Emostasi della ferita da puntura e preparazione di campioni per l'analisi al microscopio elettronico ad ampia area montata
24 maggio 2024
Qui viene presentata una procedura di puntura per la formazione di trombi emostatici. I trombi formati sono grandi e hanno un diametro di centinaia di micron. Pertanto, gli approcci di imaging volumetrico sono appropriati. Suggeriamo la microscopia elettronica a trasmissione ad ampia area montata come approccio ad alta risoluzione disponibile per molti e dettagliamo un protocollo preparativo.
Siamo un laboratorio che fa EM di volume, lavori strutturali, per dire come si attivano le piastrine, come si aggregano? Come formano un trombo che provoca la cessazione dell'emorragia e come, in caso di sovrastimolazione, provocano la coagulazione occlusiva. Nel fare questo, la premessa è che se conosciamo la struttura, possiamo quindi indirizzare meglio i farmaci e ottenere risultati migliori.
Usiamo modelli murini nella nostra ricerca, come fanno molti ricercatori, e tutti noi abbiamo la sfida di stabilire come le nostre scoperte nei topi e, nel nostro caso, nelle arterie e nelle vene dei topi, si trasferiscono ai meccanismi nelle arterie e nelle vene molto più grandi negli esseri umani. Speriamo tutti che i principi siano gli stessi nei topi e negli esseri umani. Se si prende il nostro lavoro e si utilizzano gli approcci EM di volume, le cose più importanti che abbiamo contribuito sono una, dire che le piastrine non sono solo attentatori suicidi.
Trattengono i granuli. Fanno le cose in risposta alla segnalazione. Hanno stati stabili, e questi stati stabili fanno parte di un trombo normale e fanno anche parte di un coagulo inclusivo.
Due, abbiamo dato la sensazione che ci sia davvero una struttura nel trombo che si forma, non è semplicemente un mucchio di mattoni, ma piuttosto è una struttura ordinata in cui le piastrine sono ordinate rispetto alla loro attivazione, eccetera. E tre, abbiamo portato il senso che si dovrebbe essere in grado di applicare e capire dalla struttura ciò che deve essere stimolato per ottenere un buon risultato o ciò che deve essere soppresso per dare un risultato che proteggerà le persone da cattivi risultati. Raccogliamo immagini sequenziali su scala quasi nanometrica di distanze quasi millimetriche.
Li assembliamo in un'unica immagine montata. Quindi, possiamo osservare qualsiasi punto all'interno dell'immagine in una scala da quasi nanometri a quasi millimetri, che è sufficiente per posizionare le singole caratteristiche all'interno dell'intero trombo. I ricercatori hanno ora uno strumento potente e possono porsi la nuova domanda: in che modo le cascate della coagulazione e i segnali cellulari o i farmaci agiscono spazialmente a livello locale e globale nei trombi?
Panoramica
In questo articolo viene presentata una procedura di ferita da punta per lo studio della formazione di trombi emostatici, con particolare attenzione ai grandi trombi formati durante questo processo. Si propone l'utilizzo della microscopia elettronica a trasmissione con immagini montate su vasta area come approccio ad alta risoluzione per analizzare queste strutture.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Emostasi
- Formazione del trombo
Sfondo
- Comprendere l'attivazione e l'aggregazione delle piastrine è fondamentale per affrontare l'arresto dell'emorragia.
- La ricerca mira a colmare il divario tra i risultati ottenuti nei modelli murini e i meccanismi vascolari umani.
- È noto che le piastrine conservano granuli, contraddicendo le precedenti nozioni sulla loro funzione.
- Le approcci di microscopia elettronica volumetrica forniscono informazioni sulla struttura del trombo.
Scopo dello studio
- Studiare gli aspetti strutturali della formazione del trombo.
- Migliorare il targeting farmacologico per ottenere risultati clinici migliori.
- Esplorare le somiglianze tra le risposte vascolari del topo e dell'uomo.
Metodi Utilizzati
- Procedura di ferita da punta per la formazione del trombo.
- Microscopia elettronica a volumi per l'immagine dei trombi.
- Modelli murini per lo studio del comportamento delle piastrine.
- Analisi comparativa dei risultati nei topi e negli esseri umani.
Risultati principali
- I trombi formati sono di grandi dimensioni, con un diametro di centinaia di micron.
- I piastrini conservano i granuli, indicando un ruolo più complesso nell'emostasi.
- L'EM a volume fornisce informazioni strutturali dettagliate sulla formazione del trombo.
- I risultati sostengono l'ipotesi che i modelli murini possano fornire indicazioni sui meccanismi vascolari umani.
Conclusioni
- Lo studio migliora la comprensione della struttura del trombo e della funzione piastrinica.
- La microscopia elettronica in volume è uno strumento prezioso per l'imaging ad alta risoluzione nella ricerca emostatica.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per confermare i risultati nei sistemi umani.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale
La microscopia elettronica montata su ampia area di trombi derivati da ferite da punzione permette una risoluzione strutturale senza precedenti dei processi emostatici, supportando la riduzione del rischio meccanicistica nella validazione precoce di bersagli cardiovascolari. Questo approccio colma il divario tra i risultati ottenuti nei modelli animali e la biologia vascolare umana, fornendo indicazioni per strategie traslazionali nella scoperta di farmaci antitrombotici. La mappatura ad alta risoluzione dell'architettura del trombo migliora la fiducia predittiva nella modulazione del bersaglio e nella valutazione degli esiti funzionali lungo l'intero percorso di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- La mappatura strutturale dei trombi chiarisce gli stati di attivazione delle piastrine e l'organizzazione spaziale.
- La microscopia elettronica in volume permette la riduzione del rischio meccanicistico distinguendo l'emostasi dalla trombosi patologica.
- L'imaging quantitativo supporta la validazione funzionale degli obiettivi e la priorizzazione dei candidati antitrombotici.
Sviluppo di screening e saggi
- Protocolli validati di preparazione del campione garantiscono risultati di imaging riproducibili per analisi successive.
- I dataset di microscopia elettronica montati forniscono letture quantitative standardizzate per studi comparativi.
- L'imaging ad alta risoluzione facilita una valutazione affidabile degli effetti dei composti sulla struttura del trombo.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- I risultati ottenuti nel modello murino informano la continuità traslazionale allineando i biomarcatori strutturali con i meccanismi vascolari umani.
- L'imaging ad alta risoluzione spaziale supporta il progresso mirato ai candidati che agiscono sulla funzione piastrinica, corretto per il rischio.
- Dati strutturali quantitativi permettono il confronto interspecie per la validazione preclinica.
Integrazione della Pipeline e del Flusso di Lavoro
Questo metodo integra le fasi iniziali della scoperta fino alla ricerca preclinica, supportando la verifica delle ipotesi, la validazione dei bersagli e l'allineamento traslazionale nello sviluppo di farmaci cardiovascolari.
- Biologia della scoperta: Consente l'analisi basata su ipotesi della funzione piastrinica e dell'architettura del trombo.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per la valutazione di composti.
- Analisi: Produce set di dati strutturali ad alto contenuto informativo per confronti statistici robusti tra condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Favorisce l'allineamento dei biomarcatori e la continuità dai modelli murini alla rilevanza umana.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di imaging scalabile per un uso ripetuto in diversi programmi di ricerca cardiovascolare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella scoperta mirata ai trombi.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di preparazione dei campioni e di acquisizione delle immagini per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti e migliora l'efficienza del capitale chiarificando precocemente i rischi biologici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione degli obiettivi e dei candidati antitrombotici adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia elettronica e biologia vascolare.
- Richiede l'accesso a strumentazione avanzata per l'imaging e a software in grado di eseguire montaggi.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione interdisciplinare dei protocolli di preparazione dei campioni.
- Potrebbe essere necessaria un'adattamento per diversi modelli vascolari o specie.
- La capacità di elaborazione dei campioni e la gestione dei dati potrebbero limitare la scalabilità per studi di grandi dimensioni.
