Name: Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per lanalisi al microscopio elettronico ad ampia area montata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: Impara la procedura di ferita da puntura per studiare la formazione del trombo emostatico nei modelli murini. Questo metodo utilizza la microscopia elettronica a volume per analizzare la struttura trombocitaria e migliorare le strategie terapeutiche.

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<meta charset="utf8"></head><body>Emostasi da puntura e microscopia elettronica montata

<ol><li>Rhee, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Venous+puncture+and+wound+hemostasis+results+in+a+vaulted+thrombus+structured+by+locally+nucleated+platelet+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Venous puncture and wound hemostasis results in a vaulted thrombus structured by locally nucleated platelet aggregates.</a> Comm Biol. 4 (1), 1090(2021).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+platelet+capture+provides+a+mechanism+for+restricting+circulating+platelet+activation+in+the+wound+site%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Tethered platelet capture provides a mechanism for restricting circulating platelet activation in the wound site.</a> Res Pract Thromb Haemost. 7 (2), 100058(2023).</li>
<li>Yadav, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+basis+of+platelet+secretion%3A+emerging+structure%2Ffunction+relationships%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">The cellular basis of platelet secretion: emerging structure/function relationships.</a> Platelets. 28 (2), 108-118 (2017).</li>
<li>Joshi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferric+chloride-induced+arterial+thrombosis+and+sample+collection+for+3D+electron+microscopy+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ferric chloride-induced arterial thrombosis and sample collection for 3D electron microscopy analysis.</a> J Vis Exp. (193), e64985(2023).</li>
<li>Guerrero, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+von+Willebrand+factor%2Fglycoprotein+Ib-IX+axis+with+a+platelet-type+von+Willebrand+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Visualizing the von Willebrand factor/glycoprotein Ib-IX axis with a platelet-type von Willebrand disease mutation.</a> Blood. 114 (27), 5541-5546 (2009).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+glycoprotein+VI+to+stable+platelet+adhesion+and+thrombus+formation+illustrated+by+targeted+gene+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The contribution of glycoprotein VI to stable platelet adhesion and thrombus formation illustrated by targeted gene deletion.</a> Blood. 102 (5), 1701-1707 (2003).</li>
<li>Tomaiuolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationships+between+structure+and+function+during+the+hemostatic+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+NatlAcad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interrelationships between structure and function during the hemostatic response to injury.</a> Proc NatlAcad Sci U S A. 116 (6), 2243-2252 (2019).</li>
<li>Cocchiaro, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+lipid+droplets+are+translocated+into+the+lumen+of+the+Chlamydia+trachomatis+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (27), 9379-9384 (2008).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis+hijacks+intra+-+Golgi+COG+complex+-+dependent+vesicle+trafficking+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis hijacks intra - Golgi COG complex - dependent vesicle trafficking pathway.</a> Cell Microbiol. 14 (5), 656-668 (2012).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> J Str Biol. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Str Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Chan, N. C., Eikelboom, J. W., Weitz, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+treatments+for+arterial+and+venous+thrombosis%3A+role+of+the+direct+oral+anticoagulants%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Evolving treatments for arterial and venous thrombosis: role of the direct oral anticoagulants.</a> Circ Res. 118 (9), 1409-1424 (2016).</li>
<li>Kiernan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde%2C+formalin%2C+paraformaldehyde%2C+and+glutaraldehyde%3A+what+they+are+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde, formalin, paraformaldehyde, and glutaraldehyde: what they are and what they do.</a> Microscopy Today. 8 (1), 8-13 (2000).</li>
<li>Storrie, B., Attardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+mitochondrial+genome+in+HeLa+cells%3A+XV.+Effect+of+inhibition+of+mitochondrial+protein+synthesis+on+mitochondrial+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+CellBiol%22%5BJournal%5D)">Expression of the mitochondrial genome in HeLa cells: XV. Effect of inhibition of mitochondrial protein synthesis on mitochondrial formation.</a> J CellBiol. 56, 819-831 (1973).</li>
<li>Liu, S., Pokrovskaya, I. D., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+-+pressure+freezing+followed+by+freeze+substitution%3A+an+optimal+electron+microscope+technique+to+study+Golgi+apparatus+organization+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High - pressure freezing followed by freeze substitution: an optimal electron microscope technique to study Golgi apparatus organization and membrane trafficking.</a> Meth Mol Biol. 2557, 211-223 (2023).</li>
<li>Klarhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+blood+flow+velocity+measurements+in+the+human+finger%5BTitle%5D)+AND+%22Mag+Res+Med%22%5BJournal%5D)">High-resolution blood flow velocity measurements in the human finger.</a> Mag Res Med. 45 (4), 716-719 (2001).</li>
<li>Chaudry, R., Miao, J. H., Rehman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology%2C+cardiovascular%5BTitle%5D)+AND+%22StatPearls%22%5BJournal%5D)">Physiology, cardiovascular.</a> StatPearls. , Treasure Island, FL, USA. (2022).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNARE+-+dependent+membrane+fusion+initiates+a-granule+matrix+decondensation+in+mouse+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">SNARE - dependent membrane fusion initiates a-granule matrix decondensation in mouse platelets.</a> Blood Adv. 2 (21), 2947-2958 (2018).</li>
<li>Pokrovskaya, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+ultrastructural+analysis+of+a-granule%2C+dense+granule%2C+mitochondria%2C+and+canalicular+system+arrangement+in+resting+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Res+Pract+Thrombosis+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">3D ultrastructural analysis of a-granule, dense granule, mitochondria, and canalicular system arrangement in resting human platelets.</a> Res Pract Thrombosis Haemostasis. 4 (1), 72-85 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Soluzione salina normale allo 0,9%</td><td>Medline</td><td>BHL2F7123HH</td><td></td></tr><tr><td>27G x 3/4 EXELint set di vene del cuoio capelluto</td><td>Medline</td><td>NDA26709</td><td></td></tr><tr><td>30G x 1/2 EXELint aghi ipodermici</td><td>Medline</td><td>NDA264372</td><td></td></tr><tr><td>33G x 1/2 EXELint aghi ipodermici speciali</td><td>Medline</td><td>NDA26393</td><td></td></tr><tr><td>50 mL provette coniche</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-20</td><td></td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol (70% alcol isopropilico)</td><td>Medline</td><td>MDS090670Z</td><td></td></tr><tr><td>foglio di alluminio</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra riscaldante per animali</td><td>Physitemp Instruments</td><td>HP-1M</td><td></td></tr><tr><td>Araldite GY 502 Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>10900</td><td></td></tr><tr><td>Axiocam 305 Fotocamera per microscopia a colori R2</td><td>Microscopia Carl Zeiss</td><td>426560-9031-000</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe BD Luer-Lok, 20 mL</td><td>Medline</td><td>B-D303310Z</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari 35 mm x 10 mm</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>430165</tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>Medline</td><td>MDS202055H</td><td></td></tr><tr><td>Attivatore DMP-30 Microscopia</td><td>elettronica Scienze</td><td>13600</td><td></td></tr><tr><td>Anidride dodecenilsuccinica / DDSA</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>13700</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per medicazione, 5", curve, seghettate, a punta stretta</td><td>Pinze per</td> medicazione Integra Miltex <td>6-100</td><td></td></tr><tr><td>, 5", standard, seghettato</td><td>Integra Miltex</td><td>6-6</td><td></td></tr><tr><td>EMBED 812 Resin Electron</td><td>Microscopy Sciences</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Alcool etilico, anidro 200 proof</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15055</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Rack per tubi a 4 vie</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Timer digitale</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-649-17</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Pompa per infusione a siringa singola</td><td>Fisher Scientific</td><td>7801001</td><td></td></tr><tr><td>Spugne di garza 2" x 2" - 4 strati</td><td>Medline</td><td>NON26224H</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldeide (soluzione al 10%)</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>16120</td><td></td></tr><tr><td>Anestesia inalante liquida all'isoflurano, 100 ml</td><td>Medline</td><td>66794-017-10</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Fine in stile gioielliere Pinze, stile 5F</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305</td><td>Servono 2 paia.</td></tr><tr><td>L/S Tubo Pompa, Silicone, L/S 15; 25 ft</td><td>VWR</td><td>MFLX96410-15</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-Aspartico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP374-100</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di piombo</td><td>Fisher Scientific</td><td>L-62</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Green 4</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>18100</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Easy-Load II Testa pompa</td><td>VWR</td><td>MFLX77200-62</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Azionamento digitale a velocità variabile</td><td>VWR</td><td>MFLX07528-10</td><td></td></tr><tr><td>MSC Xcelite 5" Tronchesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-191-9855</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio 4% Soluzione acquosa</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (soluzione 16%)</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore</td> <td>di temperatura PhysitempPhysitemp Instruments</td><td>TCAT-2LV</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8131</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di propilene, reagente ACS</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>20401</td><td></td></tr><tr><td>Becher in vetro Pyrex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25B</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di temperatura rettale per topi</td><td>Physitemp Instruments</td><td>RET-3</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic Nastro Invisibile, 3/4 "x 1000"</td> <td>3M Company</td><td>305289</td><td></td></tr><tr><td>Tampone Cacodilato di Sodio 0.2M, pH 7.4</td><td>Microscopia Elettronica Scienze</td><td>11623</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Vaporizzatore Elettronico a Basso Flusso</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-01</td><td></td></tr><tr><td>SomnoFlo Starter Kit per Topi</td><td>Kent Scientific</td><td>SF-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Perni in acciaio inossidabile</td><td>Minuteen Science Strumenti</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio steREO Discovery.V12</td><td>Carl Zeiss Microscopia</td><td>495015-9880-010</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomero siliconico</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>tappetino in silicone</td></tr><tr><td>Acido Tannico</td><td>Microscopia Elettronica</td><td>Scienze 21700</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarbobidrazide (TCH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88535</td><td></td></tr><tr><td>Scienze della microscopia elettronica dell'acetato di uranile</td><td></td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>Micro forbici a molla Vannas</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinza per medicazione per occhi Von Graefe, 2,75", curva, seghettata</td><td>Integra Miltex</td><td>18-818</td><td>Servono 2 paia.</td></tr><tr><td>Wagner Forbici</td><td>Fine Science Tools</td><td>14068-12</td><td></td></tr><tr><td>Wahl MiniFigura Animal Trimmer</td><td>Braintree Scientific</td><td>CLP-9868</td><td></td></tr><tr><td>Zen Lite Software</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>410135-1001-000</td><td></td></tr></tbody></table>

emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

Quantificazione degli effetti dei farmaci sul tempo di sanguinamento della ferita da puntura I tempi di sanguinamento della ferita da puntura forniscono un modello fisiologico di un rischio farmacologico che può essere facilmente eseguito nei topi. I risultati che derivano da un esperimento su una ferita da puntura sono predittivi. Qui, mostriamo una curva di sanguinamento dose-risposta di dabigatran. Il dabigatran, un inibitore della trombina, è usato come anticoagulante orale ad azione diretta, un cosiddetto DOAC12. Il modello della ferita da puntura della vena giugulare è stato utilizzato per valutare il rischio inerente a diverse dosi di dabigatran attraverso un potenziale sanguinamento prolungato attraverso la formazione ritardata di trombi nei topi. Un dosaggio variabile di 15, 50 o 150 μg/kg di dabigatran è stato somministrato per via endovenosa (e.v.) 20 minuti prima della puntura della vena giugulare. Mostriamo la media del tempo di sanguinamento a varie concentrazioni di dabigatran (Figura 4). A livello di dose, si osserva un prolungamento significativo del tempo di sanguinamento, p &lt;0,051. Ciò indica un fattore di rischio significativo nell'uso del farmaco nell'uomo. Sperimentalmente, il farmaco a queste dosi ha un effetto significativo sull'ultrastruttura del trombo in formazione.
Valutazione dello stato di attivazione piastrinica in un trombo della ferita da puntura in formazione L'approccio WA-TEM fornisce sia una panoramica di un'area della ferita su un singolo piano se osservata a un ingrandimento inferiore, sia molti dettagli a un ingrandimento più elevato (Figura 5). I dettagli ottenuti possono essere inseriti direttamente nel contesto della panoramica. Abbiamo utilizzato questo approccio per valutare il reclutamento di piastrine di forma discoidale in un trombo della ferita da puntura in formazione. Le piastrine circolanti sono discoidi, da cui il nome, e contengono una serie completa di granuli secretori. Una domanda chiave è stata come le piastrine circolanti possono essere reclutate nel trombo in crescita senza disturbare le proprietà di flusso libero delle piastrine rimanenti. Il nostro lavoro punta a un'ipotesi di Tether and Activate in cui le piastrine circolanti vengono reclutate nel trombo, una per una, attraverso un processo di legatura come piastrine discoidi contenenti un set completo di organelli2. La prova di ciò proviene dal WA-TEM dei trombi della vena giugulare 1 minuto dopo la puntura. Dopo il sezionamento per ottenere fette di trombo complete dal centro della ferita ancora sanguinante, abbiamo ripreso 500-800 fotogrammi, 4.000 per 4.000 pixel, 3,185 nm di dimensione pixel in una griglia raster XY rettangolare attraverso l'intera dimensione del trombo in sezione trasversale utilizzando un tavolino automatizzato e un microscopio elettronico a trasmissione utilizzando il software SerialEM10. I fotogrammi sono stati poi cuciti insieme utilizzando il software eTomo, parte della suite di programmi IMOD11. Ciò si traduce in una singola immagine di dimensioni variabili, ad esempio 120.000 pixel per 90.000 pixel a schermo intero con zoom basso, 0,02, o a dettagli con zoom più alto, da 0,25 a 1,0 utilizzando il software 3DMOD, anch'esso parte della suite di programmi IMOD (Figura 5). In net, l'analisi guidata dal software ha rilevato che le piastrine discoidali associate al trombo legate perifericamente all'interno del foro di puntura erano distanziate come perline su una corda. A breve distanza all'interno del trombo, la forma discoidale era meno distinta e le piastrine erano più strettamente associate l'una all'altra. All'interno del trombo, le piastrine erano arrotondate, strettamente impacchettate e parzialmente degranulate. Una sequenza di morfologia suggeriva il legame iniziale delle piastrine al trombo attraverso una lunga molecola di legame, probabilmente il fattore di von Willebrand, e che qualsiasi ulteriore fase di attivazione piastrinica fosse limitata all'interno del trombo in formazione. Quindi, il reclutamento piastrinico nel trombo potrebbe avvenire senza disturbare la circolazione del sangue all'interno della vena giugulare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig01.jpg"> Figura 1: Impostazione chirurgica per eseguire un esperimento di trombo della ferita da puntura della vena giugulare/arteria femorale. Le attrezzature chirurgiche (A) e gli strumenti (B) sono disposti con cura per garantire l'efficienza del movimento, poiché il tempismo è fondamentale durante l'esperimento. (C) Dopo la fissazione per perfusione, la parte del vaso contenente il trombo della ferita da puntura viene fissata a un tappetino di silicone in un piatto di coltura da 35 mm durante la visualizzazione al microscopio ottico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig02.jpg"> Figura 2: Passaggio da un vaso sanguigno a campioni di plastica incorporati che verranno sezionati per WA-TEM o SBF-SEM. (A) Viene mostrata un'arteria femorale con una ferita da puntura e l'accumulo di formazione di trombi extravascolari (cerchio e freccia). (B) Un trombo (cerchio e freccia) è incorporato nella plastica per il sezionamento per WA-TEM con un microtomo per il successivo imaging 2D. (C) Un trombo (cerchio e freccia) è incorporato nella plastica, tagliato per fornire un bastoncino corto, inferiore a 1 mm, per il fissaggio a un perno all'interno di una camera di imaging SBF-SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig03.jpg"> Figura 3: Ferita da puntura alla formazione di trombi: uno schema del flusso preparativo da una ferita da puntura (A) a una fetta di immagine di un trombo della vena giugulare post-puntura di 1 minuto (B). La parete del vaso è etichettata in blu sulla fetta dell'immagine, i piccoli punti neri vicino alla parete del vaso sono globuli rossi e gli aggregati piastrinici del trombo appaiono come aree grigio scuro. Questa cifra è stata modificata da1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig04.jpg"> Figura 4: Un esempio di dati, in forma grafica, generati in un esperimento di puntura della vena giugulare. Viene mostrata una curva di sanguinamento dose-risposta di dabigatran. Questa cifra è stata modificata da1. Le medie del tempo di sanguinamento a varie concentrazioni di dabigatran sono mostrate insieme a barre di errore che indicano più o meno la deviazione standard. L'analisi statistica con il test t dello studente ha indicato un valore p di &lt;0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66479/66479fig05.jpg"> Figura 5: Immagini WA-TEM di una fetta cucita insieme per formare un montaggio. (A) I singoli fotogrammi ad alta risoluzione vengono raccolti e poi uniti insieme allo scopo di collocare le caratteristiche in un contesto più ampio. (B) Ingrandendo, è possibile far emergere dettagli importanti nel contesto (poli: leucocita polimorfonucleato, endotelio, e col: fibre di collagene). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66479/66479fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

Hemostasis, the process of normal physiological control of vascular damage, is fundamental to human life. We all suffer minor cuts and puncture wounds ...

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Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con microscopia elettronica a trasmissione.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Cryo Electron Microscopi, sia a scansione (SEM) o trasmissione (TEM), sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione di campioni biologici o di altri materiali con un elevato contenuto di acqua 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) viene utilizzato per identificare le caratteristiche di interesse in campioni ed estrarre una lamella sottile elettrone-trasparente per il trasferimento ad un crio-TEM.

Cryo-microscopia elettronica Preparazione del campione per mezzo di un Focused Ion Beam

L'obiettivo di questo protocollo è quello di costruire un equivalente tridimensionale a tutto spessore della pelle, che assomiglia alla pelle naturale. Con un dispositivo di ferimento automatizzato appositamente costruito, è possibile generare ferite precise e riproducibili in caso di mantenimento della sterilità.

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

Qui viene mostrato un metodo per visualizzare l'ultrastruttura della matrice extracellulare in tessuti cardiaci decellularizzati.

Scanning Electron Microscopy di tessuto macerato di visualizzare la matrice extracellulare

Metodi per la preparazione di volumi di campione dimensioni nanolitro per microscopia elettronica di trasmissione e uno strumento è presentato. Non macchiare di carta sono necessari passaggi, evitando così le conseguenze pregiudizievoli, che questo può avere per le proteine, significativamente riducendo la perdita del campione e consentendo l'analisi della singola cella lysata per proteomica di visual.

Preparazione del campione miniaturizzati per microscopia elettronica di trasmissione

Qui presentiamo un protocollo per la combinazione di due tecniche di elaborazione del campione, ad alta pressione congelamento e trattamento dei campioni assistita da microonde, seguita da minima resina incorporamento per l'acquisizione di dati con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Questo è dimostrato utilizzando un mouse del nervo tibial campione e Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

Qui, forniamo una descrizione dettagliata della procedura per indurre biopsie di pizzico guidate dal colonscopico nei topi e tracciare la chiusura delle ferite in tempo reale. Inoltre, vengono forniti metodi per la preparazione di tessuti per analisi istologiche, immunoistochimiche e molecolari del letto della ferita.

Esecuzione di biopsie di avvicinamento delle dita guidate dal colonscopico nei topi e valutazione dei successivi cambiamenti tissutali

Questo protocollo descrive come generare ferite escisionali bilaterali a pieno spessore nei topi e come monitorare, raccogliere e preparare successivamente le ferite per l'analisi morfometrica. È inclusa una descrizione approfondita di come utilizzare sezioni istologiche seriali per definire, quantificare e rilevare con precisione i difetti morfometrici.

Modello di guarigione delle ferite escisionali murine e analisi istologica delle ferite morfometriche

Qui presentiamo un protocollo per analizzare l'ultrastruttura dei megacariociti in situ utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM). I midolli ossei murini vengono raccolti, fissati, incorporati in resina epossidica e tagliati in sezioni ultrassteste. Dopo la colorazione di contrasto, il midollo osseo viene osservato al microscopio TEM a 120 kV.

Sul posto Esplorazione della megacariopoiesi murina usando la microscopia elettronica a trasmissione

Il presente protocollo descrive come utilizzare una lesione mediata da FeCl3 per indurre trombosi arteriosa e come raccogliere e preparare campioni di lesioni arteriose nelle varie fasi della trombosi per l'analisi al microscopio elettronico.

Trombosi arteriosa indotta da cloruro ferrico e raccolta di campioni per l'analisi al microscopio elettronico 3D

Impara la procedura di ferita da puntura per studiare la formazione del trombo emostatico nei modelli murini. Questo metodo utilizza la microscopia elettronica a volume per analizzare la struttura trombocitaria e migliorare le strategie terapeutiche.

Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata

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