Name: Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Scopri la rilevazione in tempo reale del cAMP in cellule vive utilizzando il biosensore cAMP Difference Detector In Situ. Questo metodo consente di monitorare la dinamica del cAMP con alta specificità in cellule HEK-293 e HASM.

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Questo studio è stato supportato dal National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) (HL169522).

I dettagli di tutti i reagenti e le attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.
1. Saggio ad alto rendimento con spettrofotometro a lettura su piastra
<ol><li>Semina di cellule HEK-293 con il vettore cADDis BacMam in una piastra a 96 pozzetti (Giorno 1)<ol><li>Dividere e infettare le cellule in un cappuccio virale.<ol><li>Caldo in HEK (Tabella 1) e tripsina-EDTA allo 0,25% in un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
			<li>Disinfettare la cappa e i materiali strofinandoli con fazzoletti imbevuti di EtOH.</li>
			<li>Rimuovere ed eliminare il terreno HEK dal pallone con una pipetta sierologica.</li>
			<li>Aggiungere 5 mL di DPBS libero da Mg2+ e Ca2+ (37 °C) con una pipetta sierologica. Inclinare il pallone avanti e indietro per lavare il fondo con DPBS. Rimuovere ed eliminare DPBS con una pipetta sierologica.</li>
			<li>Tripsinizzare le cellule aggiungendo 3 mL di tripsina-EDTA riscaldata allo 0,25% con una pipetta sierologica. Inclinare il pallone per assicurarsi che il reagente ricopra completamente il fondo del pallone. Mettere il coperchio sul pallone e lasciare riposare il reagente per 3-5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dal pallone. NOTA: Questo esperimento è ottimizzato per un pallone da 75 cm2 ; Potrebbe essere necessario effettuare aggiustamenti del volume dei reagenti se si utilizza un apparato di coltura di dimensioni diverse.</li>
			<li>Aspirare 5 ml di terreno fresco contenente antibiotici. Espellere e prelevare il volume del pallone per lavare le pareti del pallone e staccare fisicamente le cellule.</li>
			<li>Raccogliere il volume totale del matraccio (8 mL) e centrifugare (25 °C) in una provetta da 15 mL a 200 x g per 5 minuti.</li>
			<li>Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica, facendo attenzione a non disturbare il pellet.</li>
			<li>Per lavare le celle senza disturbare il pellet, aggiungere 500 μL di DPBS senza Mg2+ e Ca2+ DPBS sul lato della provetta da 15 mL. Dopo aver aggiunto delicatamente il DPBS, rimuovere ed eliminare quanto più tampone possibile senza disturbare il pellet. Ripeti ancora una volta.</li>
			<li>Contare le cellule e regolare fino a una densità cellulare di 250.000 cellule/mL di cellule.</li>
			<li>Preparare una miscela master in base ai volumi di reagente necessari per pozzetto di una piastra nera trasparente a 96 pozzetti. Questo è indicato come "piastra di tessuto". Vedi i volumi qui sotto: NOTA: Esempio di 1 pozzetto (volume totale 200 μL): 40 μL del vettore BacMam del biosensore (stock di 2 x 1010 geni virali/mL), 2 μL di tricostatina A (stock di 100 μM; concentrazione finale 1 μM), 158 μL di densità cellulare di 250.000 cellule/mL. Esempio di 10 pozzetti (volume totale 2 mL): 400 μL del vettore BacMam del biosensore (stock di 2 x 1010 geni virali/mL), 20 μL di tricostatina A (stock di 100 μM), 1.580 μL di terreno con densità cellulare di 250.000 cellule/mL.</li>
			<li>Aggiungere 200 μl di master mix per pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 in un incubatore per 24 ore prima di utilizzarle sullo spettrofotometro a lettura di piastre.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Esecuzione su un lettore di targhe<ol><li>Su un banco, rimuovere con cautela tutti i terreni in ciascun pozzetto e sostituirli con 180 μl di DPBS con Mg2+ e Ca2+ a 37 °C.</li>
		<li>Ispeziona le cellule al microscopio per confermare la salute delle cellule.</li>
		<li>Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubare a 37 °C per 30 min-1 h.</li>
		<li>Durante l'incubazione, preparare i farmaci per la lettura a diluizione 1:10 (detta anche 10 volte) per la dose finale desiderata. Quindi, preparare 100 μM di forskolina e 100 nM di isoproterenolo.</li>
		<li>Aggiungere 60 μl di ciascun farmaco in modo colonnare a una piastra trasparente a 96 pozzetti (denominata "piastra del farmaco"). NOTA: Con l'adeguata diluizione del farmaco e per ottimizzare la lettura, i farmaci vengono aggiunti a una piastra trasparente a 96 pozzetti, denominata "piastra del farmaco", per essere trasferiti al momento della lettura alla "piastra di tessuto" utilizzando un pipettatore multiplo a 96, consentendo al farmaco di essere aggiunto a tutti i pozzetti contemporaneamente e di essere letto rapidamente dallo spettrofotometro fluorescente.</li>
	</ol></li>
	<li>Configurazione del lettore di piastre a fluorescenza<ol><li>Regolare le impostazioni del lettore di piastre a fluorescenza.<ol><li>Modalità di lettura: fluorescenza. Tipo di lettura: cinetico. Lettura delle lunghezze d'onda: 494 nm e 522 nm.</li>
			<li>Tempo di lettura: Inserire 3 minuti per la lettura fluorescente di base e 7 minuti per l'aggiunta post-farmaco. Intervallo" viene immesso come 00:00:30 per 30 s tra ogni lettura. NOTA: Il tempo di lettura può essere ottimizzato e aumentato in base al tempo richiesto.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Acquisizione dati<ol><li>Rimuovere la piastra di tessuto dall'incubatrice, rimuovere il foglio di alluminio e il coperchio della piastra e posizionare la piastra di tessuto nel lettore di piastre. Chiudere il cassetto del lettore per consentire alla piastra di tessuto di riposare e bilanciarsi alla temperatura del lettore (37 °C).</li>
		<li>Posizionare la piastra trasparente a 96 pozzetti (piastra per farmaci) con le diluizioni del farmaco sotto la pipetta multipla a 96 e fare pratica con l'estrazione di 20 μl dai pozzetti. Assicurarsi che ci sia un volume uniforme di farmaco aspirato nelle punte del pipettatore.</li>
		<li>Avviare un'esecuzione di misurazione "di base". NOTA: 40 RFU o superiori sono considerati dati validi. Se i dati sono inferiori a questo valore, l'esperimento deve essere interrotto ed eliminato.</li>
		<li>La piastra di tessuto verrà espulsa dal lettore al termine dell'esecuzione di base. Aggiungere rapidamente e con attenzione 20 μl dalla piastra del farmaco trasparente alla piastra di tessuto nero. Quindi, inizia rapidamente la corsa di "trattamento". La piastra di tessuto non deve essere fuori dal lettore per più di 30 secondi dopo l'aggiunta dei farmaci. NOTA: Se il farmaco viene aggiunto troppo rapidamente, le cellule si staccano dalla piastra di tessuto, creando un esperimento inutilizzabile. Inoltre, le cellule sono infettate da una proteina fluorescente verde sensibile alla luce; Pertanto, l'aggiunta rapida e tempestiva dei farmaci e l'inizio della seconda lettura sono imperativi per evitare di perdere la parte iniziale della risposta.</li>
		<li>Una volta completata la seconda lettura, assicurarsi che la piastra di tessuto sia espulsa dal lettore e che la raccolta dei dati sia conclusa. NOTA: Prima di smaltire la piastra di tessuto, è buona norma verificare che le cellule siano ancora attaccate alla piastra. Osserva le cellule al microscopio. Se le celle si staccano, i risultati non sono validi e devono essere eliminati. L'esperimento dovrà essere ripetuto.</li>
		<li>Esporta i dati risultanti come file Excel.</li>
		<li>Apri i dati leggibili in Excel esportati dal lettore di lastre e copia e incolla le informazioni rilevanti nel modello di conversione Excel. I dati si trasformeranno dalla configurazione del lettore di piastre a un singolo pozzetto, con le letture delle colonne a destra dei dati copiati. NOTA: Le colonne di fluorescenza per un pozzo nel tempo sono elencate in RFU (trasformazione di colonna titolata) e come variazione decimale relativa alla lettura RFU alla lettura iniziale (t0 intitolato Delta F). Nel modello Excel, la tabella Delta F è impostata sull'ultima lettura di base prima dell'aggiunta del farmaco. Questo è il 6° punto diraccolta dati.</li>
		<li>Dopo la trasformazione dei dati, copiare i dati da Delta F e incollarli nel software di analisi dei dati come decadimento o decadimento relativo in fluorescenza nel tempo.</li>
		<li>Modificare il titolo X in "time (s)" e il titolo Y in "ΔF/F0" per i valori decimali relativi.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Saggio su singola cellula utilizzando un microscopio a fluorescenza invertita
<ol><li>Semina di cellule (HASM) con il vettore cADDis BacMam in una piastra da 35 mm (Giorno 1)<ol><li>Dividere e infettare le cellule in un cappuccio virale.<ol><li>Terreno HASM caldo (Tabella 1), tripsina-EDTA allo 0,25% in un bagno d'acqua a 37 °C.</li>
			<li>Disinfettare la capottina e i materiali e pulire la calotta con fazzoletti imbevuti di EtOH.</li>
			<li>Rimuovere ed eliminare il terreno HASM dal matraccio con una pipetta sierologica.</li>
			<li>Aggiungere 5 mL di DPBS libero da Mg2+ e Ca2+ (37 °C) con una nuova pipetta sierologica e inclinare il pallone per lavare il fondo con il DPBS.</li>
			<li>Tripsinizzare le cellule aggiungendo 3 mL di tripsina-EDTA riscaldata allo 0,25% con una pipetta sierologica. Inclinare il pallone per assicurarsi che il reagente ricopra completamente il fondo del pallone. Lasciare riposare il reagente per 3-5 minuti per consentire alle cellule di staccarsi dal pallone.</li>
			<li>Aspirare 5 mL di terreno fresco contenente antibiotici ed espellere la pipetta per rimuovere le cellule dal fondo del pallone.</li>
			<li>Raccogliere il volume totale della centrifuga in un pallone da centrifuga a 200 x g per 5 minuti.</li>
			<li>Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica, facendo attenzione a non disturbare il pellet.</li>
			<li>Senza disturbare il pellet, aggiungere 500 μL di DPBS senza Mg2+ e Ca2+ DPBS sul lato della provetta da centrifuga. Rimuovere ed eliminare quanto più liquido possibile e ripetere ancora una volta. NOTA: Questo esperimento è ottimizzato per un pallone da 75 cm2 ; Potrebbe essere necessario effettuare aggiustamenti del volume dei reagenti se si utilizza un apparato di coltura di dimensioni diverse.</li>
			<li>Contare le cellule e regolare la densità a 40.000 cellule/mL.</li>
			<li>Preparare una miscela master in base al volume di reagente necessario per pozzetto di una piastra da 35 mm. Vedi i volumi qui sotto: NOTA: Esempio di 1 pozzetto (volume totale 500 μL): 20 μL del vettore BacMam del biosensore (stock di 2 x 1010 geni virali/mL), 5 μL di tricostatina A (stock di 100 μM, concentrazione finale 1 μM), 500 μL di densità cellulare di 40.000 cellule/mL. Esempio per 4 pozzetti (volume totale 2 mL): 80 μL del vettore BacMam del biosensore (stock di geni virali/mL), 20 μL di tricostatina A (stock di 100 μM, concentrazione finale 1 μM), 2000 μL di terreno 40.000 cellule/mL di densità cellulare.</li>
			<li>Aggiungere 500 μl di miscela master per pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C e 5% di CO2 per 24 ore prima di continuare l'esperimento. NOTA: Il numero di celle può variare in base alla linea cellulare. Per evitare la sovrapposizione di celle per l'analisi, utilizzare un numero di celle basso.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione degli agenti farmacologici (Giorno 2)<ol><li>Rimuovere con cautela il terreno in ciascun pozzetto e sostituirlo con 450 μl di DPBS con Mg2+ e Ca2+ a 37 °C.</li>
		<li>Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubare il disco da 35 mm a 37 °C per 30 min-1 h.</li>
		<li>Ispeziona le cellule al microscopio per confermare la salute delle cellule.</li>
		<li>Nel frattempo, preparare i farmaci per la lettura di 1 unità logaritmica al di sopra della concentrazione finale desiderata (10 volte maggiore). Quindi, preparare 100 μM di forskolina e 100 nM di isoproterenolo.</li>
		<li>Per i titoli di dose logaritmica, preparare il farmaco a 10 mM e utilizzare diluizioni seriali per ottenere 100 μM di forskolina e 100 nM di isoproterenolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Acquisizione dati NOTA: Le seguenti impostazioni si riferiscono a un microscopio invertito fluorescente. Il software che accompagna ogni microscopio può differire; Le impostazioni generali utilizzate nel protocollo corrente sono descritte qui.<ol><li>Accendere il mozzo centrale, quindi il microscopio a fluorescenza invertito.</li>
		<li>Apri il software che verrà utilizzato per l'acquisizione e scegli l'opzione di acquisizione time-lapse .</li>
		<li>Posizionare un portacampione da 35 mm nel tavolino del microscopio.</li>
		<li>Impostare la lente dell'obiettivo su x20.</li>
		<li>Usa l'autofocus e ottieni un'immagine il più chiara possibile. Se è difficile trovare le singole celle, inizia con un obiettivo 4x, quindi passa a 20x. Mettere a fuoco manualmente il campione se il microscopio non dispone di una funzione di messa a fuoco automatica. NOTA: L'ingrandimento di 40x può essere utilizzato se sono necessari dettagli morfologici cellulari più significativi.</li>
		<li>Regolare le seguenti impostazioni per ottenere un'acquisizione ottimale dei dati: Luminosità automatica (esposizione), Lunghezza d'onda di eccitazione, Bilanciamento del nero (per ridurre il rumore di fondo), Messa a fuoco automatica.</li>
		<li>Dopo aver trovato un'area di vista con diverse cellule citoplasmatiche fluorescenti, acquisire i dati utilizzando l'acquisizione time-lapse per 20 minuti ogni 30 s.</li>
		<li>Clicca su vai per iniziare la lettura.</li>
		<li>Corri per 3 minuti per raccogliere la linea di base. Non appena viene eseguita la cattura di 3 minuti, aggiungere delicatamente 50 μl di farmaco nel pozzetto appropriato. Quando i farmaci vengono aggiunti, la concentrazione finale sulla piastra sarà di 10 μM di forskolina e 10 nM di isoproterenolo. NOTA: Il farmaco deve essere aggiunto con attenzione; Non toccare la piastra con la punta della pipetta, poiché ciò potrebbe spostare il campo visivo realizzato e rendere impossibile l'analisi del campione.</li>
		<li>Lasciare l'esperimento in esecuzione per altri 17 minuti con l'acquisizione dei dati ogni 30 s.</li>
		<li>Una volta completato il test, assicurarsi che i dati siano pronti per l'analisi. NOTA: Sebbene l'attuale protocollo non incorpori un controllo per la deriva focale, potrebbe essere utile includerne uno nell'esperimento. Ad esempio, l'uso di coloranti nucleari può aiutare a gestire la deriva focale durante l'analisi al microscopio, specialmente quando si acquisiscono immagini di cellule vive per periodi prolungati. I biosensori cADDis sono in genere ampiamente distribuiti all'interno della cellula, rendendo un piano focale ampio l'acquisizione più efficace e riducendo la necessità di controllare la deriva focale9.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi dei dati NOTA: Il software fornito con ciascun microscopio può differire, quindi le impostazioni generali che devono essere utilizzate per analizzare le immagini acquisite sono descritte qui.<ol><li>Aprire i file di immagine acquisiti durante l'esperimento.</li>
		<li>Utilizzare lo strumento poligono o cerchio per selezionare la regione di interesse di ciascuna cella per eseguire l'analisi. L'analisi dovrebbe fornire la luminosità di ciascuna cella in ogni punto temporale. NOTA: La migliore pratica consiste nel selezionare singole celle e non celle che toccano la parete della piastra o altre celle. Ciò garantisce la migliore raccolta di dati possibile. Selezionare un minimo di 5 celle per l'analisi all'interno di ciascuna condizione e replicare l'esperimento almeno tre volte.</li>
		<li>Dopo aver analizzato i dati, apri i dati in un foglio Excel e calcola la luminosità media per ogni condizione ad ogni foto, iniziando dall'immagine appena prima di aggiungere gli agenti farmacologici o il veicolo. In questo esempio, al minuto 3 o alla sestafoto scattata al microscopio, poiché ogni foto viene scattata ogni 30 s.</li>
		<li>Calcola ΔF/F0 per ogni valore medio in ogni condizione.</li>
		<li>Caricare in un software di analisi statistica e tracciare ΔF/F0 rispetto al tempo in s. NOTA: La Figura 1 fornisce una panoramica schematica dei passaggi principali dei protocolli.</li>
	</ol></li>
</ol>

Analisi cAMP con cADDis: screening da singola cellula a alto rendimento

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<li>Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+methods+for+detection+and+measurement+of+cyclic+amp+and+adenylyl+cyclase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical methods for detection and measurement of cyclic amp and adenylyl cyclase activity.</a> Methods Mol Biol. 126, 363-374 (2000).</li>
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<li>Deal, J., Pleshinger, D. J., Johnson, S. C., Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Milestones+in+the+development+and+implementation+of+fret-based+sensors+of+intracellular+signals%3A+A+biological+perspective+of+the+history+of+fret%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">Milestones in the development and implementation of fret-based sensors of intracellular signals: A biological perspective of the history of fret.</a> Cell Signal. 75, 109769(2020).</li>
<li>Leavesley, S. J., Rich, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+limitations+of+fret+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Overcoming limitations of fret measurements.</a> Cytometry A. 89 (4), 325-327 (2016).</li>
<li>Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+of+lipid-modified+monomeric+GFPS+into+membrane+microdomains+of+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Partitioning of lipid-modified monomeric GFPS into membrane microdomains of live cells.</a> Science. 296 (5569), 913-916 (2002).</li>
<li>Agarwal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+cAMP+signaling+associated+with+lipid+raft+and+non-raft+membrane+domains+in+adult+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized cAMP signaling associated with lipid raft and non-raft membrane domains in adult ventricular myocytes.</a> Front Pharmacol. 9, 332(2018).</li>
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<li>Schmidt, M., Cattani-Cavalieri, I., Nunez, F. J., Ostrom, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphodiesterase+isoforms+and+cAMP+compartments+in+the+development+of+new+therapies+for+obstructive+pulmonary+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Phosphodiesterase isoforms and cAMP compartments in the development of new therapies for obstructive pulmonary diseases.</a> Curr Opin Pharmacol. 51, 34-42 (2020).</li>
<li>Ostrom, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+roles+of+mammalian+transmembrane+adenylyl+cyclase+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Physiological roles of mammalian transmembrane adenylyl cyclase isoforms.</a> Physiol Rev. 102 (2), 815-857 (2022).</li>
<li>Auld, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+chemical+libraries+for+luciferase+inhibitory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of chemical libraries for luciferase inhibitory activity.</a> J Med Chem. 51 (8), 2372-2386 (2008).</li>
<li>De Logu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+endosome+CGRP+signals+elicit+periorbital+mechanical+allodynia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Schwann cell endosome CGRP signals elicit periorbital mechanical allodynia in mice.</a> Nat Commun. 13 (1), 646(2022).</li>
<li>Wray, N. H., Schappi, J. M., Singh, H., Senese, N. B., Rasenick, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDAR-independent%2C+cAMP-dependent+antidepressant+actions+of+ketamine%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">NMDAR-independent, cAMP-dependent antidepressant actions of ketamine.</a> Mol Psychiatry. 24 (12), 1833-1843 (2019).</li>
<li>Thornquist, S. C., Pitsch, M. J., Auth, C. S., Crickmore, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+evidence+accumulates+across+neurons+to+drive+a+network-level+eruption%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Biochemical evidence accumulates across neurons to drive a network-level eruption.</a> Mol Cell. 81 (4), 675-690 (2021).</li>
<li>Zhang, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypothalamic+dopamine+neurons+motivate+mating+through+persistent+cAMP+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hypothalamic dopamine neurons motivate mating through persistent cAMP signalling.</a> Nature. 597 (7875), 245-249 (2021).</li>
<li>Lutas, A., Fernando, K., Zhang, S. X., Sambangi, A., Andermann, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History-dependent+dopamine+release+increases+cAMP+levels+in+most+basal+amygdala+glutamatergic+neurons+to+control+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">History-dependent dopamine release increases cAMP levels in most basal amygdala glutamatergic neurons to control learning.</a> Cell Rep. 38 (4), 110297(2022).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Area+postrema+cell+types+that+mediate+nausea-associated+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Area postrema cell types that mediate nausea-associated behaviors.</a> Neuron. 109 (3), 461-472 (2021).</li>
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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Una misurazione accurata e sensibile del cAMP è fondamentale per comprendere il suo ruolo in vari processi cellulari e per studiare l'attività delle vie di segnalazione dipendenti dal cAMP. Esistono diversi metodi comunemente impiegati per misurare i livelli di cAMP, tra cui ELISA, test radioimmunologico, biosensori FRET e il test cAMP GloSensor 14,15,16,17,18.</sup...

L'adenosina 3',5'-monofosfato ciclico, cAMP, svolge un ruolo centrale nella comunicazione cellulare e nel coordinamento di vari processi fisiologici. Il cAMP agisce come un secondo messaggero, trasmettendo segnali esterni da ormoni, neurotrasmettitori o altre molecole extracellulari per avviare una cascata di eventi intracellulari1. Inoltre, il cAMP è coinvolto in modo complesso in varie vie di segnalazione, comprese quelle associate ai recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e alle adenilil ciclasi. Comprendere il ruolo del cAMP nella segnalazione cellulare è fondamentale per svelare i complessi meccanismi che sono alla base delle normali funzioni cellulari e per lo sviluppo di potenziali terapie per un'ampia gamma di condizioni mediche2.
In passato, sono stati impiegati vari metodi per misurare il cAMP direttamente o indirettamente. Questi includevano la radiomarcatura dei pool cellulari di ATP seguita da purificazione della colonna, HPLC, saggi radioimmunologici e saggi immunologici enzimatici 1,2. Questi saggi legacy sono limitati dal fatto che si tratta di misure end-point, che richiedono un gran numero di campioni per costruire risposte dipendenti dal tempo. Più recentemente, i sensori FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) sono stati sviluppati per creare saggi nelle cellule viventi, producendo dati dinamici in tempo reale e consentendo ai sensori di essere indirizzati in diverse posizioni subcellulari3. FRET sfrutta due fluorofori, un donatore fluorescente e un accettore fluorescente che, quando si trovano nelle immediate vicinanze, il fluoroforo accettore sarà eccitato dall'uscita fluorescente del donatore. I due fluorofori più utilizzati sono la proteina fluorescente ciano (CFP) e la proteina fluorescente gialla (YFP) poiché hanno proprietà di eccitazione ed emissione compatibili. Oltre a CFP e YFP, l'utilizzo della proteina fluorescente verde (GFP) e della proteina fluorescente rossa (RFP) è comunemente utilizzato per i biosensori FRET. I biosensori FRET cAMP funzionano con un donatore e un accettore alle estremità opposte della proteina legante il cAMP Epac2. Il legame cAMP altera la conferma di Epac e aumenta la distanza tra i fluorofori donatore e accettore 3,4. Questo cambiamento conformazionale è rilevato da una perdita di FRET, cioè dall'eccitazione del fluoroforo accettore da parte dell'energia trasferita dalle gocce di fluoroforo donatore3. Sebbene sia un processo apparentemente semplice, ci sono molte limitazioni e problemi con il biosensore FRET per la ricerca cAMP5. Uno dei quali è la selezione di proteine fluorescenti, ad esempio la GFP, che possono dimerizzare naturalmente, riducendo così la sensibilità6. I biosensori cAMP basati su FRET sono stati mirati a specifici microdomini7, ma potrebbero esserci limitazioni a causa delle grandi dimensioni di un costrutto con due fluorofori6. Un altro problema significativo è il basso rapporto segnale/rumore dei segnali FRET risultante dalla sovrapposizione tra eccitazione ed emissione del fluoroforo, con conseguente elevata frequenza di campionamento e complicando l'analisi dei risultati 4,5.
Più recentemente, il nuovo biosensore (cAMP Difference Detector In Situ), cADDis ha risolto queste e altre limitazioni quando si tratta di studiare la regolazione della segnalazione cAMP8. Un miglioramento importante è la dipendenza da un singolo fluoroforo. Ciò consente di ottenere un segnale rapido ed efficiente con una gamma dinamica più ampia e un elevato rapporto segnale/rumore. Di conseguenza, ci può essere una maggiore precisione in quanto c'è una gamma meno ampia di lunghezze d'onda da pettinare8. Come le sonde FRET, il biosensore è stato mirato alle posizioni subcellulari, consentendo la ricerca sulla teoria della compartimentazione e l'esplorazione in zattere lipidiche e non-zattere e altri domini subcellulari9. Forse la cosa più importante è l'idoneità di un singolo biosensore fluoroforo per lo screening ad alto rendimento, che ha migliorato la sensibilità e la riproducibilità rispetto ai biosensori basati su FRET. Il biosensore è inserito in un vettore BacMam per una facile trasduzione di un'ampia gamma di tipi di cellule e un controllo preciso sull'espressione proteica.
Il controllo dell'espressione tramite il vettore BacMam può essere particolarmente utile nei saggi che utilizzano ortologhi GPCR di specie diverse per facilitare l'interpretazione dei dati provenienti da studi sugli animali. Inoltre, il controllo sull'espressione dei recettori è fondamentale per misurare i diversi gradi di efficacia dei farmaci (ad esempio, agonisti inversi e agonisti parziali), e bassi livelli di espressione dei recettori sono utili per imitare i bassi livelli riscontrati nei tessuti animali. BacMam è un vettore di baculovirus che è stato modificato per trasdurre cellule di mammifero come colture cellulari primarie e linee HEK-29310. I marcatori dominanti selezionabili consentono a BacMam di fornire una maggiore stabilità rispetto alle tradizionali infezioni plasmidiche11. Tali promotori selettivi consentono una consegna e un'espressione genica più efficienti. Inoltre, l'aggiunta di tricostatina A (un inibitore dell'istone deacetilasi) aumenta i livelli di proteina reporter11. I livelli di espressione possono essere controllati tramite il titolo del virus BacMam utilizzato e devono essere ottimizzati per ogni tipo di cellula. Nel caso di questo biosensore, una proteina fluorescente rossa o verde è legata all'Epac ai terminali N e C. Quando il cAMP si lega, un cambiamento conformazionale nel biosensore sposta gli amminoacidi adiacenti alla proteina fluorescente. Tale spostamento sposta l'assorbanza dallo stato anionico allo stato neutro a 400 nm, diminuendo così la fluorescenza.
Ci sono 90-120 GPCR espressi in una singola cellula che rispondono a un'ampia varietà di segnali neuroumorali12. Pertanto, si può ipotizzare che almeno diverse dozzine di GPCR per cellula possano stimolare o inibire il cAMP attraverso l'accoppiamento Gs o Gi, rispettivamente. Sebbene siano stati compiuti progressi nel monitoraggio di questo secondo messenger in tempo reale, come FRET, sono necessari metodi più efficienti. Qui viene presentata la metodologia per monitorare la sintesi e la degradazione dei segnali cAMP utilizzando cADDis in tempo reale. La variazione della fluorescenza può essere monitorata in tempo reale utilizzando un lettore di piastre a fluorescenza per saggi ad alta produttività o utilizzando un microscopio a fluorescenza per saggi su singola cellula. Questi metodi sono utili per un'ampia gamma di questioni biologiche riguardanti la segnalazione GPCR tramite cAMP.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 96 pozzetti (trasparente)</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-203</td><td></td></tr><tr><td>Piastra da 35 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627870</td><td>Piastre per colture cellulari con fondo in vetro</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3904</td><td>Nero con fondo piatto trasparente</td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Per terreni HEK e HASM</td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza BZ-X</td><td>Keyence</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio (IM)</td><td>Quality Biological Inc</td><td>E506</td><td>Per terreni HASM</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga (15 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ( 1x)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>HEK media</td></tr><tr><td>DPBS con Mg2+ e Ca2+&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>DPBS senza Mg2+ e Ca2+</td><td>Corning</td><td>14040-133</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>R& Sistemi D</td><td>S11195</td><td>per terreni HEK e HASM</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Millipore</td><td>344270</td><td></td></tr><tr><td>Farmaco Green Down cADDis cAMP Kit di analisi</td><td>Montana Molecolare</td><td>#D0200G</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>F-12K&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21127022</td><td>Per terreni HASM</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Per terreni HASM</td></tr><tr><td>Isoproterenolo</td><td>Sigma</td><td>I6504</td><td>Farmaco</td></tr><tr><td>L-glutammina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Per terreni HASM</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga (2 mL)</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Antibiotico per terreni HASM</td></tr><tr><td>RNAsi via</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>700511 Reagente</td></tr><tr><td>Soluzione di idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>Per mezzi HASM</td></tr><tr><td>Lettore di piastre Spectrmax M5</td><td>Molecular Devices Tricostatina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A</td><td>TCI America</td><td>T2477</td><td>Reagente</td></tr><tr><td>Tripsina EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

dinamica del camp in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente camp in situ

Real-Time cAMP Dynamics in Live Cells Using the Fluorescent cAMP Difference Detector In Situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) è un nuovo biosensore che consente la misurazione continua dei livelli di cAMP nelle cellule viventi. Il biosensore è creato da una proteina fluorescente permutata circolarmente legata alla regione cerniera di Epac2. Questo crea un singolo biosensore fluoroforo che mostra un aumento o una diminuzione della fluorescenza al legame del cAMP. Il biosensore esiste nelle versioni rosse e verdi verso l'alto, così come nelle versioni verdi verso il basso e in diverse versioni rosse e verdi mirate alle posizioni subcellulari. Per illustrare l'efficacia del biosensore, è stata utilizzata la versione verde verso il basso, che diminuisce in fluorescenza dopo il legame con il cAMP. Vengono dimostrati due protocolli che utilizzano questo sensore: uno che utilizza uno spettrofotometro di lettura a piastra a 96 pozzetti compatibile con lo screening ad alto rendimento e un altro che utilizza l'imaging a singola cellula su un microscopio a fluorescenza. Sul lettore di piastre, le cellule HEK-293 coltivate in piastre a 96 pozzetti sono state stimolate con 10 μM di forskolina o 10 nM di isoproterenolo, che ha indotto rapide e ampie diminuzioni della fluorescenza nella versione verde verso il basso. Il biosensore è stato utilizzato per misurare i livelli di cAMP in singole cellule muscolari lisce delle vie aeree umane (HASM) monitorate al microscopio a fluorescenza. Il biosensore verde verso il basso ha mostrato risposte simili a popolazioni di cellule quando stimolato con forskolina o isoproterenolo. Questo test a singola cellula consente la visualizzazione della posizione del biosensore con un ingrandimento di 20x e 40x. Pertanto, questo biosensore di cAMP è sensibile e flessibile e consente la misurazione in tempo reale del cAMP sia in cellule immortalizzate che primarie e con singole cellule o popolazioni di cellule. Questi attributi rendono cADDis uno strumento prezioso per studiare le dinamiche di segnalazione del cAMP nelle cellule viventi.

Il presente studio ha convalidato il biosensore citosolico sia in saggi con lettore di piastre che al microscopio. Una volta che le cellule hanno espresso il biosensore, sono state stimolate con 10 μM di forskolina (un attivatore diretto dell'adenilil ciclasi), 10 nM di isoproterenolo (un agonista a ß1AR e ß2AR) o veicolo (Figura 1). Le successive variazioni della fluorescenza, indicative della produzione di cAMP, sono state catturate ogni 30 s.
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Il protocollo presentato in questo studio illustra l'efficacia del cAMP Difference Detector In Situ nella misurazione del cAMP attraverso due metodi. Un metodo utilizza uno spettrofotometro per la lettura di piastre a 96 pozzetti con celle HEK-293. L'altro metodo dimostra le singole cellule HASM sotto un microscopio a fluorescenza.

Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) is a novel biosensor that allows for the continuous measurement of cAMP levels in living cells. The biosensor is ...

Ci occupiamo dell'organizzazione dei micro domini KP ciclistici con particolare attenzione a chiarire come questi compartimenti si formano e si sostengono. Cerchiamo di scoprire i componenti chiave che consentono alle cellule di discernere i segnali spaziali all'interno di questi domini, esplorando la variazione nella loro interpretazione e come queste caratteristiche sono alterate in malattie come l'asma e la BPCO. Infettare le cellule primarie utilizzando il vettore di Beckman è una sfida.A tal fine, la condizione deve essere ottimizzata per il singolo tipo di cellula al fine di ottenere un'espressione sufficiente del biosensore. Questo protocollo consente il rilevamento e il monitoraggio in tempo reale, che va da minuti a ore, e la misurazione della dinamica del ciclocampo all'interno delle cellule viventi. Di conseguenza, i segnali generati da questo saggio sono direttamente correlati ai livelli ciclici di P, riducendo significativamente la potenziale interferenza da parte degli altri componenti cellulari e fornendo risultati affidabili.

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RNA polimerasi II cinetica trascrizionali sono misurate su specifici geni nelle cellule viventi. mRNA trascritto dal gene di interesse sono fluorescente tag e l'utilizzo di recupero di fluorescenza dopo photobleaching (FRAP) la cinetica in vivo di allungamento della trascrizione si ottengono.

Misurazione della Cinetica di Trascrizione mRNA nelle cellule viventi singolo

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Monitoraggio Attività chinasi e fosfatasi attraverso il ciclo cellulare da raziometrica FRET

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Förster trasferimento di energia di risonanza (FRET) microscopia è una potente tecnica di monitoraggio in tempo reale degli eventi di segnalazione nelle cellule in diretta tramite biosensori vari giornalisti. Qui si descrive come costruire un epifluorescenza personalizzato FRET sistema di imaging da componenti disponibili in commercio e come usarlo per esperimenti FRET.

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A causa del basso rapporto segnale-rumore (SNR) dei sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Fӧrster (FRET), la misurazione dei segnali cAMP è stata impegnativa, specialmente in tre dimensioni spaziali. Qui, descriviamo una metodologia di imaging e analisi FRET iperspettrale che consente la misurazione della distribuzione cAMP in tre dimensioni spaziali.

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Presentiamo un metodo per l'acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.

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Presentiamo un protocollo sperimentale e un flusso di lavoro di analisi dei dati per eseguire la spettroscopia di correlazione incrociata a fluorescenza a doppio colore (FCCS) combinata con il trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) per studiare la dinamica del recettore di membrana nelle cellule vive utilizzando le moderne tecniche di etichettatura a fluorescenza.

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Scopri la rilevazione in tempo reale del cAMP in cellule vive utilizzando il biosensore cAMP Difference Detector In Situ. Questo metodo consente di monitorare la dinamica del cAMP con alta specificità in cellule HEK-293 e HASM.

Dinamica del cAMP in tempo reale in cellule vive utilizzando il rivelatore di differenza fluorescente cAMP in situ

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