Name: Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 38 s
Description: Impara la somministrazione intratecale di vettori AAV9 nella cisterna lombare di ratti giovani per studi di terapia genica. Questo protocollo chirurgico consente di valutare l'efficacia dei trattamenti nel sistema nervoso centrale.

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Gli autori desiderano ringraziare Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi e Lacey Stearman dell'UT Southwestern per una discussione produttiva sulla sfida posta dai ratti giovani per l'iniezione intratecale. Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti di Jaguar Gene Therapy (a JLFK).

Questo studio è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Emory University (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley (28-30 giorni di età, massa nell'intervallo di circa 90-135 g, maschi e femmine).
1. Preparazione del vettore
<ol><li>Scongelare il vettore AAV9 (vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio all'inizio della procedura.</li>
	<li>Centrifugare brevemente la provetta per microcentrifuga contenente il vettore in una centrifuga da tavolo per assicurarsi che tutto il liquido si trovi sul fondo della provetta.</li>
	<li>Agitare delicatamente la provetta per microcentrifuga per assicurarsi che la soluzione sia ben miscelata.</li>
</ol>2. Preparazione della gabbia di recupero
<ol><li>Posizionare una gabbia pulita su una coperta elettrica (vedi Tabella dei materiali) in modo che solo metà della gabbia sia a contatto con la coperta.</li>
	<li>Impostare la temperatura della coperta a ~37 °C.</li>
</ol>3. Preparazione della piattaforma chirurgica
<ol><li>Scaldare un tampone isotermico (vedi Tabella dei materiali) a 39 °C in un forno a microonde o a bagnomaria in modo che il contenuto diventi liquido.</li>
	<li>Posizionare il tampone isotermico sulla piattaforma chirurgica e coprirlo con un tampone assorbente pulito.</li>
</ol>4. Preparazione degli animali
<ol><li>Anestetizzare i ratti con isoflurano in una scatola trasparente (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente). Iniziare l'induzione dell'anestesia utilizzando isoflurano al 5% e diminuire dell'1% al minuto fino a raggiungere il 2%. Tenere l'animale al 2% per altri 3 minuti.</li>
	<li>Sposta la scatola che tiene l'animale su una cappa aspirante e apri la scatola. NOTA: Questo limita l'esposizione del chirurgo all'anestetico.</li>
	<li>Rimuovere i peli dalla parte posteriore dell'animale utilizzando un tagliacapelli elettrico. NOTA: In alternativa è possibile utilizzare una crema depilatoria o un rasoio manuale e una crema da barba.</li>
	<li>Posizionare l'animale sulla piattaforma chirurgica con il muso nel cono del naso per anestesia. NOTA: L'animale può iniziare a riprendere conoscenza mentre il pelo viene rimosso dal sito chirurgico. Se ciò accade, anestetizzarlo nuovamente come descritto sopra.</li>
	<li>Applicare un unguento lubrificante su ciascun occhio per prevenire l'essiccazione delle cornee durante la procedura.</li>
	<li>Disinfettare l'area chirurgica utilizzando tre applicazioni alternate di salviette iodio povidone e isopropanolo.</li>
	<li>Iniettare l'analgesico per via sottocutanea. NOTA: La buprenorfina viene generalmente utilizzata alla dose di 0,01-0,05 mg/kg, somministrata ogni 12 ore. In alternativa, una forma a lento rilascio di questo farmaco può essere somministrata una volta a 1 mg/kg per fornire un adeguato controllo del dolore per 72 ore. Consultare l'IACUC dell'istituto per le loro linee guida in merito alla gestione del dolore.</li>
	<li>Iniettare 100 μl di lidocaina all'1% per via sottocutanea sopra i processi spinosi da L2 a L6 per fornire l'anestesia locale.</li>
	<li>Posizionare un rotolo di carta assorbente o un tubo di 1,5 cm di diametro sotto l'animale, appena rostrale ai fianchi. Questo aiuta a flettere la colonna vertebrale, facilitando l'inserimento dell'ago tra le due lamine.</li>
	<li>Posizionare un telo fenestrato (vedi Tabella dei materiali) sull'animale, centrando la fenestrazione sulla colonna lombare.</li>
</ol>5. Esposizione della colonna lombare
<ol><li>Conferma la profondità dell'anestesia pizzicando ciascuna delle zampe dell'animale e cercando l'assenza di una risposta di astinenza.</li>
	<li>Utilizzando una lama di bisturi #11, creare un'incisione di circa 3 cm di lunghezza nella pelle lungo la linea mediana da L2 a L6.</li>
	<li>Allenta la pelle dal muscolo inserendo un paio di forbici chirurgiche curve sterili tra il muscolo e la pelle e poi aprendo le punte.</li>
	<li>Rimuovere la fascia che copre i processi spinosi L2-L5.</li>
</ol>6. Caricamento della siringa
<ol><li>Pipettare 25-35 μL del vettore (per ottenere la dose desiderata) nel tappo di una provetta sterile per microcentrifuga.</li>
	<li>Aspirare l'intero volume nella siringa da insulina. NOTA: Fare attenzione a non aspirare aria durante questo processo.</li>
</ol>7. Esecuzione dell'iniezione
<ol><li>Identificare i processi spinosi L5 e L4. NOTA: L6 si trova direttamente tra le due creste iliache e il suo processo spinoso dovrebbe essere facile da identificare sondando con uno strumento smussato. Lo strumento può quindi essere fatto scorrere delicatamente sulla schiena per trovare i confini dei processi L5 e L4.</li>
	<li>Metti una mano in modo che il pollice poggi delicatamente sulla coda e su una gamba dell'animale. Utilizzare un dito per tenere ferma la siringa.</li>
	<li>Posizionare l'ago della siringa in modo che si trovi a sinistra del processo spinoso L5 e allineato con la sua estremità caudale. Posizionare la siringa in modo che si trovi a circa 30° dalla linea mediana e a 30° dal piano del tavolo. NOTA: Può essere utile utilizzare un microscopio operatorio per identificare meglio i punti di riferimento e posizionare la punta dell'ago.</li>
	<li>Far avanzare l'ago della siringa in avanti di circa 8 mm, sopra la parte superiore della lamina L5 e poi sotto la lamina L4 nella cassetta lombare fino a quando l'osso non viene colpito. Il posizionamento corretto provocherà una contrazione della gamba e/o della coda che può essere vista o sentita dal pollice appoggiato sulla gamba/coda. Se non ci sono contrazioni, rimuovere l'ago e tentare la procedura dal lato sinistro. Se non ci sono ancora contrazioni, ripetere la procedura tra L4/L3 e L3/L2 se necessario.</li>
	<li>Premere lentamente lo stantuffo per circa 5 s. NOTA: Durante l'iniezione potrebbe verificarsi una contrazione della gamba o della coda.</li>
	<li>Tenere la siringa in posizione per circa 30 secondi dopo aver premuto completamente lo stantuffo per consentire alla pressione di equilibrarsi e ridurre al minimo il reflusso dell'iniettato quando l'ago viene estratto.</li>
	<li>Rimuovere lentamente l'ago.</li>
</ol>8. Chiusura dell'incisione
<ol><li>Approssimare i bordi dell'incisione.</li>
	<li>Iniziando da un'estremità della ferita, utilizzare una sutura 4-0 (vedi Tabella dei materiali) o graffette chirurgiche per chiudere l'incisione.</li>
</ol>9. Recupero e monitoraggio
<ol><li>Metti l'animale nella gabbia preriscaldata.</li>
	<li>Controllare l'animale almeno ogni 15 minuti fino a quando non è completamente deambulante. NOTA: Questo dovrebbe richiedere tra 15 minuti e 45 minuti.</li>
	<li>Per i prossimi tre giorni, eseguire controlli di benessere almeno una volta al giorno. Fornire analgesici per i primi 2 giorni dopo l'intervento chirurgico o come richiesto dall'IACUC.</li>
	<li>Una settimana dopo l'intervento, rimuovere i punti di sutura o le graffette.</li>
</ol>10. Procedura di follow-up
NOTA: Per determinare l'accuratezza della tecnica di iniezione, iniettare il colorante blu di tripano come descritto sopra e quindi sopprimere immediatamente l'animale (seguendo i protocolli approvati istituzionalmente) ed eseguire una laminectomia per visualizzare il risultato.
<ol><li>Mentre l'animale rimane sotto anestesia, sopprimerlo somministrando una dose letale di pentobarbital tramite iniezione intraperitoneale alla dose di 150 mg/kg.</li>
	<li>Una volta cessata la respirazione e l'attività cardiaca, aprire la cavità toracica per garantire la morte. Estendere l'incisione chirurgica lungo la schiena fino al collo.</li>
	<li>Praticare un'incisione lunga 4 cm nel muscolo parallelo alla colonna vertebrale su entrambi i lati dei processi spinosi, mantenendosi il più vicino possibile ai processi.</li>
	<li>Usando una pinza fine o le forbici, rimuovi il muscolo tra i processi spinosi.</li>
	<li>Rimuovere i processi spinosi da L6 fino alla colonna vertebrale toracica inferiore utilizzando un rongeur (vedi Tabella dei materiali). Evitare movimenti di torsione, in quanto ciò potrebbe danneggiare i rongeur.</li>
	<li>Inserire la punta inferiore del rongeur sotto la lamina L5 e rimuovere l'osso sovrastante il midollo spinale prelevando diversi "morsi" da esso. NOTA: Tirare indietro il processo spinoso L6 può facilitare l'inserimento della punta del rongeur. È necessario prestare attenzione per evitare danni al midollo spinale.</li>
	<li>Continuare ad espandere la laminectomia almeno quattro lamine rostralmente. Ispezionare la superficie interna delle lamine per segni di colorante, che possono indicare un'iniezione fallita.</li>
</ol>

Somministrazione di AAV9 con puntura lombare in ratti giovani per la terapia genica del SNC

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</ol>

Il Dr. Donsante è un inventore di un brevetto in attesa di brevetto riguardante la somministrazione di vettori AAV9 nel liquido cerebrospinale.

Un'ampia varietà di malattie colpisce il SNC. Fornire una copia funzionale del gene pertinente tramite un vettore virale è una strategia di trattamento interessante per coloro che sono di natura recessiva e monogenica, come l'atrofia muscolare spinale. Tuttavia, la barriera emato-encefalica (BEE) esclude la maggior parte dei vettori di terapia genica somministrati per via endovenosa11. Quelli che possono attraversare la BEE, come l'AAV9, devono essere somministrati in dosi elevate per superare la perdita di vettore dovuta alla trasduzione periferica12. Anche l'età è una barriera. L'esposizione ambientale ai vari sierotipi di AAV aumenta con i13 anni e spesso porta alla produzione di anticorpi in grado di neutralizzare i vettori terapeutici14. Pertanto, la somministrazione endovenosa di vettori di terapia genica per i disturbi del SNC è generalmente limitata ai neonati e non viene utilizzata nei pazienti diagnosticati più tardi nella vita. 
Per i pazienti più anziani, l'iniezione diretta di vettori nel liquido cerebrospinale può produrre un'ampia trasduzione nel SNC, bypassando sia la BBB che gli anticorpi anti-AAV preesistenti15. Poiché questo approccio è mirato, possono essere utilizzate anche dosi di vettore più basse. Esistono due approcci principali in ambito clinico: (1) puntura lombare e (2) iniezione nei ventricoli laterali. Quest'ultimo comporta un rischio maggiore, ma generalmente fornisce una maggiore trasduzione cerebrale. La puntura lombare è più sicura, ma la trasduzione è inclinata verso il midollo spinale. La trasduzione cerebrale potrebbe essere migliorata posizionando il paziente nella posizione di Trendelenburg, ma i dati su questo sono contrastanti 16,17. L'uso di un catetere per raggiungere la cisterna magna tramite una puntura lombare può fornire un'opzione migliore in clinica, ma è in una fase iniziale di utilizzo5. Potrebbero esserci altre sfide per tradurre in clinica gli approcci elaborati in modelli animali, come la perdita di vettore dovuta alla perdita di liquido cerebrospinale18 e la tossicità nei gangli della radice dorsale19.
La maggior parte degli studi sulle terapie dirette al SNC eseguite nei roditori utilizzano neonati o animali adulti (>60 giorni di età). I neonati hanno il vantaggio di avere dimensioni corporee ridotte, che consentono dosi efficaci più elevate, e di un sistema immunitario immaturo, evitando le complicazioni di una risposta immunitaria contro la terapia. Tuttavia, in termini di sviluppo cerebrale, un topo o un ratto appena nato rappresenta meglio uno stadio fetale negli esseri umani. Per le terapie destinate ai bambini nella fascia di età 5-10 anni, il ratto giovane (25-35 giorni di età) è un modello migliore in termini di sviluppo neurologico20. Poiché un metodo per l'iniezione intratecale non era stato precedentemente descritto per i ratti giovani e i metodi stabiliti per topi e ratti adulti si sono dimostrati inefficaci nei ratti di questa età, è stato sviluppato l'approccio sopra descritto. Per essere chiari, i ratti giovani non sono solo più piccoli degli adulti, ma possono anche differire nell'elasticità della dura madre che protegge il midollo spinale, rendendo inefficace in un giovane una procedura che funziona per perforare questo strato in un ratto adulto.
Quando si impara come eseguire l'iniezione intratecale nei ratti giovani, è necessario utilizzare un colorante (come il blu di tripano) come surrogato della terapia e l'utente deve essere molto fiducioso nella propria capacità di eseguire con successo e in modo riproducibile la procedura prima di iniziare uno studio con una terapia. Diventare esperti nella tecnica richiederà pratica per acquisire esperienza con la sensazione della siringa quando la traiettoria è in linea con il bersaglio. Esistono due errori comuni. Se l'angolo di approccio è troppo basso, l'ago colpirà la parte superiore di una delle lamine o la parte posteriore della lamina rostrale. Non ci saranno contrazioni e la distanza di avanzamento dell'ago sarà di pochi millimetri inferiore a 8 mm. Se l'angolo di approccio è troppo grande, c'è il rischio che l'ago passi tra le due lamine e penetri nella cavità addominale. Quando ciò accade, l'ago avanzerà molto più di 8 mm. In tal caso, rimuovere l'ago, riposizionarlo e riprovare. Nelle poche occasioni in cui ciò è accaduto, l'ingresso transitorio nella cavità addominale di pochi millimetri prima del ritiro e del riposizionamento non ha causato alcun danno apparente duraturo agli animali. 
È stato riscontrato che osservare una risposta fisica al posizionamento dell'ago è fondamentale per ottenere la riproducibilità con un alto tasso di successo con questa procedura. Quando non c'è stata risposta, il tasso di successo dell'iniezione è stato basso. Tuttavia, in alcuni casi, un animale ha richiesto tentativi in più siti per ottenere una risposta e tracce di colorante sono state osservate in una o più delle tracce dell'ago precedenti. Non è stato osservato alcun colorante nello spazio epidurale, suggerendo che alcune delle precedenti punture dell'ago erano penetrate nella dura madre senza produrre una contrazione della coda o della gamba. Poiché il reflusso era minimo (simile a quello che si osserva nella traccia dell'ago dall'iniezione), si ritiene che l'effetto delle precedenti punture dell'ago sull'efficacia della somministrazione in questi casi fosse trascurabile. 
Una volta raggiunta la competenza nella tecnica di consegna, si può incontrare una seconda sfida non chirurgica. In particolare, nei ratti adulti (~70 giorni di età), la potenza dei vettori AAV9 per la consegna intratecale al midollo spinale e al cervello può variare sostanzialmente da lotto a lotto, anche quando sono generati dallo stesso nucleo vettore. Alcuni lotti si comporteranno come previsto, producendo trasduzione nella materia grigia del midollo spinale lungo la sua lunghezza. Altri, tuttavia, non riusciranno a penetrare la materia grigia, trasducendo principalmente i gangli delle radici dorsali10. La causa di questa variabilità non è chiara, poiché i vettori sono potenti in vitro e quando iniettati direttamente nel midollo spinale. Si raccomanda di eseguire uno studio pilota su 3-4 animali con qualsiasi nuovo lotto di virus per confermare che il nuovo lotto si comporti come previsto prima di iniziare uno studio di grandi dimensioni. La potenza può essere valutata utilizzando la colorazione immunoistochimica o immunofluorescenza del prodotto transgenico proteico o quantificando la quantità di mRNA transgenico o genomi vettoriali utilizzando la PCR quantitativa o la ddPCR21. Oltre alle variabili sconosciute che distinguono i lotti virali, piccole differenze nell'età degli animali, nel volume di iniezione, nella velocità di somministrazione e nella concentrazione del vettore possono causare variabilità nei risultati. Prima di iniziare uno studio di grandi dimensioni, potrebbe essere necessario ottimizzarli per ogni virus o altro agente terapeutico candidato.
Una volta formato, un chirurgo esperto può completare la procedura di iniezione intratecale di un ratto giovane entro circa 30 minuti, dall'induzione dell'anestesia all'inizio del periodo di recupero. Ciò consente di trattare grandi coorti in un breve lasso di tempo. Anche il recupero dall'intervento chirurgico è rapido. La maggior parte degli animali deambula normalmente entro 20-30 minuti. Dopo aver eseguito più di 200 di questi interventi chirurgici, non sono stati riscontrati effetti avversi da questa procedura. 
Infine, ridurre al minimo il disagio degli animali e garantire il benessere degli animali durante le procedure chirurgiche sono considerazioni fondamentali. Pertanto, è richiesto l'uso corretto di anestetici e analgesici e la temperatura corporea deve essere mantenuta durante la procedura e fino a quando l'animale non si riprende completamente dall'anestesia. Gli organismi di regolamentazione competenti e il personale veterinario delle diverse istituzioni possono avere requisiti e raccomandazioni diversi in merito a questi argomenti. L'uso di anestetici e analgesici descritti in questa procedura è stato sviluppato in consultazione con i veterinari della Emory University e il personale IACUC. I ricercatori dovrebbero lavorare a stretto contatto con i loro veterinari locali e l'IACUC per raggiungere gli obiettivi necessari.
Questa procedura presenta alcune limitazioni. Il metodo qui descritto è stato sviluppato per l'uso nei ratti giovani e una miriade di differenze strutturali e di altro tipo tra esseri umani e ratti possono limitare la traduzione di queste procedure all'uomo. Lo scopo di consentire l'iniezione intratecale lombare di un terapeutico nei ratti giovani è quello di facilitare l'uso del modello di ratto giovane per testare l'efficacia del trattamento terapeutico candidato, anche se la modalità precisa di somministrazione dovrebbe essere modificata per l'applicazione nei pazienti.

La promessa delle terapie geniche mediate da virus è stata finalmente realizzata negli ultimi anni con l'approvazione da parte della FDA di trattamenti per l'atrofia muscolare spinale, la distrofia retinica, l'emofilia del fattore IX, il cancro e altro ancora. Innumerevoli altre terapie sono attualmente in fase di sviluppo. La terapia genica mira a fornire un gene terapeutico alle cellule di un paziente. I prodotti di questo nuovo gene possono sostituire l'attività mancante di un gene endogeno carente, inibire un gene tossico, uccidere le cellule cancerose o fornire qualche altra funzione benefica.
Per le malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale (SNC), è spesso auspicabile somministrare il vettore della terapia genica direttamente al tessuto bersaglio. Gli approcci non sistemici offrono due vantaggi: riducono al minimo gli effetti collaterali fuori bersaglio che possono essere causati dalla trasduzione periferica e riducono notevolmente la quantità di vettore necessaria per raggiungere livelli adeguati di trasduzione nel tessuto bersaglio5.
Esistono diversi approcci per fornire vettori di terapia genica al SNC. L'iniezione intraparenchimale, l'iniezione di un vettore direttamente nel midollo spinale o nel tessuto cerebrale, può essere utilizzata per la consegna in una regione definita. Tuttavia, per molte malattie, è auspicabile un'ampia trasduzione del SNC. Ciò può essere ottenuto fornendo un vettore al liquido cerebrospinale (CSF)5, il fluido che scorre dentro e intorno al cervello e al midollo spinale. Esistono tre modi principali per fornire vettori al CSF. L'approccio più invasivo è la somministrazione intracerebroventricolare, che prevede la perforazione di un foro attraverso il cranio e l'avanzamento di un ago attraverso il cervello nei ventricoli laterali. Questo produce la trasduzione in tutto il cervello. Tuttavia, la procedura può causare emorragia intracranica e l'approccio generalmente produce solo una trasduzione limitata del midollo spinale6. L'iniezione nella cisterna magna alla base del cranio è meno invasiva, ma comporta il rischio di danni al tronco encefalico. Sebbene sia spesso utilizzata nella ricerca sugli animali5, l'iniezione nella cisterna magna non viene più utilizzata di routine in clinica7. La puntura lombare è l'approccio meno invasivo per accedere al liquido cerebrospinale. Ciò comporta il posizionamento di un ago tra due vertebre lombari e nella cassetta lombare.
La puntura lombare per la somministrazione del vettore viene eseguita di routine nei ratti e nei topi adulti e nei topi neonatali 8,9. Gli autori di questo studio hanno recentemente eseguito punture lombari in ratti giovani (28-30 giorni di età) per fornire vettori del sierotipo 9 del virus adeno-associato (AAV9). Nei ratti adulti, un ago per puntura lombare neonatale è stato posizionato verticalmente tra le vertebre L3 e L49. Il corretto posizionamento provoca un movimento della coda e un liquido cerebrospinale che scorre nel serbatoio dell'ago. Nei ratti giovani, tuttavia, non è stato possibile ottenere nessuna di queste letture. Gli autori hanno quindi tentato di adattare una procedura su un topo adulto utilizzando una siringa da insulina da 27 G inserita con un angolo compreso tra L5 e L610. Nei topi adulti, che sono in genere più piccoli dei ratti P28, questo non produce un movimento della coda, ma il posizionamento errato dell'ago è evidente dal riflusso dell'iniettato. Nei ratti giovani, tuttavia, questo approccio ha portato uniformemente alla somministrazione dell'iniettato per via epidurale, probabilmente a causa della diversa elasticità tra i topi adulti e i ratti giovani degli strati di tessuto che circondano il midollo spinale. Successivamente sono stati valutati gli approcci al catetere. Nello specifico, un catetere è stato introdotto attraverso un'incisione nella dura della cisterna lombare e fino al midollo spinale medio-toracico; Tuttavia, questo approccio ha portato a un sostanziale reflusso dell'iniettato fuori dal sito di incisione durante il parto. Anche i tentativi di posizionare il catetere nello spazio intratecale per via percutanea utilizzando un ago guida non hanno avuto successo. A causa della ristrettezza della larghezza interlaminare, il catetere probabilmente colpirebbe la lamina rostrale e non riuscirebbe ad avanzare.
Qui, viene descritto un metodo per ottenere una somministrazione di soluzione efficace e riproducibile tramite una puntura lombare nel ratto giovane. Questo approccio può essere utilizzato per vettori virali e probabilmente anche per cellule, prodotti farmaceutici e altre terapie.

<table><tbody><tr><td>200 &micro; Puntali per pipette filtrati</td><td>L MidSci</td><td>PR-200RK-FL</td><td>Virus di pipettaggio</td></tr><tr><td>AAV9-GFP</td><td>Costruttore di vettori</td><td>P200624-1005ynr</td><td>AAV9 che esprime il vettore GFP</td></tr><tr><td>Sutura assorbibile con ago rivestito in Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Misura 4 - 0</td><td>McKesson</td><td>J422H</td><td>Intrecciato Sutura</td></tr><tr><td>Cuscinetto da banco</td><td>VWR</td><td>56616-031</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Cuscinetti isotermici Braintree Scientific, 8'' x 8''</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-195-4664</td><td>Mantiene la temperatura corporea</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>McKesson</td><td>1013922</td><td>Analgesico</td></tr><tr><td>Buprenorfina-ER (1 mg/mL)</td><td>Zoopharma</td><td></td><td>Analgesico a rilascio prolungato</td></tr><tr><td>Tamponi di cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-365-409</td><td>Rimozione</td></tr> <tr><td>del sangueTelo, topo, plastica trasparente, 12" x 12", con fenestrazione adesiva</td><td>Steris</td><td>1212CPSTF</td><td>Telo chirurgico</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinza Coperta elettrica</td><td>CVS Health</td><td></td><td>CVS Health Series 500 Termoforo extra lungo</td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus, pipetta a 1 canale, variabile, 20&ndash; 200 &micro; L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000055</td><td>Pipettaggio del virus</td></tr><tr><td>Forbici fini</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>14059-11</td><td>Forbici chirurgiche curve</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeurs Strumenti per</td><td>la scienza fine</td><td>16121-14</td><td>Portaaghi per laminectomia</td></tr><tr><td>Halsey</td><td>Strumenti per scienze fini</td><td>12001-13</td><td>Cacciatore per aghi</td></tr><tr><td>Siringhe per insulina con ago ultrasottile 12,7 mm x 30 G 3/10 mL/cc</td><td>Siringa BD</td><td>328431</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>McKesson</td><td>803250</td><td>Anestetico</td></tr><tr><td>Salviette isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-031-350</td><td>Disinfezione della pelle</td></tr><tr><td>Lidocaina, 1%</td><td>McKesson</td><td>239935</td><td>Anestesia locale</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga: 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-137</td><td>Caricamento della siringa</td></tr><tr><td>Povidone-iodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-118-0481</td> Manico per bisturi <td>per disinfezione della pelle</td></tr><tr><td>- #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>10004-13</td><td>Porta lama per bisturi</td></tr><tr><td>Camera di induzione Sure-Seal Braintree</td><td>Scientific</td><td>EZ-17</td><td>Scatola per anestesia</td></tr><tr><td>Lama chirurgica Miltex Acciaio al carbonio n. 11 Sterile monouso confezionato singolarmente</td><td>McKesson</td><td>4-111</td><td>#11 Lama per bisturi</td></tr><tr><td>SYSTANE Unguento per gli occhi NOTTURNO</td><td>Alcon</td><td></td><td>Unguento per gli occhi</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>VWR</td><td>97063-702</td><td>Iniezione</td></tr></tbody></table>

somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare

Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection

La terapia genica è una potente tecnologia per fornire nuovi geni a un paziente per il trattamento della malattia, sia per introdurre un gene funzionale, inattivare un gene tossico o fornire un gene il cui prodotto può modulare la biologia della malattia. Il metodo di somministrazione del vettore terapeutico può assumere molte forme, che vanno dall'infusione endovenosa per la somministrazione sistemica all'iniezione diretta nel tessuto bersaglio. Per le malattie neurodegenerative, è spesso auspicabile inclinare la trasduzione verso il cervello e/o il midollo spinale. L'approccio meno invasivo per colpire l'intero sistema nervoso centrale prevede l'iniezione nel liquido cerebrospinale (CSF), consentendo alla terapia di raggiungere un'ampia frazione del sistema nervoso centrale. L'approccio più sicuro per rilasciare un vettore nel liquido cerebrospinale è l'iniezione intratecale lombare, in cui un ago viene introdotto nella cisterna lombare del midollo spinale. Questa tecnica, nota anche come puntura lombare, è stata ampiamente utilizzata nei roditori neonatali e adulti e nei modelli animali di grandi dimensioni. Sebbene la tecnica sia simile tra le specie e gli stadi di sviluppo, sottili differenze nelle dimensioni, nella struttura e nell'elasticità dei tessuti che circondano lo spazio intratecale richiedono sistemazioni nell'approccio. Questo articolo descrive un metodo per eseguire la puntura lombare nei ratti giovani per fornire un vettore del sierotipo 9 adeno-associato. Qui, 25-35 μL di vettore sono stati iniettati nella cisterna lombare e un reporter di proteina fluorescente verde (GFP) è stato utilizzato per valutare il profilo di trasduzione risultante da ciascuna iniezione. Vengono discussi i vantaggi e le sfide di questo approccio.

Per determinare l'accuratezza della tecnica di iniezione, è stato utilizzato un colorante, il blu di tripano, come surrogato della terapia. Questo colorante si lega facilmente alle proteine, quindi generalmente rimane all'interno della struttura in cui è stato iniettato. Ciò significa che il colorante potrebbe non prevedere con precisione la distribuzione post-iniezione della terapia; Viene semplicemente utilizzato per rivelare l'accuratezza dell'iniezione. Quando viene introdotto con successo nella cisterna lombare, il blu di tripano si lega alla dura madre, colorando di blu il perimetro del midollo spinale. Tuttavia, quando l'ago non riesce a penetrare la dura madre, il colorante finisce nello spazio epidurale. Sia la dura madre che i tessuti circostanti (la superficie dell'osso e i legamenti e i muscoli che collegano le lamine) saranno colorati di blu. Questi modelli sono facilmente visibili ad occhio nudo.
La differenza tra iniezione somministrata correttamente e in modo errato è difficile da valutare se si esegue semplicemente un taglio trasversale attraverso il midollo spinale e la colonna vertebrale. Si consiglia invece di eseguire una laminectomia utilizzando un paio di rongeurs a partire dalla lamina L5 e muovendosi rostralmente. Prestare attenzione a non danneggiare la dura madre durante il processo. L'uso del microscopio da dissezione facilita questo processo. La Figura 1 fornisce esempi comparativi di iniezioni riuscite e di iniezioni solo parzialmente riuscite. Con un'iniezione riuscita, si osserva un reflusso minimo o nullo lungo il percorso dell'ago quando l'ago viene ritirato. Dopo un'iniezione riuscita, la rimozione della lamina per esporre il midollo spinale rivela il tripano blu all'interno del midollo spinale ma non sulla superficie dell'osso (Figura 1A). Il colorante è visibile anche sul tronco encefalico e sul cervelletto dopo un'iniezione riuscita (Figura 1B). Al contrario, un'iniezione parzialmente riuscita è evidenziata da un significativo reflusso di colorante lungo il tratto dell'ago durante il processo di iniezione e/o da prove visibili di colorante sull'osso (Figura 1C).
Utilizzando la procedura di cui sopra, 28 μL di un vettore AAV9 che esprime la proteina fluorescente verde potenziata (GFP) sono stati iniettati a una concentrazione di 3 x 1013 genomi vettori/mL, per una dose totale di 8,4 x10 11 genomi vettori/animale. Quattro settimane dopo, gli animali sono stati soppressi e perfusi con paraformaldeide10% al 4%. Il cervello e il midollo spinale sono stati quindi raccolti e preparati per la sezionazione congelata. Sono state ottenute sezioni spesse 40 μm e colorate per GFP. La Figura 2 fornisce esempi del modello di trasduzione ottenuto con questo vettore. La trasduzione era generalmente più alta nel midollo spinale, in particolare nella regione lombare (Figura 2A-C), probabilmente a causa della sua vicinanza al sito di iniezione. La trasduzione del cervello è stata raggiunta (Figura 2D-F), ma, come previsto, tendeva ad essere più limitata di quella osservata nel midollo spinale.
Per illustrare la riproducibilità dei risultati ottenuti da un singolo chirurgo esperto utilizzando un singolo lotto di virus, sezioni colorate del cervelletto e della corteccia di ciascuno dei 15 ratti iniettati per questo studio sono presentate rispettivamente nella Figura 3 e nella Figura 4. Le sezioni colorate del midollo spinale cervicale sono presentate anche per 7 di questi 15 ratti (Figura 5). Naturalmente, la quantità di trasduzione cerebrale può mostrare una variabilità ancora maggiore con dosi diverse, lotti di vettori e chirurghi10.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig01.jpg"> Figura 1: Esposizione del midollo spinale a seguito di un'iniezione del colorante. Le laminectomie sono state eseguite dopo l'iniezione di blu di tripano. (A) Il midollo spinale è colorato di blu in un'iniezione correttamente somministrata e non si vede alcun colorante sull'osso rimosso durante la laminectomia (frecce). (B) Il colorante può essere osservato anche intorno al tronco encefalico. (C) In un'iniezione in cui c'è stato un reflusso significativo durante l'iniezione, c'è meno colorante all'interno del cordone e il colorante è presente sulla superficie dell'osso (frecce). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig02.jpg"> Figura 2: Esempi di modelli di trasduzione ottenuti in seguito alla somministrazione intratecale di AAV9-GFP. Sezioni spesse 40 μm di (A) midollo spinale cervicale, (B) toracico e (C) lombare sono state colorate immunoistochimicamente per GFP (colorazione nera). Alti livelli di trasduzione della materia grigia sono stati osservati a tutti i livelli. (D) Al contrario, il cervello mostra una trasduzione complessiva più rada. Le caselle sinistra e destra vengono ingrandite rispettivamente in (E) e (F). (E) La maggior parte delle colorazioni si osserva nel cervelletto, principalmente nei neuroni di Purkinje (frecce). (F) I neuroni (frecce) e gli astrociti (punte di freccia) sono trasdotti all'interno della corteccia cerebrale. Barre di scala: (A-C) 325 μm; (D) 5 mm; e (E,F) 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig03v2.jpg"> Figura 3: Riproducibilità della trasduzione nel cervelletto. Riproducibilità della trasduzione nel cervelletto di 15 ratti iniettati dallo stesso chirurgo utilizzando la stessa dose e lotto del virus. Barra della scala: 1 mm. I numeri nelle immagini indicano i numeri identificativi dei ratti ("cucciolata"). individuale»). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig03largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig04.jpg"> Figura 4: Riproducibilità della trasduzione nella corteccia. Riproducibilità della trasduzione nella corteccia di 15 ratti iniettati dallo stesso chirurgo utilizzando la stessa dose e lotto di virus. Barra di scala: 500 μm. I numeri nelle immagini indicano i numeri identificativi dei ratti ("cucciolata"). individuale»). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66463/66463fig05.jpg"> Figura 5: Riproducibilità della trasduzione nel midollo spinale cervicale. Riproducibilità della trasduzione nel midollo spinale cervicale di 7 ratti iniettati dallo stesso chirurgo utilizzando la stessa dose e lotto di virus. Barra di scala: 500 μm. I numeri nelle immagini indicano i numeri identificativi dei ratti ("cucciolata"). individuale»). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66463/66463fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Viene descritta una procedura chirurgica per eseguire iniezioni nella cisterna lombare del ratto giovane. Questo approccio è stato utilizzato per la somministrazione intratecale di vettori di terapia genica, ma si prevede che questo approccio possa essere utilizzato per una varietà di terapie, tra cui cellule e farmaci.

Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare

Gene therapy is a powerful technology to deliver new genes to a patient for the treatment of disease, be it to introduce a functional gene, inactivate a ...

La nostra ricerca si concentra sullo sviluppo di terapie geniche per le malattie che colpiscono il sistema nervoso centrale. A partire da dicembre 2023, la FDA ha approvato terapie geniche basate su AAV per una manciata di riserve genetiche, tra cui l'atrofia muscolare spinale, l'amaurosi congenita di Leber, la distrofia muscolare di Duchenne e l'emofilia A e B.Molti altri trattamenti sono attualmente in fase di studio in studi preclinici e clinici. L'ideazione di interventi sicuri ed efficaci per le malattie genetiche richiede l'utilizzo di una serie di approcci, da attenti studi di storia naturale nei pazienti al lavoro preclinico in colture tissutali e modelli animali, e la terapia genica è in realtà solo una delle numerose tecnologie utilizzate a questo scopo.Molti esperimenti di terapia genica utilizzano animali neonatali o adulti. Pochi valutano i trattamenti nei giovani, anche se questo rappresenta una popolazione significativa di pazienti per malattie genetiche. Quindi, per i bambini più grandi, le dimensioni del corpo e il sistema immunitario pongono ostacoli significativi alla somministrazione endovenosa di terapie geniche.La somministrazione intratecale può superare questo problema, ma abbiamo bisogno di modelli appropriati per testare questa ipotesi. Questa procedura che abbiamo sviluppato ci permetterà di valutare l'efficacia di questo approccio nei ratti giovani.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Smit, R. D., et al. Targeting del tratto corticospinale nei ratti neonatali con un doppio vettore virale utilizzando la chirurgia combinata del cervello e della colonna vertebrale. J. Vis. Exp. (2021)Questo video dimostra la somministrazione mirata di vettori virali ai neuroni corticospinali in un ratto neonatale. Il protocollo consente un'espressione genica precisa utilizzando iniezioni virali anterograde e retrograde, facilitando la ricerca sulla rigenerazione neurale e sulla...

Somministrazione virale mirata ai neuroni corticospinale in un ratto neonatale per studiare la lesione del midollo spinale

Fonte: Chen, Y., et al. Somministrazione intratecale di oligonucleotidi antisenso nel sistema nervoso centrale del ratto. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra l'erogazione di un composto di prova nel liquido cerebrospinale (CSF) attraverso un catetere impiantato nella colonna vertebrale lombare di un modello di ratto. Il composto circola lungo il liquido cerebrospinale fino al cervello e al midollo spinale, entra nei neuroni e offre un potenziale terapeutico.

Somministrazione intratecale di un composto di prova al sistema nervoso centrale del ratto

Fonte: Keefe, K. M., et al. L'iniezione diretta di un vettore lentivirale evidenzia molteplici vie motorie nel midollo spinale del ratto. J. Vis. Exp. (2019).Questo video mostra l'iniezione di un vettore virale di trasporto retrogrado (HiRet) altamente efficiente nel midollo spinale del ratto per tracciare i percorsi neuronali. Il virus ha glicoproteine per l'ingresso sinaptico e un gene codificante una proteina fluorescente. L'ago viene inserito nel midollo spinale e la sospensione virale...

Un'iniezione di vettore virale nel midollo spinale del ratto per il tracciamento neuronale retrogrado

Fonte: Li, D., et al. Iniezione intratecale diretta di virus adeno-associati ricombinanti in topi adulti. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per l'iniezione intratecale di virus adeno-associati (AAV) nel liquido cerebrospinale (CSF) di un topo sveglio, coprendo la preparazione della siringa, l'allineamento spinale e l'inserimento preciso dell'ago. Questo metodo convalida la somministrazione genica mirata, supportando il suo potenziale per le terapie del SNC.

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Questo rapporto descrive una tecnica semplice e rapida di intratecale ago puntura per una trasfezione di siRNA localizzato nel midollo spinale lombare nel topo sotto breve anestesia leggera durata.

In Vivo trasfezione di siRNA e Gene Knockdown in Spinal Cord via rapida non invasiva lombare spinale iniezioni nei topi

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Diretto iniezione intratecale di ricombinanti Virus Adeno-associato in topi adulti

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Consegna intratecala di Oligonucleotidi Antisense nel Rat Central Nervous System

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Impara la somministrazione intratecale di vettori AAV9 nella cisterna lombare di ratti giovani per studi di terapia genica. Questo protocollo chirurgico consente di valutare l'efficacia dei trattamenti nel sistema nervoso centrale.

Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare

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