Name: Imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del DNA con motivo a stella a tre punte Autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Scopri la microscopia a forza atomica ad alta velocità con modalità PORT per studiare l'assemblaggio di motivi DNA a stella a tre punte. Questo metodo ottimizza i parametri di imaging e migliora la risoluzione temporale nelle interazioni biomolecolari.

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<meta charset="utf8"></head><body>Imaging migliorato dei motivi delle stelle del DNA grazie alla microscopia a forza atomica ad alta velocità PORT

<ol><li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy+and+its+future+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Reviews%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy and its future prospects.</a> Biophysical Reviews. 10 (2), 285-292 (2017).</li>
<li>Uchihashi, T., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+high-speed+atomic+force+microscopy+to+real-time+visualization+of+dynamic+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta.+General+Subjects%22%5BJournal%5D)">Applications of high-speed atomic force microscopy to real-time visualization of dynamic biomolecular processes.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. General Subjects. 1862 (2), 229-240 (2018).</li>
<li>Eghiaian, F., Rico, F., Colom, A., Casuso, I., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+atomic+force+microscopy%3A+Imaging+and+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">High-speed atomic force microscopy: Imaging and force spectroscopy.</a> FEBS Letters. 588 (19), 3631-3638 (2014).</li>
<li>Umeda, K., McArthur, S. J., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+resolution+in+high-speed+atomic+force+microscopy+for+studying+biological+macromolecules+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal resolution in high-speed atomic force microscopy for studying biological macromolecules in action.</a> Microscopy. 72 (2), 151-161 (2023).</li>
<li>Nievergelt, A. P., Banterle, N., Andany, S. H., Gönczy, P., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+photothermal+off-resonance+atomic+force+microscopy+reveals+assembly+routes+of+centriolar+scaffold+protein+SAS-6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">High-speed photothermal off-resonance atomic force microscopy reveals assembly routes of centriolar scaffold protein SAS-6.</a> Nature Nanotechnology. 13 (8), 696-701 (2018).</li>
<li>Heath, G. R., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+height+spectroscopy+reveals+%C2%B5s-dynamics+of+unlabeled+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM height spectroscopy reveals µs-dynamics of unlabeled biomolecules.</a> Nature Communications. 9, 4983(2018).</li>
<li>Ando, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndo%2C+T+%22High-Speed+Atomic+Force+Microscopy+in+Biology%22">High-Speed Atomic Force Microscopy in Biology</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2022).</li>
<li>Fukuda, S., Ando, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Faster+high-speed+atomic+force+microscopy+for+imaging+of+biomolecular+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Faster high-speed atomic force microscopy for imaging of biomolecular processes.</a> Review of Scientific Instruments. 92 (3), 033705(2021).</li>
<li>Jiao, F., Cannon, K. S., Lin, Y. -C., Gladfelter, A. S., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hierarchical+assembly+of+septins+revealed+by+high-speed+AFM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The hierarchical assembly of septins revealed by high-speed AFM.</a> Nature Communications. 11 (1), 5062(2020).</li>
<li>PeakForce Tapping. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html">https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/microscopes/materials-afm/afm-modes/peakforce-tapping.html</a> (2023).</li>
<li>Wang, S., Hao, C. Principle and application of peak force tapping mode atomic force microscope. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWang%2C+S+%22International+Conference+on+Cognitive-based+Information+Processing+and+Applications+%28CIPA+2021%29%22">International Conference on Cognitive-based Information Processing and Applications (CIPA 2021)</a>. , Springer. Singapore. 671-679 (2022).</li>
<li>Krotil, H. -U., Stifter, T., Waschipky, H., Weishaupt, K., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+force+mode%3A+a+new+method+for+the+investigation+of+surface+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+and+Interface+Analysis%22%5BJournal%5D)">Pulsed force mode: a new method for the investigation of surface properties.</a> Surface and Interface Analysis. 27 (5-6), 336-340 (1999).</li>
<li>Rosa-Zeiser, A., Weilandt, E., Hild, S., Marti, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+measurement+of+elastic%2C+electrostatic+and+adhesive+properties+by+scanning+force+microscopy%3A+pulsed-force+mode+operation%5BTitle%5D)+AND+%22Measurement+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The simultaneous measurement of elastic, electrostatic and adhesive properties by scanning force microscopy: pulsed-force mode operation.</a> Measurement Science and Technology. 8 (11), 1333(1997).</li>
<li>De Pablo, P. J., Colchero, J., Gómez-Herrero, J., Baró, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+mode+scanning+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Jumping mode scanning force microscopy.</a> Applied Physics Letters. 73 (22), 3300-3302 (1998).</li>
<li>Umeda, N., Ishizaki, S., Uwai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+attractive+force+microscope+using+photothermal+vibration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%22%5BJournal%5D)">Scanning attractive force microscope using photothermal vibration.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B. 9 (2), 1318-1322 (1991).</li>
<li>Avakyan, N., Conway, J. W., Sleiman, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+ordering+of+blunt-ended+DNA+tiles+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Long-range ordering of blunt-ended DNA tiles on supported lipid bilayers.</a> Journal of the American Chemical Society. 139 (34), 12027-12034 (2017).</li>
<li>Wang, R., Kuzuya, A., Liu, W., Seeman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blunt-ended+DNA+stacking+interactions+in+a+3-helix+motif%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Blunt-ended DNA stacking interactions in a 3-helix motif.</a> Chemical Communications. 46 (27), 4905-4907 (2010).</li>
<li>Parikka, J. M., Sokołowska, K., Markešević, N., Toppari, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+large+2D+lattices+out+of+DNA-tiles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Constructing large 2D lattices out of DNA-tiles.</a> Molecules. 26 (6), 1502(2021).</li>
<li>He, Y., Chen, Y., Liu, H., Ribbe, A. E., Mao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+hexagonal+DNA+two-dimensional+%282D%29+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of hexagonal DNA two-dimensional (2D) arrays.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (35), 12202-12203 (2005).</li>
<li>Lipid-DNA Method. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm">http://sabatinilab.wi.mit.edu/sabatini_public/reverse_transfection/lipid_dna_method.htm</a> (2023).</li>
<li>Pyne, A. L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Base-pair+resolution+analysis+of+the+effect+of+supercoiling+on+DNA+flexibility+and+major+groove+recognition+by+triplex-forming+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Base-pair resolution analysis of the effect of supercoiling on DNA flexibility and major groove recognition by triplex-forming oligonucleotides.</a> Nature Communications. 12 (1), 1053(2021).</li>
<li>Kielar, C., Zhu, S., Grundmeier, G., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+tip+effects+in+single-molecule+high-speed+atomic+force+microscopy+using+DNA+origami+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of tip effects in single-molecule high-speed atomic force microscopy using DNA origami substrates.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (34), 14336-14341 (2020).</li>
<li>Nievergelt, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-range+HS-AFM+imaging+of+DNA+self-assembly+through+in+situ+data-driven+control%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-range HS-AFM imaging of DNA self-assembly through in situ data-driven control.</a> Small Methods. 3 (7), 1900031(2019).</li>
<li>Caroprese, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+flexibility+dominates+over+binding+strength+for+supramolecular+crystallinity%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Structural flexibility dominates over binding strength for supramolecular crystallinity.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Welcome to Mao Group. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html">https://www.chem.purdue.edu/mao/index.html</a> (2023).</li>
<li>Nievergelt, A. P., Andany, S. H., Adams, J. D., Hannebelle, M. T., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Components+for+high-speed+atomic+force+microscopy+optimized+for+low+phase-lag%5BTitle%5D)+AND+%222017+IEEE+International+Conference+on+Advanced+Intelligent+Mechatronics+%28AIM%29%22%5BJournal%5D)">Components for high-speed atomic force microscopy optimized for low phase-lag.</a> 2017 IEEE International Conference on Advanced Intelligent Mechatronics (AIM). , Munich, Germany. (2017).</li>
<li>SPM Controller/Software. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/spm-controller-software/</a> (2023).</li>
<li>Open Hardware. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/openhardware/</a> (2023).</li>
<li>AFM head for small cantilevers with photothermal drive. EPFL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/">https://www.epfl.ch/labs/lbni/smallleverhead/</a> (2023).</li>
<li>AFM head for small cantilevers with photothermal drive. BioLever. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW">https://www.keybond.com.tw/index.php?route=product/category&path=87_89_88&lang_code=zh-TW</a> (2023).</li>
<li>BioLever. AppNano. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.appnano.com/product-page/biolever">https://www.appnano.com/product-page/biolever</a> (2023).</li>
<li>Python Scripting. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html">http://gwyddion.net/documentation/user-guide-en/pygwy.html</a> (2023).</li>
<li>Stahl, S. W., Puchner, E. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothermal+cantilever+actuation+for+fast+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Photothermal cantilever actuation for fast single-molecule force spectroscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 80 (7), 073702(2009).</li>
<li>Kangül, M., Asmari, N., Andany, S. H., Penedo, M., Fantner, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+feedback+performance+in+off-resonance+AFM+modes+through+pulse+train+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Enhanced feedback performance in off-resonance AFM modes through pulse train sampling.</a> arXiv. , (2023).</li>
<li>Giessibl, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Modern+Physics%22%5BJournal%5D)">Advances in atomic force microscopy.</a> Reviews of Modern Physics. 75 (3), 949-983 (2003).</li>
<li>Ando, T. High-Speed Atomic Force Microscopy (AFM). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndo%2C+T+%22Encyclopedia+of+Biophysics%22">Encyclopedia of Biophysics</a>. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>AC10DS</td><td>Olympus</td><td>BL-AC10FS-A2</td><td>fuori produzione</td></tr><tr><td>Biometra Compact XS/S</td><td>Biometra GmbH</td><td>846-025-199&nbsp;</td><td>Unità di elettroforesi</td></tr><tr><td>Biometra TRIO</td><td>Biometra GmbH</td><td>207072X</td><td>termociclatore per ricottura</td></tr><tr><td>Configurazione AFM personalizzata</td><td>Laboratorio per la strumentazione Bio-Nano, Istituto Interfacoltà di Bioingegneria, Scuola di Ingegneria, Ecole Polytechnique F&eacute; d&eacute; rale Losanna</td><td></td><td>Ottenibile tramite laboratorio per Bio-Nano Strumentazione</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ITW Reagenti</td><td>A5097</td><td>In tampone di ricottura</td></tr><tr><td>Misuratore di potenza laser</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td>Digitale Palmare Ottico&nbsp; Console del contatore di potenza ed energia</td></tr><tr><td>Lively 3AP Alimentatore, MP-310</td><td>Major Science</td><td>MP-310</td><td>Alimentatore per elettroforesi</td></tr><tr><td>MgAc2</td><td>ABCR GmbH</td><td>AB544692</td><td>In tampone di ricottura</td></tr><tr><td>TBE</td><td>Thermo Scientific</td><td>327330010</td><td>Tampone di funzionamento per elettroforesi</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610719</td><td>In tampone di ricottura</td></tr></tbody></table>

imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del dna con motivo a stella a tre punte autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-Point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping

In questa indagine, il processo di assemblaggio dinamico dei motivi delle stelle a 3 punte del DNA in isole stabili è stato osservato con successo utilizzando le capacità dell'HS-PORT AFM. Questa tecnica ci ha permesso di catturare l'assemblaggio di queste strutture in tempo reale. Nella Figura 2A, B, otteniamo una scansione chiara dell'immagine a velocità di linea di 100 Hz e 200 Hz, rispettivamente, per una velocità PORT di 100 kHz (800 nm per 800 nm di dimensione di scansione). Ciò corrisponde rispettivamente a 3,9 e 1,95 cicli di oscillazione per pixel. Tuttavia, l'imaging a velocità più elevate senza aumenti concomitanti della velocità PORT che consentirebbe un minimo di un ciclo di oscillazione per pixel ridurrà drasticamente la qualità dell'immagine, come si può vedere nella Figura 2C (0,78 di un ciclo di oscillazione per pixel). La velocità di imaging è limitata dalla velocità con cui il cantilever sonda la superficie con un appropriato controllo della forza del campione di punta, poiché la velocità di variazione topografica diventa troppo veloce per essere tracciata alla frequenza di campionamento della superficie.
Oltre a impostare una velocità di PORT sufficientemente elevata, è importante che le curve di PORT contengano le informazioni necessarie per controllare le forze. In particolare, la resistenza idrodinamica e la bassa larghezza di banda di rilevamento possono oscurare la forza applicata. La Figura 3 mostra la deflessione a sbalzo a diverse distanze dalla superficie del campione e i tassi di frequenza di eccitazione utilizzando una media di 4096 curve per ridurre il rumore. Le curve blu nella Figura 3A (per la velocità PORT di 100 kHz) e nella Figura 3D (per la velocità PORT di 500 Hz) rappresentano il movimento a sbalzo quando il cantilever è lontano dalla superficie e oscilla liberamente (non toccando la superficie durante un ciclo di oscillazione). Le curve rosse mostrano la deflessione del cantilever quando il cantilever oscilla vicino alla superficie e entra in contatto in modo intermittente con la superficie, sondando il campione. Per ottenere la vera curva di interazione e, quindi, l'interazione punta-campione, sottraiamo la curva blu dalla curva rossa per ottenere rispettivamente la Figura 3B,E. Un esempio di una chiara curva di interazione richiesta per l'imaging non distruttivo di campioni biologici è illustrato nella Figura 3B. Questa configurazione porta alla buona qualità dell'immagine mostrata nella Figura 3C, dove la velocità PORT è di 100 kHz. Man mano che aumentiamo la frequenza di eccitazione vicino alla risonanza a sbalzo, a un certo punto il controllo del feedback si deteriora, anche quando il cantilever mostra un'oscillazione di ampiezza sufficiente per staccarsi dalla superficie dopo aver aumentato la potenza del laser di eccitazione (Figura 3E). Se la frequenza PORT è troppo vicina alla frequenza di risonanza del cantilever, la risonanza del cantilever limita la risposta temporale della dinamica del cantilever. La flessione a sbalzo, quindi, non rappresenta più accuratamente l'interazione punta-campione e la curva di interazione che otteniamo è oscurata. Ciò porta a un degrado della qualità dell'immagine, come mostrato nella Figura 3F.
Una curva di interazione compromessa a frequenze PORT più elevate potrebbe verificarsi anche a causa della ridotta efficienza di attuazione a frequenze più alte33, che è attualmente uno dei fattori limitanti dei cantilever AFM commerciali ad alta velocità. Questa diminuzione raggiunge infine un livello di soglia nel roll-off, al quale l'imaging corretto è ostacolato: l'ampiezza dell'oscillazione potrebbe essere insufficiente per staccarsi dalla superficie e la punta è sempre a contatto, danneggiando le strutture del campione. Per contrastare la diminuzione dell'ampiezza causata da velocità PORT più elevate, abbiamo esplorato un aumento della potenza del laser. Abbiamo utilizzato una testa PORT in grado di raggiungere potenze laser più elevate per osservare meglio questo effetto. La potenza del laser di eccitazione, che abbiamo misurato con un misuratore di potenza, è stata suddivisa in componenti CC e CA. La potenza totale viene controllata regolando sul software la tensione picco-picco (ingresso CA picco-picco) e la tensione CC (ingresso offset CC) inviate al circuito di controllo del diodo laser. La Figura 4A mostra l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo picco-picco risultante da un aumento dell'ingresso c.a. picco-picco. Come previsto, l'ampiezza dell'oscillazione è ben correlata con il valore di ingresso CA. È importante notare che queste ampiezze picco-picco sono superiori a quelle normalmente utilizzate nell'imaging PORT. Quando si esegue l'imaging di campioni fragili, l'ampiezza CA è dell'ordine di 10-30 nm. La Figura 4B mostra l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo picco-picco per aumentare gli ingressi di offset CC. L'ampiezza dell'oscillazione picco-picco rimane abbastanza costante nell'intervallo di tensione di offset CC. Attribuiamo le piccole variazioni a non linearità nel rilevamento. La Figura 4C mostra l'aumento dei componenti di potenza laser CA e CC risultante dall'aumento della CA picco-picco. La Figura 4D mostra l'aumento dei componenti di potenza laser CA e CC risultante dall'aumento dell'offset dell'ingresso CC.
Gli effetti dell'aumento dell'ingresso CA picco-picco e dell'ingresso di offset CC sono stati testati separatamente per determinare i rispettivi effetti sulla potenza totale e sull'ampiezza dell'oscillazione. Un aumento della potenza del laser provoca l'interruzione del campione, probabilmente a causa dell'aumento della temperatura, mentre un aumento dell'ampiezza dell'oscillazione aumenterà la forza d'impatto sul campione5. L'aumento esclusivo dell'ingresso CA picco-picco avrà un impatto minore sull'aumento totale della potenza del laser, come mostrato nella Figura 4C, e aumenterà prevalentemente l'ampiezza dell'oscillazione a sbalzo (e di conseguenza la forza d'impatto), come mostrato nella Figura 4A. L'aumento dell'ingresso di offset CC avrà un effetto maggiore sull'aumento della potenza del laser, come mostrato nella Figura 4D, che riscalda il campione ma avrà un effetto trascurabile sull'ampiezza della deflessione, come mostrato nella Figura 4B. I risultati dell'imaging sono rappresentati nella Figura 4E, F. La Figura 4E illustra il DNA 3PS per l'ingresso CA da picco a picco più basso (immagine a sinistra, cerchiato in blu) e l'ingresso CA picco-picco più alto (immagine a destra, cerchiato in rosso), che si traduce in danni al campione presumibilmente a causa delle forze più elevate. La Figura 4F mostra il DNA 3PS per l'input di offset CC più basso (immagine a sinistra, cerchiato in blu) e l'input di offset CC più alto (immagine a destra, cerchiato in rosso), dove le strutture sono danneggiate.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig01.jpg"> 
Figura 1: La configurazione HS-AFM. (A) La testa PORT sullo scanner e la base dell'AFM, che mostra la (i) manopola per la regolazione della messa a fuoco del laser di lettura sul cantilever, (ii) manopola per la regolazione della posizione del laser di lettura sul cantilever, (iii) manopola per la regolazione della posizione orizzontale del laser sul fotodiodo, (iv) manopola per la regolazione della posizione verticale del laser sul fotodiodo, e (v) manopole per la regolazione della posizione del laser di azionamento fototermico sul cantilever. (B) Un primo piano del cantilever nella vista della sezione trasversale della testa con lo stadio del campione, dove (vi) è la clip a molla che tiene il cantilever. Il canale per l'iniezione del liquido è contrassegnato in rosso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig02.jpg"> 
Figura 2: Campione di DNA 3PS ripreso con AC10 a 100 kHz di velocità PORT a diverse velocità di linea. (A) 100 Hz (3,9 cicli di oscillazione per pixel), (B) 200 Hz (1,95 cicli di oscillazione per pixel) e (C) 500 Hz (0,78 cicli di oscillazione per pixel). Le immagini sono state scattate a setpoint di 350 pN o meno. Barra di scala 200 nm. Dopo l'imaging è stata presa una curva di forza per ottenere la sensibilità alla deflessione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig03v3.jpg"> 
Figura 3: Deflessione a sbalzo, curva di interazione e qualità dell'immagine a velocità PORT di 100 KHz e 500 kHz. (A) Deflessione a sbalzo (oscillazione libera a sbalzo vicina ma non a contatto con la superficie in blu, e oscillazione dello sbalzo quando lo sbalzo è a contatto intermittente con la superficie in rosso), (B) curva di interazione e (C) rispettiva qualità dell'immagine per una velocità PORT di 100 kHz. (D) Deflessione del cantilever (oscillazione libera del cantilever vicina ma non a contatto con la superficie in blu, e oscillazione del cantilever quando il cantilever è in contatto intermittente con la superficie in rosso), (E) curva di interazione e (F) rispettiva qualità dell'immagine per una velocità PORT di 500 kHz. Le immagini sono state scattate a una velocità di linea di 100 Hz. Barra di scala 200 nm. Dopo l'imaging è stata presa una curva di forza per ottenere la sensibilità alla deflessione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig03largev3.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66470/66470fig04.jpg"> 
Figura 4: Effetto della tensione di ingresso CA picco-picco Tensione di ingresso offset CC. Effetto dell'aumento della tensione di ingresso CA picco-picco (A) e della tensione di ingresso offset CC (B) sull'oscillazione picco-picco del cantilever. Effetto dell'aumento della tensione di ingresso CA picco-picco (C) e della tensione di ingresso offset CC (D) sulla potenza laser CA e CC. Qualità dell'immagine alla tensione di ingresso c.a. picco-picco (E) minima (cerchiata in blu) e massima (cerchiata in rosso) (E) e tensione di ingresso offset c.c. (F). Quando si aumenta la tensione di ingresso CA picco-picco, la tensione di ingresso di offset CC è stata mantenuta a 600 mV. Quando si aumenta la tensione di ingresso di offset CC, la tensione di ingresso CA picco-picco è stata mantenuta a 200 mV. L'integrità del campione è compromessa per la configurazione ad alta potenza. La velocità PORT è stata mantenuta a 100 kHz e la velocità di linea a 100 Hz. Barra di scala 200 nm. Dopo l'imaging è stata presa una curva di forza per ottenere la sensibilità alla deflessione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66470/66470fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del DNA con motivo a stella a tre punte Autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza

High-speed atomic force microscopy (HS-AFM) is a popular molecular imaging technique for visualizing single-molecule biological processes in real-time due ...

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Un tapping mode microscopio a forza atomica (AFM), metodo per la visualizzazione di DNA plasmidico, proteine ​​citoplasmatiche, e DNA-proteina complessi è descritta. Il metodo include approcci alternativi per la preparazione di campioni per l'imaging AFM seguenti manipolazione biochimica. Specifiche regioni di DNA che contiene le proteine ​​che interagiscono sono osservati in quasi fisiologico condizioni di buffer.

Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

Questo video descrive un metodo per visualizzare l'assemblaggio di condensati di proteine di fusione su molecole di DNA in loci specifici utilizzando l'imaging a singola molecola. Questi condensati si formano a causa delle interazioni LCD-LCD e LCD-DBD, che consentono il reclutamento della RNA polimerasi II e una migliore trascrizione genica.

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In questo video, dimostriamo la microscopia statica a forza atomica per visualizzare nucleosomi assemblati. Questa tecnica di imaging ad alta risoluzione consente lo studio della struttura del nucleosoma.

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In questo video, dimostriamo tecniche di imaging ad alta velocità di microscopia a forza atomica time-lapse, AFM, per studiare la dinamica dei complessi nucleosomici. Mentre la punta AFM scansiona la superficie del nucleosoma, rileva alterazioni nell'altezza del nucleosoma e registra lo srotolamento del DNA nel tempo.

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Qui si descrive la strumentazione e metodi per la rilevazione di molecole proteiche singolo fluorescenza marcata che interagiscono con una singola molecola di DNA sospeso tra due microsfere otticamente intrappolati.

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Polimeri semiflessibili visualizzano proprietà meccaniche uniche che sono ampiamente applicato da sistemi viventi. Tuttavia, gli studi sistematici sui biopolimeri sono limitati poiché proprietà quali la rigidità del polimero sono inaccessibili. Questo manoscritto descrive come questa limitazione è aggirata mediante nanotubi di DNA programmabili, permettendo studi sperimentali sull'impatto della rigidità del filamento.

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Qui, presentiamo un protocollo per caratterizzare le particelle nucleosoma a livello di singola molecola tramite microscopia a forza atomica statico e time-lapse (AFM) tecniche di imaging. Il metodo di funzionalizzazione superficiale descritto consente per la cattura della struttura e dinamica dei nucleosomi in alta risoluzione nanometrica.

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Questo articolo presenta una procedura sperimentale dettagliata per la ricostituzione di cavi di DNA contenenti nucleosomi per la forza correlativa a singola molecola e la microscopia a fluorescenza. Descrive inoltre diversi esperimenti a valle che possono essere condotti per visualizzare il comportamento di legame delle proteine che interagiscono con la cromatina e analizzare i cambiamenti nelle proprietà fisiche dei nucleosomi.

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Visualizzazione in tempo reale a singola molecola dello svolgimento del DNA mediante elicasi CMG

Scopri la microscopia a forza atomica ad alta velocità con modalità PORT per studiare l'assemblaggio di motivi DNA a stella a tre punte. Questo metodo ottimizza i parametri di imaging e migliora la risoluzione temporale nelle interazioni biomolecolari.

Imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del DNA con motivo a stella a tre punte Autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza (Video) | JoVE Journal

Imaging al microscopio a forza atomica ad alta velocità del DNA con motivo a stella a tre punte Autoassemblaggio mediante maschiatura fototermica a bassa risonanza

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