Name: Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Scopri un protocollo modificato per isolare rapidamente ovociti in stadio I puri in zebrafish privi di cellule della granulosa. Questo metodo facilita analisi precise nella ricerca genomica ed epigenetica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Procedura migliorata per ottenere ovociti di zebrafish di stadio I privi di cellule della granulosa

<ol><li>Qin, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+mechanism+of+long-term+bisphenol+S+exposure+disrupted+ovarian+lipids+metabolism%2C+oocytes+maturation%2C+and+offspring+development+of+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Unraveling the mechanism of long-term bisphenol S exposure disrupted ovarian lipids metabolism, oocytes maturation, and offspring development of zebrafish.</a> Chemosphere. 277, 130304(2021).</li>
<li>Hau, H. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Larp6+controls+oocyte+development%2C+chorion+formation+and+elevation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maternal Larp6 controls oocyte development, chorion formation and elevation.</a> Development. 147 (4), 187385(2020).</li>
<li>Cabrera-Quio, L. E., Schleiffer, A., Mechtler, K., Pauli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+ski7+tunes+RNA+levels+during+the+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish ski7 tunes RNA levels during the oocyte-to-embryo transition.</a> PLoS Genet. 17 (2), e1009390(2021).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+reveals+insights+into+the+development+and+function+of+the+zebrafish+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome reveals insights into the development and function of the zebrafish ovary.</a> Elife. 11, 76014(2022).</li>
<li>Li, C. W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+expression+of+bone+morphogenetic+protein+family+ligands+and+receptors+in+the+zebrafish+ovary%3A+A+potential+paracrine-signaling+mechanism+for+oocyte-follicle+cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal expression of bone morphogenetic protein family ligands and receptors in the zebrafish ovary: A potential paracrine-signaling mechanism for oocyte-follicle cell communication.</a> Biol Reprod. 85 (5), 977-986 (2011).</li>
<li>Zampolla, T., Spikings, E., Rawson, D., Zhang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeleton+proteins+F-actin+and+tubulin+distribution+and+interaction+with+mitochondria+in+the+granulosa+cells+surrounding+stage+III+zebrafish+%28Danio+rerio%29+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Cytoskeleton proteins F-actin and tubulin distribution and interaction with mitochondria in the granulosa cells surrounding stage III zebrafish (Danio rerio) oocytes.</a> Theriogenology. 76 (6), 1110-1119 (2011).</li>
<li>Lubzens, E., Young, G., Bobe, J., Cerda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesis+in+teleosts%3A+How+eggs+are+formed%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Oogenesis in teleosts: How eggs are formed.</a> Gen Comp Endocrinol. 165 (3), 367-389 (2010).</li>
<li>Song, Y., Hu, W., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+transgenic+zebrafish+%28Danio+rerio%29+models+expressing+fluorescence+proteins+in+the+oocytes+and+somatic+supporting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gen+Comp+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Establishment of transgenic zebrafish (Danio rerio) models expressing fluorescence proteins in the oocytes and somatic supporting cells.</a> Gen Comp Endocrinol. 314, 113907(2021).</li>
<li>Sousa, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+hormones+affect+follicular+cells+and+ooplasm+of+stage+I+and+II+oocytes+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Fertil+Dev%22%5BJournal%5D)">Reproductive hormones affect follicular cells and ooplasm of stage I and II oocytes in zebrafish.</a> Reprod Fertil Dev. 28 (12), 1945-1952 (2016).</li>
<li>Yan, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadal+soma+controls+ovarian+follicle+proliferation+through+Gsdf+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Gonadal soma controls ovarian follicle proliferation through Gsdf in zebrafish.</a> Dev Dyn. 246 (11), 925-945 (2017).</li>
<li>Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+oocyte+development+in+the+zebrafish%2C+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J+Morphol%22%5BJournal%5D)">Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio.</a> J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).</li>
<li>Wallace, R. A., Selman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+aspects+of+oogenesis+and+oocyte+growth+in+fish+and+amphibians%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc+Tech%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural aspects of oogenesis and oocyte growth in fish and amphibians.</a> J Electron Microsc Tech. 16 (3), 175-201 (1990).</li>
<li>Elkouby, Y. M., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+analysis+of+early+oogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Methods for the analysis of early oogenesis in zebrafish.</a> Dev Biol. 430 (2), 310-324 (2017).</li>
<li>Ai, N., Liu, L., Lau, E. S., Tse, A. C., Ge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+oocyte+and+follicle+layer+for+gene+expression+analysis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of oocyte and follicle layer for gene expression analysis in zebrafish.</a> Methods Mol Biol. 2218, 1-9 (2021).</li>
<li>Zhan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explorations+of+the+optimal+method+for+isolating+oocytes+from+zebrafish+%28Danio+rerio%29+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+B+Mol+Dev+Evol%22%5BJournal%5D)">Explorations of the optimal method for isolating oocytes from zebrafish (Danio rerio) ovary.</a> J Exp Zool B Mol Dev Evol. 330 (8), 417-426 (2018).</li>
<li>Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. Avma. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals">https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals</a> (2020).</li>
<li>Phs policy on humane care and use of laboratory animals. Olaw. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction">https://olaw.nih.gov/policies-laws/phs-policy.htm#Introduction</a> (2015).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Soluzione di dissociazione cellulare di Kinger</td><td>PlantChemMed</td><td>PC-33689</td> La <td>soluzione di dissociazione cellulare di Kinger può essere conservata stabilmente a -20 &deg; C dopo l'imballaggio e può essere utilizzato dopo lo scongelamento a bassa temperatura (4 &deg; C). Può essere utilizzato direttamente per dissociare le ovaie del pesce zebra. La temperatura ottimale è di 28,5 gradi C, per circa 2-3 ore. La durata può essere regolata in base alle specifiche condizioni di dissociazione, accorciata o estesa (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).</td></tr><tr><td>Filtri cellulari (100 &mu; m )</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Dumont</td><td>#5</td><td></td></tr><tr><td>Ago capillare in vetro</td><td>/</td><td>/</td><td>Smussato bruciando con accendino</td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Yesen</td><td>40732ES03</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette a basso adsorbimento (10 &mu; l )</td><td>Labsellect</td><td>T-0010-LR-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz' s L-15 medio medio (con L-glutammina)</td><td>Hyclone</td><td>SH30525.01</td><td></td></tr><tr><td>Secchiello per il ghiaccio</td><td>/</td><td>/</td><td>L'acqua ghiacciata viene utilizzata per l'eutanasia del pesce zebra</td></tr><tr><td>Incubatrice</td><td>WIGGENS</td><td>WH-01</td><td></td></tr><tr><td>Pesce giovane</td><td>/</td><td>/</td><td>5&ndash; 6 settimane dopo la fecondazione, lunghezza standard [SL] di 10&ndash; Piatto di plastica da 15 mm</td></tr><tr><td>(35 mm)</td><td>Stereomicroscopio SORFA</td><td>230101</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Motic</td><td>SMZ-161</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture tissutali (6 pozzetti)</td><td>Forbici a molla SORFA</td><td>0110006</td><td></td></tr><tr><td>Vannas</td><td>Fine Science Toosl</td><td>#15000-00</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento rapido di ovociti in stadio i in zebrafish privi di cellule della granulosa

Rapid Isolation of Stage I Oocytes in Zebrafish Devoid of Granulosa Cells

La Figura 1 illustra la morfologia ovarica osservata sia nel pesce zebra adulto che in quello giovane, mostrando gli ovociti in diversi stadi di sviluppo come riferimento. La Figura 1A fornisce una rappresentazione grafica della morfologia e delle dimensioni degli ovociti in ogni fase dello sviluppo, a partire dalla fase di crescita primaria (stadio I) e terminando con l'ovulo ovulato (stadio V). Le figure 1Ai-v illustrano i diametri corrispondenti agli stadi da I a V degli ovociti. La Figura 1B (pannello di sinistra) mostra le immagini ovariche nei pesci giovani (6 wpf con SL = 1,5 cm). In particolare, l'ovaio giovanile mostra un aspetto lobulare distinto, caratterizzato principalmente da un'abbondanza di ovociti trasparenti allo stadio I, accompagnati da una popolazione più piccola di ovociti allo stadio II. Questa prevalenza di ovociti allo stadio I facilita notevolmente la loro osservazione e il loro recupero. Il pannello di destra raffigura la morfologia dell'ovaio del pesce adulto (6 mesi), dove si possono osservare ovociti in vari stadi di sviluppo. Tuttavia, gli ovociti opachi in fase avanzata (stadio II-III) sono predominanti nell'ovaio.
La Figura 2 illustra i processi rappresentativi dalla dissezione all'ottenimento di ovociti puliti allo stadio I. La Figura 3 presenta gli ovociti di stadio I ottenuti utilizzando sia il metodo di riferimento che il metodo modificato. Dopo la colorazione di Hoechst, i nuclei delle cellule dell'ovocita e della granulosa hanno mostrato una fluorescenza blu alla luce UV. Nelle immagini ottenute con il metodo di riferimento (Figura 3A), la superficie degli ovociti era densamente circondata da numerosi nuclei cellulari di granulosa colorati. Al contrario, gli ovociti allo stadio I separati con il metodo modificato (Figura 3B) mostrano una completa esposizione e pulizia, senza la presenza di colorazioni dei nuclei delle cellule della granulosa.
I nostri risultati hanno dimostrato l'efficacia del metodo proposto per isolare gli ovociti allo stadio I. Il processo di sviluppo degli ovociti nei pesci teleostei mostra diverse caratteristiche comuni7. Per valutarne l'applicabilità interspecie, sono state condotte ulteriori analisi su altre specie ittiche. Le femmine di cobitidi sono state acquistate da un mercato locale e gli ovociti allo stadio iniziale (diametro &lt;100 μm) sono stati isolati seguendo la stessa procedura. La composizione ovarica del cobite di stagno mostrava anche una miscela di ovociti in più stadi di sviluppo, caratterizzata da una sorprendente somiglianza nella morfologia e nelle dimensioni degli ovociti con quella del pesce zebra durante lo stesso stadio. Come illustrato nella Figura 4A, le ovaie delle femmine adulte di cobite di stagno erano dominate da ovociti tardivi opachi intervallati da ovociti precoci trasparenti. È stato osservato un chiaro monostrato di cellule della granulosa sulla superficie degli ovociti. Coerentemente con le nostre osservazioni nel pesce zebra, gli ovociti del cobite che misuravano meno di 100 μm di diametro corrispondevano allo stadio precedente allo stadio di diplotene. La Figura 4B mostra gli ovociti puliti di cobite di stagno (Misgurnus anguillicaudatus) ottenuti con il metodo modificato. Rispetto alle ovaie del pesce zebra, le ovaie del cobitide sono più difficili da dissociare. Dopo 6-7 ore di digestione, si dissociano altri ovociti in fase iniziale. Tuttavia, questo approccio aggiustato ha prodotto gli ovociti puliti e nudi desiderati. I pesci zebra appartengono alla famiglia dei Cyprinidae, mentre i cobitidi di stagno sono classificati all'interno della famiglia dei Cobitidae. Queste due famiglie mostrano una lontana relazione tassonomica, ma il loro stadio di sviluppo ovarico e la loro morfologia sono notevolmente simili, indicando che questo metodo può essere generalmente utilizzato per analizzare gli ovociti di varie specie ittiche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig01v2.jpg"> Figura 1: Immagini rappresentative di ovaie e ovociti di zebrafish in diversi stadi. (A) Morfologia e dimensione degli ovociti in ogni stadio di sviluppo (St). i-v rappresenta le immagini e il diametro degli ovociti dallo stadio I al V. Barra della scala = 200 μm. (B) Morfologia ovarica di zebrafish adulti e giovani. Barre di scala = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig01largev2.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig02v2.jpg"> Figura 2: Immagini rappresentative della procedura di isolamento, dalla dissezione all'acquisizione di ovociti puliti allo stadio I. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig02largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig03.jpg"> Figura 3: Ovociti dello stadio I ottenuti con i due metodi. (A) Ovociti dello stadio (St) I isolati con il metodo di riferimento. (B) Ovociti di stadio I isolati con il metodo modificato. I nuclei delle cellule dell'ovocita e della granulosa sono stati colorati con Hoechst ed eccitati con luce UV. Barre di scala = 100 μm. BF = campo chiaro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66458/66458fig04.jpg"> Figura 4: Ovociti in fase iniziale di cobite di stagno ottenuti con il metodo modificato. (A) Immagini rappresentative dell'ovaio e degli ovociti di cobite di stagno. I, II rappresentano le ovaie dei cobitidi di stagno sotto diversi ingrandimenti e III-IV rappresentano gli ovociti allo stadio iniziale dei cobiti. Barre di scala: i (500 μm); II (200 μm); III, IV (100 μm). (B) Ovociti in fase iniziale isolati da cobite di stagno. Gli ovociti e i nuclei delle cellule della granulosa sono stati colorati con Hoechst ed eccitati con luce UV. Barre di scala = 100 μm. BF = campo chiaro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66458/66458fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Isolamento rapido di ovociti in stadio I in zebrafish privi di cellule della granulosa

The study of oocyte development holds significant implications in developmental biology. The zebrafish (Danio rerio) has been extensively used as a model ...

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Developmental Biology

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