Name: Dissezione, elaborazione istologica e analisi dellespressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 50 s
Description: Scopri la dissezione del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino con microscopio, analisi istologica e dell'espressione genica per studiare il metabolismo e le funzioni fisiologiche.

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Questo lavoro è supportato dal NIDDK del NIH con il numero di premio R01DK116899, dall'USDA/ARS con il numero di premio 3092-51000-064-000D e da un premio pilota del Baylor College of Medicine Cardiovascular Research Institute. I diagrammi di flusso sono stati prodotti utilizzando BioRender.

Caratterizzazione morfologica e molecolare dello scBAT nei topi

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

In questo protocollo, presentiamo in dettaglio le procedure per la dissezione e l'elaborazione di scBAT per l'analisi di H&E e di espressione genica. Poiché lo scBAT risiede nello strato intermedio del collo e si trova lungo le grandi vene, l'isolamento di questo deposito richiede una tecnica precisa. In particolare, per ottenere una visione chiara del deposito, si consiglia di posizionare il topo sotto un microscopio da dissezione dopo l'apertura del collo. Utilizzando un paio di pinze a punta superfine per staccare lo scBAT dalla ghiandola salivare e dalle vene circostanti, è necessario prestare attenzione per evitare di perforare le vene. Un sanguinamento eccessivo può rendere più difficile l'individuazione dell'scBAT. Per elaborare scBAT per la colorazione H&E, abbiamo adattato l'uso di un protocollopubblicato 19 con lievi modifiche per includere l'uso di PFA al 4%, alcoli disidratanti e un solvente organico, il toluene, per il trattamento dei tessuti, come mostrato nella sezione del protocollo. L'intera procedura richiede ~ 6 giorni per essere completata e i vetrini colorati con H&E possono essere sottoposti a imaging il giorno successivo al completamento della colorazione.
La RT-qPCR che utilizza l'RNA come materiale di partenza è il metodo più frequentemente utilizzato per l'analisi dell'espressione genica nel campo della biologia del tessuto adiposo. Poiché scBAT è un deposito di BAT relativamente piccolo rispetto a iBAT, ottenere una quantità sufficiente di RNA per l'espressione genica può essere difficile. Per aumentare la resa dell'RNA, si consiglia di applicare le fasi di preparazione del lisato sequenziale come descritto nella sezione del protocollo, iniziando con la polvere del tessuto utilizzando un pestello e un mortaio mentre è congelato. Utilizzando questo metodo di preparazione del lisato, abbiamo ottenuto con successo un campione di RNA ad alta resa e di alta qualità per l'analisi dell'espressione genica di scBAT da un topo adulto. Questo metodo di preparazione del lisato può essere applicato anche per ottenere lisati proteici di alta qualità da scBAT per il western blotting con l'uso di tampone di lisi proteica.
Utilizzando l'iBAT di topo, i ricercatori hanno acquisito conoscenze sostanziali sulla funzione di BAT nella termogenesi e nel metabolismo. La recente identificazione di alcuni depositi di BAT precedentemente non riconosciuti nei topi e negli esseri umani, tra cui scBAT, ha rivelato la necessità di ulteriori studi prima di poter comprendere appieno il contributo fisiologico del BAT nei topi e negli esseri umani adulti. In particolare, sono necessari studi che illuminino le origini, le funzioni e il coinvolgimento di questi depositi di BAT appena scoperti nella termogenesi e nel metabolismo regionale o di tutto il corpo.

La crescente prevalenza dell'obesità negli Stati Uniti e in tutto il mondo ha suscitato un grande interesse per la comprensione della sua eziologia e l'identificazione di potenziali trattamenti 1,2. Il tessuto adiposo svolge un ruolo fondamentale nel metabolismo e la disregolazione del tessuto adiposo può portare allo sviluppo dell'obesità. Generalmente, esistono due tipi di tessuto adiposo, il tessuto adiposo bianco e il tessuto adiposo bruno. Mentre il tessuto adiposo bianco (WAT) può immagazzinare energia chimica e secernere fattori endocrini, il tessuto adiposo bruno (BAT) può utilizzare l'energia chimica per generare calore e mantenere la temperatura corporea al freddo 3,4. A causa di questa capacità unica, l'attivazione di BAT può anche aumentare il dispendio energetico e migliorare la sensibilità all'insulina5.
Il BAT esercita la sua funzione attraverso la termogenesi senza brividi, un processo mediato dal disaccoppiamento della proteina 1 (UCP1)6. I mammiferi, compresi i topi e gli esseri umani, possiedono quantità variabili di BAT. La visione classica del BAT è che questi tessuti adiposi sono più abbondanti nei topi e nei neonati che negli esseri umani adulti. iBAT, situato nel fianco dorsale superiore tra le scapole, è il deposito BAT più studiato nei topi. Applicando l'imaging con radioisotopi e i test bioptici, studi recenti hanno identificato diversi depositi di BAT in esseri umani adulti. Alcuni di essi, compresi i depositi trovati nella regione del collo profondo e sopraclavicolare, non erano stati precedentemente identificati nei topi o in altri animali modello 7,8,9,10,11. Tra questi depositi BAT, lo scBAT è il deposito più frequentemente osservato negli esseri umani adulti. Per comprendere meglio l'origine e il contributo molecolare di questi depositi BAT appena scoperti nell'uomo, è essenziale identificare depositi equivalenti nei topi che consentano manipolazioni genetiche e molecolari per tracciare e testare il ruolo funzionale di questi depositi. Pertanto, noi e altri abbiamo identificato alcuni depositi di BAT precedentemente sconosciuti in diverse posizioni anatomiche nei topi, tra cui scBAT12,13, BAT perivascolare toracico 14,15, BAT perirenale16 e BAT periaortico17. Lo scBAT di topo assomiglia anatomicamente allo scBAT umano e morfologicamente assomiglia all'iBAT classico, esprimendo alti livelli di UCP112.
A differenza dell'iBAT di topo, che può essere facilmente sezionato, lo scBAT è situato nello strato intermedio del collo del topo, sotto le ghiandole salivari e lungo la vena giugulare esterna. L'isolamento di questo deposito per le analisi istologiche e molecolari può essere difficile. Qui, descriviamo in dettaglio la procedura per la dissezione di scBAT da topi postnatali e adulti e l'elaborazione di questo deposito per l'analisi istologica e dell'espressione genica.

<table><tbody><tr><td>Alcool disidratante al 95% (Flex 95)</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>Alcool disidratante al 100% (Flex 100)</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>Piastra PCR a 96 pozzetti</td><td>Bio-Rad</td><td>MLL9601</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Binding Mini colonna</td><td>Bio-Rad</td><td>7326826</td><td></td></tr><tr><td>Aurum High Stringency Wash</td><td>Bio-Rad</td><td>7326803</td><td></td></tr><tr><td>Aurum Low Stringency Wash</td><td>Stampi base Bio-Rad</td><td>7326804</td><td></td></tr><tr><td>(per inclusione)</td><td>Tissue-Tek</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>BD Precision Glide Ago 21g x 1 1/2"</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Termociclatore</td><td>Bio-Rad</td><td>1840148</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga senza tappo 2 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>02-681-453</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Opus 96 Strumento per PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad</td><td>12011319</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>383760010</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60 Mezzo di montaggio a bassa viscosità</td><td>Epredia</td><td>83104</td><td></td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td><td>Ambion</td><td>AM 9906</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio da dissezione</td><td>Nikon</td><td></td><td></td>SMZ1500</tr><tr><td>Soluzione di diluizione della DNasi</td><td>Bio-Rad</td><td>7326805</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I</td><td>Bio-Rad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Soluzione di</td> eluizione <td>Invitrogen</td><td>18427013</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>7326801</td><td></td></tr><tr><td>EM 400 paraffina media incorporante</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801320</td><td></td></tr><tr><td>Eosina Y (0,5% p/v)</td><td>RICCA</td><td>2858-16</td><td></td></tr><tr><td>Formula R Mezzo di infiltrazione paraffina</td><td>Leica Biosystems</td><td>3801470</td><td></td></tr><tr><td>Genemark Nutator Gyromixer 349</td><td>Bio Express</td><td>S-3200-2</td><td></td></tr><tr><td>Gill #3 Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GHS332-1L</td><td></td></tr><tr><td>HCl (per HCL-Etanolo)</td><td>Fisher Chemical</td><td>A142212</td><td></td></tr><tr><td>IP VI Cassette di inclusione</td><td>Leica Biosystems</td><td>39LC-550-5-L</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo puro Koptec - 200 Proof (per il 70% di etanolo)</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (25 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0971</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga 1,7 mL</td><td>Avantor</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizioni Microseal 'B' (guarnizioni adesive)</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>RM2245</td><td></td></tr><tr><td>Grado di biologia molecolare</td><td>Corning</td> all'acqua <td>46-000-CM</td><td></td></tr><tr><td>Mortaio Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl (per soluzione salina allo 0,85%)</td> <td>Fisher Bioreagents</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>NanoDrop Tecnologie NanoDrop</td><td>ND-1000 UV/Vis</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>Invitrogen</td><td>18418020</td><td></td></tr><tr><td>Sezione di paraffina Bagno di galleggiamento</td><td>Boekel Scientific</td><td>14792V</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tube Strip</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Pestello di Coors Tek</td><td>Thomas Scientific</td><td>60311</td><td></td></tr><tr><td>Pestello Motore a pellet</td><td>Kimble</td><td>749540-0000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Precision Model 19 Forno a vuoto&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>CAT# 51221162</td><td></td></tr><tr><td>Primer: 36B4&nbsp; (avanti) 10 &mu; M 5' TGA AGT GCT CGA CAT CAC AGA GCA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: 36B4 (inverso) 10 &mu; M 5' GCT TGT ACC CAT TGA TGA TGG AGT GT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Fabp4 (avanti) 10 &mu; M 5' ACA CCG AGA TTT CCT TCA AAC TG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Fabp4 (inverso) 10 &mu; M 5' CCA TCT AGG GTT ATG ATG CTC TTC A 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Glut 4 (primer in avanti) 10 &mu; M 5' CTG ATT CTG CTG CCC TTC TGT CCT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Glut 4 (inverso) 10 &mu; M 5' GAC ATT GGA CGC TCT CTC TCC AAC TT 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: PPARg (avanti) 10 &mu; M 5' AGG GCG ATC TTG ACA GGA AAG ACA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: PPARg (riserva) 10 &mu; M 5' AAA TTC GGA TGG CCA CCT CTT TGC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Ppargc1a (inverso) 10 &mu; M 5' ATG TTG CGA CTG CGG TTG TGT ATG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Ppargc1a(avanti) 10 &mu; M 5' ACG TCC CTG CTC AGA GCT TCT CA 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Ucp1 (avanti) 10 &mu; M 5' AGC CAC CAC AGA AAG CTT GTC AAC 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr><tr><td>Primer: Ucp1 (inverso) 10 &mu; M 5' ACA GCT TGG TAC GCT TGG GTA CTG 3'</td><td></td><td></td><td>Chen lab Oligo database</td></tr> Soluzione <tr><td>di isolamento dell'RNA (PureZol)</td><td>Bio-Rad</td><td>7326880</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away (decontaminante superficiale)</td><td>Thermo Scientific</td><td>1437535</td><td></td></tr><tr><td>RNasi H</td><td>NEB</td><td>M0297S</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della RNasi (RNase Out)</td><td>Invitrogen</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Fiala di scintillazione (vetro)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>72632</td><td></td></tr><tr><td>Banco di asciugatura vetrini&nbsp;</td><td>Elettrotermico (Cole-Parmer)</td><td>MH6616</td><td></td></tr><tr><td>Rack di colorazione in acciaio inox</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>70312-54</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio (per inclusione)</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Forbici sugiche</td><td>McKesson</td><td>43-1-104</td><td></td></tr><tr><td>Pinza da dissezione diritta a punta superfine</td><td>Avantor</td><td>82027-402</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus Vetrini per microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>trascrittasi inversa in apice III (include 5 tamponi del primo filamento e 0,1 M DTT)&nbsp;</td><td>Siringa Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>SUR-VET con ago 25 G x 5/8", 1 mL</td><td>Terumo</td><td>100281</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green (miscela master enzimatica qPCR)</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25778</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Manual Dyling Coloring Set (barattoli)</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>SKU: 62540-01</td><td></td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Fisher Chemical</td><td>T324-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>Avantor</td><td>414004-005</td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Fisher Chemical</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

dissezione, elaborazione istologica e analisi dell'espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino

Dissection, Histological Processing, and Gene Expression Analysis of Murine Supraclavicular Brown Adipose Tissue

La termogenesi mediata dal tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo importante nella regolazione del metabolismo e la sua morfologia e funzione possono essere notevolmente influenzate dagli stimoli ambientali nei topi e nell'uomo. Attualmente, il BAT interscapolare murino (iBAT), che si trova tra due scapole nel fianco dorsale superiore dei topi, è il principale deposito di BAT utilizzato dai laboratori di ricerca per studiare la funzione dei BAT. Recentemente, sono stati identificati alcuni depositi BAT precedentemente sconosciuti nei topi, tra cui uno analogo al tessuto adiposo bruno sopraclavicolare umano. A differenza dell'iBAT, il tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino (scBAT) si trova nello strato intermedio del collo e quindi non è facilmente accessibile.
Per facilitare lo studio di scBAT murini appena identificati, viene presentato un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi per sezionare scBAT intatti da topi postnatali e adulti. A causa delle piccole dimensioni di scBAT rispetto ad altri depositi adiposi, le procedure sono state modificate e ottimizzate specificamente per il trattamento di scBAT. Tra queste modifiche c'è l'uso di un microscopio da dissezione durante la raccolta dei tessuti per aumentare la precisione e l'omogeneizzazione dei campioni scBAT congelati per aumentare l'efficienza della successiva analisi qPCR. Con queste ottimizzazioni, è possibile determinare l'identificazione, l'aspetto morfologico e la caratterizzazione molecolare dello scBAT nei topi.

A differenza dell'iBAT, che si trova nello strato sottocutaneo della schiena tra due scapole, lo scBAT è situato nello strato intermedio del collo, che si estende in profondità tra gli strati del muscolo scheletrico e della ghiandola salivare mentre cresce lungo la vena giugulare esterna (Figura 1A). L'analisi di scBAT non è così semplice come iBAT. Qui, forniamo una procedura dettagliata che include passaggi cruciali per la dissezione di scBAT intatti da topi postnatali e adulti (Figura 1B,C). Dopo aver aperto il collo utilizzando il protocollo fornito, un sottile strato di scBAT può essere identificato con un microscopio da dissezione e staccato dalla ghiandola salivare collegata e dalla vena giugulare esterna con un paio di pinze (Figura 1D,E). Per valutare la morfologia del deposito, scBAT appena isolato è stato processato utilizzando la procedura di trattamento fornita in combinazione con una procedura di colorazione H&amp;Eprecedentemente pubblicata 19 (Figura 2A). Come mostrato nella Figura 2B, scBAT possiede strutture tissutali tipiche dei depositi BAT ed è composto da molti piccoli adipociti multiloculari in topi sani postnatali e adulti. Per valutare i livelli di espressione genica in scBAT, l'RNA è stato estratto da depositi scBAT isolati utilizzando le procedure fornite (Figura 3A). I livelli di espressione dei geni di interesse possono quindi essere valutati con metodi standard di RT-qPCR (Figura 3A). Come mostrato in Figura 3B, i livelli di espressione differenziale dei geni coinvolti nella mediazione della funzione di scBAT, tra cui Pparg, il regolatore principale dello sviluppo di BAT; Fabp4 e Glut4, due trasportatori di nutrienti; e Ucp1 e Ppargc1a, due geni coinvolti nella termogenesi, possono essere facilmente determinati. Per fare un confronto, l'RNA è stato estratto da iBAT isolato e l'espressione dei geni sopra elencati è stata valutata utilizzando anche le procedure fornite (Figura 3A). I livelli di espressione di questi geni sono relativamente simili tra questi due depositi. (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig1.jpg"> Figura 1: Localizzazione anatomica dello scBAT e processo di dissezione. (A) Posizione dello scBAT nello strato intermedio del collo. (B) Lo strato superficiale del collo prima e dopo la rimozione della pelle. Barra della scala = 250 μm. Le linee gialle tratteggiate delineano l'area che deve essere esposta dopo aver eseguito l'incisione a forma di U. (C) Immagine di una carcassa di topo posta sotto un microscopio da dissezione per aumentare la chiarezza visiva durante la dissezione. (D,E) Immagini rappresentative dello strato intermedio del collo prima e dopo la rimozione di scBAT da topi di età compresa tra 3 settimane e 3 mesi. Barra della scala = 250 μm. Linee gialle tratteggiate delineano i depositi scBAT bilaterali esposti; n = 2. Abbreviazioni: scBAT = tessuto adiposo bruno sopraclavicolare; SFI = strato superficiale; SG = ghiandola salivare; tr = trachea; jv = vena giugulare esterna; SM = muscolo scheletrico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig2.jpg"> Figura 2: Elaborazione di scBAT per la colorazione H&amp;E. (A) Diagramma di flusso che illustra le fasi principali dell'elaborazione di scBAT per la colorazione H&amp;E. Dopo aver sezionato il tessuto, viene fissato in sequenza, disidratato, incorporato, sezionato e colorato. (B) Immagini rappresentative di scBAT colorati con H&amp;E da topi di età compresa tra 3 settimane e 3 mesi; n = 3 per ogni stadio di sviluppo; barra graduata = 250 μm per immagini con ingrandimento inferiore; Barra della scala = 50 μm per immagini con ingrandimento maggiore. Abbreviazioni: scBAT = tessuto adiposo bruno sopraclavicolare; PFA = paraformaldeide; H&amp;E = ematossilina ed eosina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66475/66475fig3.jpg"> Figura 3: Preparazione dell'RNA da scBAT per l'analisi dell'espressione genica. (A) Diagramma di flusso che illustra le fasi dell'isolamento dell'RNA e l'analisi RT-qPCR dell'espressione genica di scBAT. Grazie alle sue dimensioni ridotte e alla sua consistenza morbida, il congelamento istantaneo del deposito scBAT e la sua macinazione in azoto liquido sono fondamentali per il successo dell'isolamento dell'RNA. (B) Espressione relativa di geni marcatori, tra cui Pparg, Fabp4, Glut4, Ucp1 e Ppargc1a, in scBAT e iBAT isolati da topi maschi di 3 mesi, n = 5. I dati sono presentati come media ± SEM. 36B4 è stato utilizzato come gene housekeeping per la normalizzazione. Abbreviazioni: scBAT = tessuto adiposo bruno sopraclavicolare; RT-qPCR = PCR quantitativa a trascrizione inversa; LN2 = azoto liquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66475/66475fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

In questo articolo, forniamo una procedura pratica per la dissezione e l'esecuzione di analisi istologiche e di espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino.

Dissezione, elaborazione istologica e analisi dell'espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino

Brown adipose tissue (BAT)-mediated thermogenesis plays an important role in the regulation of metabolism, and its morphology and function can be greatly ...

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In questo video, dimostriamo la procedura chirurgica per isolare il tessuto adiposo bianco sottocutaneo e il tessuto adiposo bruno interscapolare da un topo appena nato.

Raccolta del deposito adiposo bianco e marrone dal cucciolo di topo: una procedura chirurgica per raccogliere il tessuto adiposo bianco e il tessuto adiposo bruno dal cucciolo di topo

Grazie al collegamento drastica e negativa tra obesità e altre patologie concomitanti, la ricerca sul adiposo giochi di ruolo nella malattia e la salute generale è garantito. Presentiamo un protocollo per l'isolamento e l'escissione di depositi adiposi consentano lo studio della adiposo usare in situ e metodi in vitro.

Localizzazione, identificazione, e l&#39;escissione dei Depositi Murine adipose

Consecutivi crio-sezioni sono raccolti per consentire alle applicazioni istologiche e l'arricchimento di RNA per misure di espressione genica utilizzando zone adiacenti da un muscolo scheletrico singolo mouse. RNA di alta qualità si ottiene da 20 - 30 mg di criosezioni e le misure messe in comune sono direttamente confrontato tra le applicazioni.

Criosezionamento di regioni contigue di un muscolo scheletrico mouse unico per l&#39;espressione genica e analisi istologiche

Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

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Gli adipociti esistono in depositi discreti e hanno ruoli diversi all'interno dei loro microambienti unici. Poiché vengono scoperte le differenze regionali nel carattere e nella funzione degli adipociti, l'identificazione standardizzata e l'isolamento dei depositi sono fondamentali per l'avanzamento del campo. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'escissione di vari depositi adiposi del topo.

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Vi presentiamo un protocollo per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica delle cellule staminali derivate dalla cresta neurale derivate da cellule staminali derivate da adiposo (NCADSC) dal tessuto adiposo periaortico del Wnt-1Cre Topi Rosa26RFP/z. Le NCADSC possono essere una fonte facilmente accessibile di ADSC per la modellazione dell'adipogenesi o della lipogenesi in vitro.

Isolamento, cultura e induzione adipogenica di cellule staminali adipose originali adipose-derivate da cellule staminali periaortiche

Questo rapporto descrive un protocollo per l'isolamento simultaneo dei preadipociti primari marroni e bianchi dai topi appena nati. Le cellule isolate possono essere coltivate in coltura e indotte a differenziarsi in adipociti bianchi e marroni completamente maturi. Il metodo consente la caratterizzazione genetica, molecolare e funzionale delle cellule adipose primarie in coltura.

Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati

Questo studio descrive un nuovo metodo per isolare gli adipociti bruni murini per l'analisi dell'espressione genica e proteica.

Isolamento di adipociti bruni da tessuto adiposo bruno interscapolare murino per l'analisi dell'espressione genica e proteica

Imaging funzionale e quantificazione di depositi adiposi termogenici nei topi utilizzando un approccio basato sull'imaging micro-PET/MR.

Visualizzazione e quantificazione dei tessuti adiposi marroni e beige nei topi utilizzando [18F]FDG Micro-PET/MR Imaging

I preadipociti sono isolati dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo bruno interscapolare di topi neonati e differenziati in cellule che accumulano goccioline lipidiche, esprimono marcatori molecolari e mostrano la morfologia mitocondriale degli adipociti bruni maturi. Queste cellule vengono ulteriormente analizzate mediante immunofluorescenza e microscopia elettronica a trasmissione.

Differenziazione e imaging di adipociti marroni dalla frazione vascolare stromale del tessuto adiposo interscapolare da topi neonati

Questo protocollo descrive l'isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale (SVF) dal tessuto adiposo murino per ottenere preadipociti e ottenere la differenziazione degli adipociti in vitro. L'uso di un dissociatore tissutale per la digestione della collagenasi riduce la variazione sperimentale e aumenta la riproducibilità.

Isolamento semi-automatico della frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo bianco murino mediante un dissociatore tissutale

Scopri la dissezione del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino con microscopio, analisi istologica e dell'espressione genica per studiare il metabolismo e le funzioni fisiologiche.

Dissezione, elaborazione istologica e analisi dell'espressione genica del tessuto adiposo bruno sopraclavicolare murino

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