Name: Elettromiografia a fibra singola stimolata (SFEMG) per la valutazione della trasmissione della giunzione neuromuscolare in modelli di roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Impara la tecnica SFEMG per valutare la trasmissione della giunzione neuromuscolare in modelli di roditori. Questo metodo consente di quantificare jitter e blocchi dei potenziali d'azione in vivo.

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Tutti i protocolli sono stati approvati ed eseguiti in conformità con le normative stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università del Missouri.
1. Preparazione degli animali e somministrazione dell'anestesia
<ol><li>Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.</li>
	<li>Prima della procedura, misurare il peso del ratto per determinare la dose appropriata per i farmaci basati sul peso e le impostazioni del ventilatore.</li>
	<li>Indurre l'anestesia con isoflurano inalato al 3%-5%. Una volta stabilito un livello adeguato di anestesia, posizionare il ratto in posizione prona e mantenere l'anestesia con l'1%-3% di isoflurano inalato.</li>
	<li>Verificare l'adeguatezza della profondità dell'anestesia premendo delicatamente il cuscinetto del piede dell'arto posteriore con una pinza per osservare l'assenza di una risposta di ritiro.</li>
	<li>Mantenere la temperatura corporea a 37 °C.</li>
	<li>Applicare un unguento a base di petrolio approvato dal veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Monitora la profondità dell'anestesia osservando la frequenza respiratoria e valutando le risposte di astinenza quando applichi pressione al cuscinetto del piede usando una pinza.</li>
	<li>Radere l'arto posteriore da valutare con un tagliacapelli. Dopo un'adeguata epilazione, utilizzando del nastro adesivo, posizionare l'arto da studiare con la caviglia fissata a circa 90° di dorsiflessione, il ginocchio in estensione e l'anca in abduzione.</li>
	<li>Monitorare continuamente la respirazione e la frequenza cardiaca del ratto durante l'intero esperimento. NOTA: Un aumento della frequenza cardiaca è comunemente usato come indicatore di una profondità anestesiologica inadeguata.</li>
	<li>Somministrare isoflurano per l'eutanasia del ratto, con una dose del 5% o superiore, fino a quando la respirazione non si è interrotta per almeno 3 minuti. Confermare l'eutanasia per decapitazione.</li>
</ol>2. Posizionamento e configurazione dell'elettrodo
NOTA: La trasmissione NMJ del nervo sciatico e del muscolo gastrocnemio viene valutata utilizzando il sistema elettromiografico (EMG). Fare riferimento alla Tabella dei materiali.
<ol><li>Inserire un paio di aghi monopolari isolati da 28 G per stimolare il nervo sciatico con il catodo nella regione dell'arto posteriore prossimale, mentre l'anodo è più prossimalmente all'interno del tessuto sottocutaneo che si sovrappone all'osso sacro.</li>
	<li>Assicurarsi che gli elettrodi stimolanti non siano posizionati nelle immediate vicinanze del nervo sciatico o eccessivamente profondi per evitare danni diretti al nervo sciatico o ad altre strutture adiacenti.</li>
	<li>Posizionare un elettrodo di terra monouso sull'arto posteriore o sulla coda controlaterale.</li>
	<li>Posizionare con cautela un elettrodo ad ago da 25 mm calibro 27 specificamente progettato per EMG a fibra singola, dotato di una superficie di registrazione in materiale platino-iridio nel muscolo gastrocnemio destro. Assicurarsi che gli elettrodi SFEMG siano sterilizzati in autoclave prima di ogni utilizzo per mantenere la sterilità.</li>
	<li>Inserire l'elettrodo ad ago SFEMG in parallelo con le fibre muscolari del gastrocnemio per catturare i potenziali d'azione a fibra singola (SFAP).</li>
	<li>Evitare danni muscolari durante l'inserimento e la manovra dell'ago SFEMG all'interno del muscolo.</li>
</ol>3. Procedura di elettromiografia a fibra singola stimolata (SFEMG)
<ol><li>Applicare una stimolazione a corrente costante al nervo sciatico destro a una frequenza di 10 Hz utilizzando un intervallo di intensità di 0,3-10 mA e una durata dell'impulso di 0,1 ms.</li>
	<li>Configurare le impostazioni del filtro all'interno di un filtro a bassa frequenza di 1 kHz e di un filtro ad alta frequenza di 10 kHz. Regola il guadagno da 200 μV a 1000 μV per divisione per facilitare la visualizzazione dei potenziali. Impostare la velocità di scansione a 500 μs per divisione.</li>
	<li>Regola l'intensità dello stimolo per attivare e isolare gli SFAP per la registrazione e la successiva analisi.<ol><li>Per identificare e analizzare una risposta come SFAP, assicurarsi che siano soddisfatti i criteri specifici indicati di seguito: assicurarsi che il tempo di salita dal picco di base alla fase negativa sia inferiore a 500 μs, che l'ampiezza minima (da picco basale a negativo) sia di almeno 200 μV e che la risposta mostri costantemente un comportamento tutto o niente (dimensioni e forma stabili tra le risposte). NOTA: È essenziale che le risposte ricorrenti mostrino fasi ascendenti coerenti senza tacche o punti di flesso. Si noti che l'ultimo criterio è fondamentale per distinguere un segnale di qualità dalla somma di più segnali.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcolare il jitter, o variabilità della latenza SFAP (tempo tra la stimolazione e la fase di salita del picco negativo di SFAP) tra scariche consecutive, a seguito di almeno 50 stimolazioni (50-100 stimolazioni), e valutare e quantificare il blocco. NOTA: Il blocco può essere valutato come la presenza o l'assenza in ciascuna sinapsi o come la percentuale di stimolazioni che non riescono a innescare la generazione di potenziali d'azione di una singola fibra. Il jitter viene calcolato utilizzando la seguente equazione7 (il jitter viene in genere calcolato automaticamente dai sistemi di elettromiografia clinica): <img alt="Diagramma della formula di jitter MCD; Metodo per calcolare il jitter in microsecondi utilizzando intervalli tra impulsi." src="/files/ftp_upload/66452/66452eq01.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> MCD = Valore medio della differenza consecutiva IPI = Intervallo interpotenziale</li>
	<li>Ripetere la procedura per ulteriori risposte SFAP. In media, valutare 10 sinapsi di ciascun animale per calcolare il jitter e successivamente determinare i valori medi per animale.</li>
	<li>Escludere dalle analisi gli SFAP con jitter inferiore a 4 μs per evitare l'inclusione di potenziali che potrebbero essere stati evocati dalla stimolazione muscolare diretta11.</li>
	<li>Quando si registrano potenziali che mostrano un blocco intermittente, aumentare l'intensità dello stimolo per verificare che il fallimento della SFAP non sia attribuibile alla stimolazione submassimale.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>SFEMG nei roditori: valutazione della funzione NMJ in salute e malattia

<ol><li>Stalberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+velocity+in+human+muscle+fibers+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+Scand+Suppl%22%5BJournal%5D)">Propagation velocity in human muscle fibers in situ.</a> Acta Physiol Scand Suppl. 287, 1-112 (1966).</li>
<li>Stålberg, E., Trontelj, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+normal+and+abnormal+neuromuscular+transmission+with+single+fibre+electromyography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The study of normal and abnormal neuromuscular transmission with single fibre electromyography.</a> J Neurosci Methods. 74 (2), 145-154 (1997).</li>
<li>Sanders, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+single+fiber+EMG%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Guidelines for single fiber EMG.</a> Clin Neurophysiol. 130 (8), 1417-1439 (2019).</li>
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<li>Sanders, D. B., Kouyoumdjian, J. A., Stålberg, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fiber+electromyography+and+measuring+jitter+with+concentric+needle+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Single fiber electromyography and measuring jitter with concentric needle electrodes.</a> Muscle Nerve. 66 (2), 118-130 (2022).</li>
<li>Juel, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+fiber+electromyography%5BTitle%5D)+AND+%22Handb+Clin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Single fiber electromyography.</a> Handb Clin Neurol. 160, 303-310 (2019).</li>
<li>Chung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+dying-back+axonal+degeneration+in+age-associated+skeletal+muscle+decline%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Evidence for dying-back axonal degeneration in age-associated skeletal muscle decline.</a> Muscle Nerve. 55 (6), 894-901 (2017).</li>
<li>Iyer, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follistatin-induced+muscle+hypertrophy+in+aged+mice+improves+neuromuscular+junction+innervation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Follistatin-induced muscle hypertrophy in aged mice improves neuromuscular junction innervation and function.</a> Neurobiol Aging. 104, 32-41 (2021).</li>
<li>Meekins, G. D., Carter, G. T., Emery, M. J., Weiss, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+degeneration+in+the+trembler-j+mouse+demonstrated+by+stimulated+single-fiber+electromyography%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Axonal degeneration in the trembler-j mouse demonstrated by stimulated single-fiber electromyography.</a> Muscle Nerve. 36 (1), 81-86 (2007).</li>
<li>Gooch, C. L., Mosier, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+single+fiber+electromyography+in+the+mouse%3A+Techniques+and+normative+data%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Stimulated single fiber electromyography in the mouse: Techniques and normative data.</a> Muscle Nerve. 24 (7), 941-945 (2001).</li>
<li>Chung, T., Tian, Y., Walston, J., Hoke, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+single-fiber+jitter+level+is+associated+with+reduction+in+motor+function+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Increased single-fiber jitter level is associated with reduction in motor function with aging.</a> Am J Phys Med Rehabil. 97 (8), 551-556 (2018).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Elettrodo ad ago a fibra singola riutilizzabile da 27 g Elettrodo</td><td>di registrazione a fibra singola</td><td>Technomed</td><td>202860-000</td></tr><tr><td>Siringa in vetro da 2 ml</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO-2ML</td><td></td></tr><tr><td>Cavo staccabile</td><td>Technomed</td><td>202845-0000</td><td>per collegare l'elettrodo del registratore alla macchina elettrodiagnostica</td></tr><tr><td>Elettrodo a disco monouso da 2" x 2" con elettrocateteri</td><td>Cadwell</td><td>302290-000</td><td>elettrodo di terra</td></tr><tr><td>aghi monopolari monouso 28 G</td><td>Technomed</td><td>202270-000</td><td>elettrodi stimolanti il catodo e l'anodo</td></tr> cavo <tr><td>dell'ago EMG (scatola dell'interruttore Amp/stim)</td><td>Cadwell</td><td>190266-200</td><td>per collegare gli elettrodi monopolari allo stimolatore elettrodiagnostico</td></tr><tr><td>Helping Hands clip a coccodrillo con base in ferro</td><td>Radio Shack</td><td>64-079</td><td>Mantenimento del posizionamento degli elettrodi di registrazione&nbsp;</td></tr><tr><td>Isoflurano (flacone da 250 ml)</td><td>Piramal Healthcare</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>siringa per irrigazione a punta curva monoject</td><td>Covidien</td><td>81412012</td><td>utilizzato per l'applicazione del gel per elettrodi</td></tr><tr><td>Sistema di monitoraggio fisiologico PhysioSuite con riscaldamento omeotermico RightTemp</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>PS-RT</td><td>Include un cuscinetto riscaldante a infrarossi, una sonda rettale e una sonda di temperatura</td></tr><tr><td>del pad Pro trimmer Pet Kit per la toelettatura</td><td>Oster</td><td>078577-010-003</td><td>tosatrici per depilazione</td></tr><tr><td>Tubi endotracheali per ratti (16 G)</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocoronium Bromide</td><td>Sigma</td><td>PHR2397-500MG</td><td>agente bloccante neuromuscolare</td></tr><tr><td>Sierra Summit Sistema EMG</td><td>Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA</td><td>NA</td><td>sistema elettrodiagnostico portatile</td></tr><tr><td>SomnoSuite Low-Flow Sistema di anestesia digitale</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SOMNO</td><td>Include adattatore per tappo del flacone anti-fuoriuscita e anti-vapore; Tubo adattatore a Y; filtro per spazzino al carbone</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico veterinario a base di petrolio&nbsp;</td><td>Puralube</td><td>26870</td><td>applicato durante l'anestesia per evitare lesioni corneali</td></tr></tbody></table>

elettromiografia a fibra singola stimolata (sfemg) per la valutazione della trasmissione della giunzione neuromuscolare in modelli di roditori

Stimulated Single Fiber Electromyography (SFEMG) for Assessing Neuromuscular Junction Transmission in Rodent Models

Per dimostrare un aumento del jitter e del blocco nel contesto del fallimento della trasmissione NMJ, la SFEMG stimolata è stata eseguita con e senza somministrazione endovenosa di rocuronio. Il rocuronio è un agente bloccante neuromuscolare ad azione intermedia e non depolarizzante, ampiamente utilizzato in ambito clinico per indurre la paralisi muscolare durante interventi chirurgici o procedure mediche. Funziona legandosi in modo competitivo ai recettori nicotinici dell'acetilcolina all'NMJ19. Prima della somministrazione di rocuronio, il ratto adulto wild-type (Sprague Dawley) è stato preparato e anestetizzato come descritto nel paragrafo 1. A causa della paralisi indotta dal rocuronio, è stato utilizzato un supporto ventilatorio invasivo per ottenere dati rappresentativi (in contrasto con l'approccio tipico per l'anestesia durante le registrazioni SFEMG descritte sopra nella sezione 1). È stato posizionato un tubo endotracheale e la ventilazione è stata mantenuta a 60 respirazioni/min utilizzando una modalità a pressione controllata con una pressione di 17 mmHg e una pressione positiva di fine espirazione di 3 cm H2O mentre erogava isoflurano al 2%-3%. Una volta raggiunto il supporto ventilatorio e l'anestesia, sono stati registrati potenziali d'azione di singole fibre con e senza trattamento con rocuronio (bolo di 0,05 mg/kg di bromuro di rocuronio per via endovenosa). La Figura 1 mostra tre registrazioni rappresentative del potenziale d'azione a fibra singola dallo stesso NMJ in un ratto adulto. La Figura 1A mostra la morfologia tipica di un potenziale d'azione di una singola fibra (dopo una singola stimolazione) con un tempo di salita inferiore a 500 μs dalla linea di base al picco negativo e un'ampiezza minima (picco-picco) di almeno 200 μV. La Figura 1B mostra le caratteristiche di un aumento del jitter e del blocco intermittente dopo l'iniezione di rocuronio. La Figura 1C mostra la normalizzazione del jitter e del blocco dalla stessa sinapsi dopo la risoluzione del blocco NMJ. Per semplicità di visualizzazione, le Figure 1B, C mostrano solo le risposte dopo 9 stimolazioni consecutive. Inoltre, per una migliore comprensione, la Figura 2 mostra un ulteriore esempio di tre potenziali d'azione sovrapposti a singola fibra osservati dopo 10 stimolazioni consecutive, rivelando un aumento del jitter e del blocco.
Per quantificare l'impatto del rocuronio sulla trasmissione di NMJ utilizzando SFEMG stimolato, sono state effettuate registrazioni da 5 NMJ senza alcun trattamento e da 5 NMJ dopo la somministrazione di rocuronio e sono state analizzate per jitter e blocco (Figura 3). Dopo il rocuronio, il jitter (Figura 3A) e il blocco (Figura 3B) sono aumentati in modo significativo.
<img alt="Grafici del potenziale d'azione a fibra singola che mostrano l'andamento della latenza e dell'ampiezza; Risultati dell'analisi del jitter." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Tre registrazioni elettromiografiche rappresentative a fibra singola dalla stessa giunzione neuromuscolare (NMJ). (A) Esempio di potenziale d'azione di una singola fibra a seguito di una singola stimolazione nervosa che mostra i criteri per l'ampiezza (dal basale al picco negativo di almeno 200 μV) e il tempo di salita (dal basale al picco negativo inferiore a 500 μs) per l'accettazione come potenziale a fibra singola. (B) Esempio di potenziali d'azione sovrapposti a fibra singola dopo 9 stimolazioni consecutive che mostrano un aumento del jitter e del blocco che indicano una ridotta trasmissione NMJ dopo somministrazione di rocuronio (jitter: 68,35 μs). (C) Esempio di potenziali d'azione sovrapposti a fibra singola dopo 9 stimolazioni consecutive che mostrano jitter ridotto e nessun blocco, indicando la normalizzazione della trasmissione NMJ dopo la risoluzione del trattamento con rocuronio (jitter: 21,7 μs). Tracce rappresentative di SFEMG rivelano potenziali d'azione di singole fibre muscolari registrate da una sinapsi sana senza blocco e jitter normale in vista sovrapposta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafico dell'ampiezza del potenziale d'azione a fibra singola; latenza vs ampiezza; evento di stimolazione bloccato." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Tre potenziali d'azione a fibra singola sovrapposti (SFAP) registrati dopo stimolazioni consecutive durante la somministrazione di rocuronio. Tre potenziali d'azione a fibra singola sovrapposti (SFAP) sono stati registrati dopo 10 stimolazioni consecutive durante la somministrazione di rocuronio, indicando un aumento del jitter e del blocco. I valori di jitter per A, B e C erano rispettivamente di 24,3 μs, 46,9 μs e 88,7 μs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="grafici a barre NMJ jitter e blocco della trasmissione; ritardo medio, percentuale di stimolazione; dati di ricerca." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66452/66452fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Valutazione dell'elettromiografia a fibra singola della trasmissione della giunzione neuromuscolare (NMJ) dopo il trattamento con un agente bloccante NMJ non depolarizzante. (A) Durante la somministrazione di rocuronio (0,05 mg/kg), SFEMG ha mostrato una maggiore variabilità della trasmissione (jitter) rispetto alla condizione sana (non trattata: 12,9 μs, IC 95% [7,2-16,9 μs] rispetto a rocuronio: 40,70 μs, IC 95% [34,7-70,7 μs]) (test di Mann Whitney: p = 0,0079). (B) La percentuale di stimolazioni con blocco NMJ da ciascuna sinapsi su SFEMG è stata aumentata rispetto alla condizione sana (non trattata: 0%, IC 95% [0-0%] rispetto a rocuronio: 31%, IC 95% [14,0-59,0%]) (test di Mann Whitney: p = 0,0079). Tutte le misurazioni (jitter e percentuali di stimolazioni con blocco NMJ) sono state ottenute da un singolo ratto, n = 5 sinapsi non trattate e n = 5 sinapsi dopo il trattamento con rocuronio. I dati mostrati come mediana ±intervallo di confidenza al 95%. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66452/66452fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Elettromiografia a fibra singola stimolata (SFEMG) per la valutazione della trasmissione della giunzione neuromuscolare in modelli di roditori

As the final connection between the nervous system and muscle, transmission at the neuromuscular junction (NMJ) is crucial for normal motor function. ...

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Elettromiografia a fibra singola stimolata (SFEMG) per la valutazione della trasmissione della giunzione neuromuscolare in modelli di roditori (Video) | JoVE Journal

Elettromiografia a fibra singola stimolata (SFEMG) per la valutazione della trasmissione della giunzione neuromuscolare in modelli di roditori

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