Name: Metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T13:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Scopri un saggio fluorescente economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro utilizzando la sonda Calcein. Questo metodo semplice supporta la ricerca sul cancro.

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<meta charset="utf8"></head><body>Saggio fluorescente per la rilevazione di nuovi chelanti del ferro

<ol><li>Hsu, P. P., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+metabolism%3A+Warburg+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer cell metabolism: Warburg and beyond.</a> Cell. 134 (5), 703-707 (2008).</li>
<li>Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron%3A+An+essential+element+of+cancer+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Iron: An essential element of cancer metabolism.</a> Cells. 9 (12), 2591(2020).</li>
<li>Torti, S. V., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%3A+More+ore+to+be+mined%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer: More ore to be mined.</a> Nat Rev Cancer. 13 (5), 342-355 (2013).</li>
<li>Zhang, C., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+homeostasis+and+tumorigenesis%3A+Molecular+mechanisms+and+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Iron homeostasis and tumorigenesis: Molecular mechanisms and therapeutic opportunities.</a> Protein Cell. 6 (2), 88-100 (2015).</li>
<li>Torti, S. V., Manz, D. H., Paul, B. T., Blanchette-Farra, N., Torti, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Nutr%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer.</a> Annu Rev Nutr. 38, 97-125 (2018).</li>
<li>Welch, D. R., Hurst, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+hallmarks+of+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Defining the hallmarks of metastasis.</a> Cancer Res. 79 (12), 3011-3027 (2019).</li>
<li>Lehmann, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+defects+of+hepatocellular+carcinoma+are+already+found+in+non-neoplastic+liver+cells+from+patients+with+hereditary+haemochromatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Epigenetic defects of hepatocellular carcinoma are already found in non-neoplastic liver cells from patients with hereditary haemochromatosis.</a> Hum Mol Genet. 16 (11), 1335-1342 (2007).</li>
<li>Fonseca-Nunes, A., Jakszyn, P., Agudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+cancer+risk--a+systematic+review+and+meta-analysis+of+the+epidemiological+evidence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Epidemiol+Biomarkers+Prev%22%5BJournal%5D)">Iron and cancer risk--a systematic review and meta-analysis of the epidemiological evidence.</a> Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (1), 12-31 (2014).</li>
<li>Abdelaal, G., Veuger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+oncogenic+transformation+with+iron+chelation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Reversing oncogenic transformation with iron chelation.</a> Oncotarget. 12 (2), 106-124 (2021).</li>
<li>Brown, R. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+iron+metabolism+and+impact+in+cancer+biology%2C+metastasis%2C+and+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Altered iron metabolism and impact in cancer biology, metastasis, and immunology.</a> Front Oncol. 10, 476(2020).</li>
<li>Menyhárt, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+selection+of+functional+assays+to+evaluate+the+hallmarks+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 300-319 (2016).</li>
<li>Basu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+novel+and+diverse+iron-chelators+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Inf+Model%22%5BJournal%5D)">Discovering novel and diverse iron-chelators in silico.</a> J Chem Inf Model. 56 (12), 2476-2485 (2016).</li>
<li>Prus, E., Fibach, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+measurement+of+the+labile+iron+pool+in+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry measurement of the labile iron pool in human hematopoietic cells.</a> Cytometry A. 73 (1), 22-27 (2008).</li>
<li>Cold Spring Harb. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Phosphate-buffered+saline+%28pbs%29%22">Phosphate-buffered saline (pbs)</a>. 2006 (1), Cold Spring Harb Prot. (2006).</li>
<li>Kontoghiorghes, G. J., Pattichis, K., Neocleous, K., Kolnagou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+development+of+deferiprone+%28l1%29+and+other+iron+chelators+for+clinical+use%3A+Targeting+methods+and+application+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">The design and development of deferiprone (l1) and other iron chelators for clinical use: Targeting methods and application prospects.</a> Curr Med Chem. 11 (16), 2161-2183 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ammonio ferro (II) solfato esaidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>215406</td><td>altrimenti noto come FAS</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td></td></tr><tr><td>Deferiprone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379409</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5652</td><td>priva di magnesio e calcio</td></tr><tr><td>Greiner CELLSTAR Piastre a 96 pozzetti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812</td><td>qualsiasi piastra a 96 pozzetti otticamente trasparente funzionerà</td></tr></tbody></table>

metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro 

Quantifiable and Inexpensive Cell-Free Fluorescent Method to Confirm the Ability of Novel Compounds to Chelate Iron

Per il metodo mostrato nella fase 2, questo primo esperimento (Figura 1) ha stabilito l'intervallo lineare del lettore di piastre a fluorescenza per microtitolazione quando rileva le emissioni fluorescenti di Calceina. I nostri risultati rappresentativi mostrano un ampio intervallo lineare di fluorescenza della calceina da 0 a 100 μM. L'ANOVA con l'analisi post hoc dell'LSD dimostra che esiste una differenza statisticamente significativa nella RFU media per tutte le concentrazioni di calceina rispetto a un controllo di 0 μM di calceina. In ulteriori esperimenti, è stata utilizzata la calceina da 1 μM (fasi 3 e 4) in quanto produce differenze statisticamente significative rispetto al controllo 0 μM e rientra nell'intervallo in cui viene comunemente applicata alle cellule sotto forma di calceina AM nella citometria a flusso13.
Per il metodo mostrato nel passaggio 3, dimostriamo che quando il ferro sotto forma di Fe2+ viene aggiunto in un intervallo da 0-1000 μM (come FAS) a 1 μM di calceina, gli ioni Fe2+ determinano una diminuzione lineare della fluorescenza della calceina (RFU). Ciò consente l'osservazione del quenching basato su Fe2+ della fluorescenza della calceina. La calceina, come debole chelante del ferro, lega il ferro e questo riduce l'emissione fluorescente. Nella Figura 2, le concentrazioni di 8,9 μM di FAS e superiori hanno mostrato una diminuzione significativa, p&lt;0,001, della fluorescenza della calceina rispetto a 1 μM di sola calceina. L'uso di 8,9 μM di FAS corrispondeva a una riduzione del 33% della fluorescenza della calceina (RFU media). Per ulteriori sperimentazioni (fase 4) è stato utilizzato FAS da 10 μM in quanto rientrava nell'intervallo di quenching fluorescente della calceina.
Per il metodo mostrato al passaggio 4, nella Figura 3 si può osservare la competizione della calceina per gli ioni Fe2+ da parte di un chelante del ferro. Il ferro sotto forma di Fe2+ diminuisce la fluorescenza della calceina dal controllo di 1 μM e il chelante del ferro deferiprone aumenta questa fluorescenza fino a un picco, rilasciando il quenching del ferro della calceina e aumentando la fluorescenza (RFU media). Il deferiprone (usato come esempio) a concentrazioni comprese tra 0,97 e 512 μM ha determinato aumenti statisticamente significativi della fluorescenza, come osservato con l'analisi post hoc ANOVA e LSD (p&lt;0,001). La più grande variazione di piega è stata una variazione di 3 volte della RFU media a 62,5 μM di chelante rispetto al controllo di 1 μM di calceina AM e 10 μM di FAS. Al di sopra di 512 μM di deferiprone non c'era alcuna differenza statisticamente significativa tra il chelante e il controllo di 1 μM di calceina e 10 μM di FAS.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig01.jpg"> Figura 1: Concentrazioni di calceina e fluorescenza (RFU) determinate utilizzando un lettore di piastre per microtitolazione fluorescente. Qui sono mostrate le concentrazioni di calceina di 0-100 μM incubate per 30 minuti e la fluorescenza (RFU) determinata. I dati mostrano la media di 8 repliche per esperimento e tre esperimenti indipendenti, le barre di errore mostrano un intervallo di confidenza del 95% nella media. La significatività statistica è indicata da ** dove p&lt;0,001 è determinato utilizzando l'analisi post hoc ANOVA e LSD (calcolata utilizzando il prisma del pad grafico). La RFU media della calceina di ciascuna concentrazione viene confrontata con il controllo della PBS e della calceina 0 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig02.jpg"> Figura 2: L'aumento della concentrazione di FAS si traduce in una diminuzione lineare della fluorescenza della calceina. La concentrazione di FAS è stata aumentata da 0 a 1000 μM, il che ha comportato una diminuzione lineare della fluorescenza della calceina di 1 μM dopo 30 minuti di incubazione in PBS I dati mostrati sono la media di 5 repliche per esperimento e tre esperimenti indipendenti, le barre di errore mostrano un intervallo di confidenza del 95% nella media. La significatività statistica è indicata da ** dove p&lt;0,001 è determinato utilizzando l'analisi post hoc ANOVA e LSD (calcolata utilizzando il prisma del pad grafico). La RFU media di calceina di ciascuna concentrazione di FAS e 1 μM di calceina viene confrontata con il controllo di 1 μM di calceina 0 μM di FAS nella PBS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66421/66421fig03.jpg"> Figura 3: Concentrazioni crescenti di deferiprone. La concentrazione di deferiprone è stata aumentata da 0 a 1000 μM con incubazione di 1 μM di calceina, 10 μM di FAS in PBS. La fluorescenza è stata misurata su un lettore multimodale di micropiastre. I dati mostrati sono la media di 5 repliche per esperimento e tre esperimenti indipendenti, le barre di errore mostrano un intervallo di confidenza del 95% nella media. La significatività statistica è indicata da ** dove p&lt;0,001 è determinato utilizzando l'analisi post-hoc ANOVA e LSD (calcolata utilizzando il prisma del pad grafico). RFU medio rispetto a 1 μM di calceina in PBS con 10 μM di FAS e 0 μM di Deferiprone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66421/66421fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Concentrazione (μm)</td>
			<td>Volume da (1 mM di magazzino)</td>
			<td>Volume di PBS</td>
			<td>Volume totale</td>
		</tr><tr><td>800</td>
			<td>800 μl</td>
			<td>200 μl</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>400</td>
			<td>400 μl</td>
			<td>600 μl</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>200</td>
			<td>200 μl</td>
			<td>800 μl</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>100</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>900 μl</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>50</td>
			<td>50 μl</td>
			<td>950 μl</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>25</td>
			<td>25 μl</td>
			<td>975 μL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>10</td>
			<td>10 μl</td>
			<td>990 μl</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>6 μl</td>
			<td>994 μl</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>2 μl</td>
			<td>998 μL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>1 μl</td>
			<td>999 μL</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Preparazione della pasta madre secondaria di calceina.

Metodo fluorescente quantificabile ed economico per confermare la capacità di nuovi composti di chelare il ferro 

Cancer cells require large amounts of iron to maintain their proliferation. Iron metabolism is considered a hallmark of cancer, making iron a valid target ...

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