni di corteccia endofita ed epifita di Populus trichocarpa sono state ulteriormente esplorate utilizzando la coppia di primer 799F/1193R. È stato costruito un flusso di lavoro affidabile ed efficiente dalla raccolta dei campioni all'analisi dei dati per quantificare la composizione e la diversità dei microbiomi batterici endofitici ed epitetici della corteccia di Populus trichocarpa. Il nostro protocollo può servire come percorso per lo studio del microbioma della corteccia delle specie vegetali legnose, consentendo una migliore comprensione delle caratteristiche delle comunità batteriche che abitano altre piante legnose.