Imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del DNA con motivo a stella a tre punte Autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza

Nel nostro laboratorio sviluppiamo nuove tecnologie di misura per la biologia su scala nanometrica. In particolare ci concentriamo sullo sviluppo della microscopia a forza atomica ad alta velocità per studiare i processi biologici dinamici su scala nanometrica. E per questo, abbiamo recentemente sviluppato una nuova modalità di imaging, che chiamiamo Photothermal Off Resonance Tapping, o PORT.

In questa modalità, stiamo utilizzando un laser di azionamento dedicato per azionare i cantilever in modo molto controllato ad alta velocità, il che ci consente di ottenere i dati e fino a due ordini di grandezza più velocemente rispetto alla tradizionale maschiatura fuori risonanza. Il gold standard nell'AFM ad alta velocità è l'imaging in modalità risonante. In questa modalità, il cantilever viene azionato a questa frequenza di risonanza, il che significa che la posizione del cantilever non può essere controllata, ma solo la sua ampiezza di oscillazione.

Per l'AFM a velocità normale, le modalità di mancata risonanza sono sempre più comuni. Tuttavia, la frequenza di attuazione è limitata qui, il che rende questa modalità di imaging piuttosto lenta. Utilizzando un laser secondario per azionare il cantilever, possiamo ottenere frequenze di attuazione più elevate, il che significa velocità di imaging più elevate.

Questo approccio ci consente di mantenere i vantaggi associati ad altre modalità di assegnazione del personale fuori risonanza, il che significa che possiamo ottimizzare l'equilibrio tra sensibilità e velocità dell'imaging. La velocità dell'immagine è limitata dal ritratto più alto. Se vogliamo aumentare il ritratto, dobbiamo aumentare la potenza del laser per mantenere la stessa ampiezza di attuazione.

Ciò può portare a uno scarso controllo della forza e danni al campione. Migliorare la larghezza di banda dei cantilever riducendone le dimensioni e migliorando l'efficienza di assorbimento del laser ci consentirà di ottenere velocità di porta più elevate, garantendo al contempo un'adeguata clearance del campione. Questo progresso faciliterà velocità di imaging più rapide, fondamentali per esaminare le complessità delle dinamiche di assemblaggio.

Per iniziare, pulire e preparare i cantilever. Monta i cantilever su un supporto compatibile con la microscopia elettronica a scansione o il sistema SEM. Quindi riscaldare il gas precursore da utilizzare sul sistema di iniezione del gas per far crescere la nuova punta.

Una volta che il vuoto scende al di sotto di 10 alla potenza di cinque millibar negativi, spurgare la linea di iniezione del gas 10 volte per due secondi ciascuna per rimuovere l'aria residua dalla linea dell'ugello. Utilizzare il SEM per individuare l'estremità del cantilever. Inclinare il supporto di un angolo per allineare correttamente il cantilever per l'imaging al microscopio a forza atomica.

Regola la posizione e la messa a fuoco del SEM per una visione chiara della punta del cantilever dove verrà coltivata la nano punta in carbonio. Quindi, imposta i parametri di deposizione nel software per far crescere la nuova punta. Avviare il processo di deposizione per far crescere la punta con una radiazione del fascio di elettroni sulla punta a sbalzo durante l'iniezione del gas precursore e interrompere l'iniezione di gas una volta completata la deposizione.

Eseguire l'imaging SEM post-crescita per valutare la qualità e le caratteristiche della punta appena cresciuta, inclusi il raggio e la lunghezza. Rimuovere il supporto dalla camera SEM. Per iniziare, prepara un microscopio a forza atomica ad alta velocità.

Usa le pinzette per posizionare un cantilever ultra corto sotto la clip a molla sul supporto del cantilever. Utilizzando una siringa, aggiungere 50 microlitri di liquido attraverso la porta di accesso al fluido sinistra. Quindi utilizzare tre manopole sulla testa AFM per allineare il laser di lettura sul cantilever.

Osserva l'ombra del cantilever su un foglio bianco massimizzando la somma. Quindi centrare lo spot laser sul fotodiodo utilizzando le due manopole dedicate. Quindi, selezionare la casella di eccitazione abilitata in eccitazione VI per accendere e allineare il laser di azionamento, azionando e oscillando il cantilever.

Visualizza i segnali di eccitazione e deflessione del cantilever su un oscilloscopio. Usa il metodo dell'ombra e massimizza l'ampiezza dell'oscillazione con le manopole di regolazione laser dell'azionamento. Per regolare l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo nella porta, aggiungere una tensione CC al circuito di controllo del diodo laser nella casella di configurazione in eccitazione VI e inserire l'ingresso CA picco-picco per il circuito di controllo del diodo laser.

Per ottenere le curve di interazione, impostare il VI del controller Z in modalità di contatto e fare clic su Avvia per avvicinarsi alla superficie del campione. Una volta raggiunta la superficie, eseguire una curva forza in funzione della distanza nella rampa VI per la calibrazione della sensibilità alla deflessione a sbalzo. Fare clic su ritira per ritrarre il piezo Z dalla superficie dove la punta non può arrivare.

Dopo la completa retrazione, passare alla modalità porta nel controller Z VI e accendere il laser di eccitazione in eccitazione VI.Impostare la modalità porta sulla frequenza desiderata. Le curve di interazione chiare sono state ottenute sottraendo l'oscillazione libera dall'oscillazione di contatto, fondamentale per l'imaging non distruttivo di campioni biologici. Alla velocità di 100 kilohertz, è stata raggiunta una buona qualità dell'immagine.

Tuttavia, quando la frequenza di eccitazione si avvicinava alla risonanza a sbalzo, il controllo del feedback si deteriorava, portando a curve di interazione oscurate e qualità dell'immagine degradata. Per iniziare, preparare una soluzione da 10 millimolari di acetato di magnesio. Utilizzando una siringa Hamilton, iniettare 50 microlitri di soluzione nel canale fluidico del supporto a sbalzo, creando una goccia di liquido che ingloba il cantilever.

Impostare la dimensione della scansione nel VI di scansione su 800 x 800 nanometri e la velocità della linea su 100 hertz. Per eseguire la scansione della superficie, fare clic sulla freccia della cornice per verificare la qualità. Dopo la scansione, fare clic su Ritira nel controller Z VI per ritrarre il cantilever dalla superficie.

Utilizzando una siringa Hamilton, rimuovere la soluzione tampone dal supporto a sbalzo. Quindi preparare una soluzione diluita di DNA a stella a tre punte e iniettare 50 microlitri di questa soluzione nel supporto a sbalzo. Esegui l'imaging con un'area di 800 x 800 nanometri a una velocità di linea predefinita di 100 hertz.

Dopo la scansione iniziale, regolare le dimensioni e la velocità dell'imaging e scansionare VI ai valori specificati per un'ulteriore acquisizione dei dati Mantenere l'input per il setpoint nella casella del setpoint VI del controller Z al livello più basso necessario per un tracciamento accurato durante il processo di imaging. Ripetere l'operazione per tutte le aree campione richieste. Utilizzando questo protocollo, l'assemblaggio in tempo reale di motivi di stelle a tre punte di DNA in isole stabili è stato osservato mediante AFM ad alta velocità.

Sono state ottenute immagini nitide a velocità di linea di 100 e 200 hertz per una velocità di porta di 100 kilohertz. Tuttavia, velocità di imaging più elevate senza aumentare la velocità delle porte riducevano la qualità dell'immagine a causa dei rapidi cambiamenti topografici. I risultati dell'imaging del DNA a tre punte per l'input CA da picco a picco più basso hanno mostrato strutture intatte, mentre l'input CA da picco a picco più alto ha provocato danni osservabili al campione a causa di forze più elevate.

Allo stesso modo, l'ingresso di offset CC più basso ha rivelato strutture intatte, mentre l'ingresso di offset CC più alto ha causato danni strutturali.