Name: Modelli di ferite murine e preparazione di sospensioni a cellula singola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T12:55:00.000+00:00
Duration: 4 min 3 s
Description: Impara a creare modelli di ferite murine e preparare sospensioni a cellula singola dalla pelle di topo. Questo metodo consente di studiare la guarigione delle ferite e analizzare la vitalità cellulare in vivo.

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Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (#82373494).

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Etico del settimo Centro Medico dell'Ospedale Generale del PLA Cinese, Cina. Sono stati utilizzati topi maschi C57/BL6 di 6 settimane. 
1. Modello di guarigione delle ferite nel topo
<ol>
	<li>Raggruppamento di animali
	<ol>
		<li>Assegna in modo casuale i topi ai gruppi sperimentali e di controllo (6 ciascuno). Domestico i topi in una struttura per animali specifica priva di agenti patogeni (SPF), con una temperatura mantenuta a 23-25 °C, umidità al 50%-60% e un ciclo luce-buio di 12 ore.</li>
		<li>Fornisci ai topi un accesso illimitato al cibo standard e all'acqua del rubinetto sterilizzata in autoclave.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Preparazione preoperatoria
	<ol>
		<li>Trattenere delicatamente il mouse utilizzando un sistema di ritenuta o tenendolo saldamente in posizione prona. Caricare la siringa con pentobarbital sodico all'1% riportato a temperatura ambiente, somministrato alla dose di 0,1 ml/20 g di peso corporeo. 
		NOTA: La soluzione di pentobarbital sodico all'1% deve essere conservata in un ambiente buio a 4 °C.</li>
		<li>Pulisci l'addome del topo con tamponi di cotone imbevuti di alcol. Inserire la siringa con una leggera angolazione nell'addome. Aspirare prima dell'iniezione per evitare la somministrazione involontaria nella vescica o nell'intestino. Attendere 10 minuti.</li>
		<li>Dopo che il topo ha smesso di contrarsi e non risponde più agli stimoli, applicare il petrolato bianco su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza. Usa un rasoio per tagliare il pelo dorsale più lungo.</li>
		<li>Applicare la crema depilatoria sulla schiena, attendere 2 minuti e strofinare delicatamente con una garza umida per evitare di danneggiare la pelle del topo. Assicurarsi che la crema depilatoria non venga lasciata in posa per un periodo prolungato.</li>
		<li>Disinfettare delicatamente la pelle circostante con tre tamponi alternati di betadina e alcol al 70%.</li>
		<li>Punzone per biopsia cutanea in autoclave, forbici, pinze e altri strumenti per la sterilizzazione. Mantenere uno spazio di lavoro sterile. Eseguire l'intervento chirurgico successivo su un panno chirurgico fresco.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Escissione cutanea a tutto spessore 
	NOTA: Il modello della stecca della ferita è stato utilizzato per valutare l'efficacia del trattamento per la guarigione delle ferite.
	<ol>
		<li>Usando un pennarello indelebile, segna l'area centrale superiore della regione dorsale del topo con un cerchio di 8 mm di diametro.</li>
		<li>Sollevare la pelle dorsale con una pinza pulita ed eseguire il primo taglio con le forbici chirurgiche sottili. Dopo il primo taglio, afferrare l'area cutanea parzialmente rimossa con una pinza e ritagliare con cura i cerchi contrassegnati.</li>
		<li>Utilizzare un anello in acciaio inossidabile progettato su misura (diametro interno 15 mm, diametro esterno 18 mm). Sutura l'anello metallico alla periferia del sito di incisione con 5-0 suture non assorbibili, prevenendo la contrazione della pelle del sito di incisione (Figura 1A). Utilizzare l'acciaio inossidabile come materiale dell'anello per evitare ruggine e deformazioni.</li>
		<li>Somministrare una singola iniezione sottocutanea da 0,1 ml di diluizione di buprenorfina cloridrato al 10% vicino alla ferita per trattare il dolore post-chirurgico.</li>
		<li>Reintrodurre il mouse per pulire le singole gabbie. Posizionare il mouse in posizione prona. Non lasciare il mouse incustodito prima che il topo riprenda conoscenza.</li>
		<li>Osservare e fotografare la ferita del topo ogni 2 giorni per misurare le dimensioni della ferita dopo l'anestesia come descritto al punto 1.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Marcatura del timbro della ferita per ottenere il tessuto bioptico
	<ol>
		<li>Prepararsi per l'esperimento come descritto nei passaggi 1.1 e 1.2.</li>
		<li>Crea timbri personalizzati per la marcatura delle avvolte del mouse con un diametro del cerchio di 8 mm e una lunghezza del lato quadrato di 10 mm (Figura 1B).</li>
		<li>Posizionare il mouse in una postura prona e disinfettare la pelle dorsale con tamponi di cotone imbevuti di alcol. Immergi il timbro nell'inchiostro. Fai un segno sulla parte centrale superiore della parte posteriore del mouse con il timbro.</li>
		<li>Asportare con cura l'intero strato cutaneo della schiena lungo il segno circolare utilizzando le forbici chirurgiche, esponendo completamente lo strato muscolare. Lasciare la ferita aperta senza medicazione per evitare di interferire con lo stato della ferita. Mantenere la sterilità della ferita posizionando il topo in un ambiente pulito e disinfettato e lasciando che la ferita formi naturalmente una crosta.</li>
		<li>Somministrare una singola iniezione sottocutanea da 0,1 ml di diluizione di buprenorfina cloridrato al 10% vicino alla ferita per trattare il dolore post-chirurgico.</li>
		<li>Reintrodurre il mouse per pulire le singole gabbie. Posizionare il mouse in posizione prona. Non lasciare il mouse incustodito prima che il topo riprenda conoscenza.</li>
		<li>Osservare e fotografare la ferita del topo ogni 2 giorni per misurare le dimensioni della ferita dopo l'anestesia come descritto al punto 1.2.</li>
		<li>Eseguire la somministrazione del trattamento come descritto al punto 1.4</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Somministrazione del trattamento
	<ol>
		<li>A 4 ore dalla ripresa di conoscenza del topo, eseguire l'anestesia come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.3.</li>
		<li>Iniettare per via sottocutanea il trattamento desiderato, qui 100 μg di esosoma derivato da cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale umano (hucMSC-Exo) disciolto in 200 μL di PBS attorno al sito di incisione per il gruppo di trattamento.</li>
		<li>Iniettare per via sottocutanea 200 μL di PBS intorno al sito di incisione per il gruppo di controllo.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.5.2 e 1.5.3 ogni due giorni per un massimo di 14 giorni. Ispezionare il sito di iniezione per eventuali gonfiori, arrossamenti o segni di infezione.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Preparazione per il sequenziamento dell'RNA a singola cellula
<ol>
	<li>Raccolta e preparazione dei tessuti
	<ol>
		<li>Eseguire l'anestesia come descritto nei passaggi 1.2.2-1.2.3.</li>
		<li>Sollevare la pelle dorsale con una pinza pulita e rimuovere le croste. Tagliare circa 2 cm2 di pelle vicino alla ferita, tagliando il tessuto adiposo e i grandi vasi sanguigni.</li>
		<li>Trasferire la biopsia cutanea con pinza sterile in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti riempita con 4 mL di PBS pre-raffreddati.</li>
		<li>Lavare con PBS trasferendo in sequenza la biopsia in nuovi pozzetti (piastra a 6 pozzetti) riempiti con 4 mL di PBS fino a quando non è presente sangue visibile.</li>
		<li>Tagliare la pelle con un bisturi in pezzi di circa 2 mm, lavando ulteriormente in DPBS contenente lo 0,04% di BSA e rimuovendo eventuali detriti.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dissociazione enzimatica (Figura 2)
	<ol>
		<li>Combinare 1 mL di Collagenasi I (10 mg/mL), 1 mL di Collagenasi IV (5 mg/mL), 1 mL di Collagenasi D + Dispasi II (15 mg/mL), 1 mL di DNasi I (5 mg/mL) e 6 mL di DPBS in una provetta conica sterile per preparare la soluzione digestiva. Mescolare accuratamente i componenti per garantire l'omogeneità.</li>
		<li>Mettere il tubo conico in un bagnomaria a 37 °C per 10 minuti per preriscaldare la soluzione digestiva.</li>
		<li>Aggiungere 2,5 ml di soluzione digestiva al tessuto e digerire a 37 °C per 70 minuti, girando la provetta ogni 10 minuti per una miscelazione accurata.</li>
		<li>Pre-bagnare un filtro da 70 μm con tampone di lavaggio (0,2% BSA in PBS). Trasferire la miscela di reazione, comprese le cellule dissociate e i frammenti di tessuto residui, utilizzando un puntale per pipetta a foro largo da 1 ml sul filtro.</li>
		<li>Filtrare questa miscela attraverso il filtro cellulare pre-umido da 70 μm in una provetta da centrifuga da 15 mL.</li>
		<li>Centrifugare la miscela di reazione con il tessuto digerito a 300 x g, temperatura ambiente per 5 minuti. Scartare il surnatante e conservare il pellet (cellule) per la successiva fase di dissociazione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Lisi dei globuli rossi
	<ol>
		<li>Diluire la soluzione di lisi dei globuli rossi (10x) in rapporto 1:10 con acqua bidistillata. Diluire le cellule con 1 soluzione di lisi dei globuli rossi in rapporto 1:10 in una provetta conica.</li>
		<li>Agitare la miscela per 5 s, incubare a temperatura ambiente per 2 minuti e poi centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in DPBS di uguale volume e conservarle in ghiaccio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>filtrazione
	<ol>
		<li>Recuperare la sospensione cellulare e filtrarla attraverso un filtro da 40 μm in un nuovo tubo conico.</li>
		<li>Sciacquare la provetta 2 volte con 4,5 mL di RPMI (10% FCS) per garantire la raccolta di eventuali cellule rimanenti.</li>
		<li>Procedere alla centrifugazione della sospensione cellulare a 300 x g a temperatura ambiente per 5 minuti.</li>
		<li>Scartare il surnatante, muovere delicatamente il pellet e risospendere le cellule con punte a foro largo in 50 μl di BSA PBS allo 0,04%. Mantenere le cellule sul ghiaccio durante questo processo.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rimozione delle cellule morte
	<ol>
		<li>Miscelare il kit per la rimozione delle cellule morte 20x con acqua priva di nucleasi in un rapporto 1:20 per ottenere un tampone di legame 1x.</li>
		<li>Centrifugare il campione a 300 x g, rimuovere il surnatante e aggiungere 10 μl di microsfere per la rimozione delle cellule morte per 60 mg di campione cutaneo.</li>
		<li>Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere il tampone madre fino a raggiungere i 500 μl. Caricare il campione nella colonna preparata nel kit e collegarlo al dissociatore.</li>
		<li>Eseguire il programma dissociatore per separare le cellule vive. Al termine del programma, filtrare la sospensione attraverso un filtro da 30 μm e diluirla con un volume uguale di D-PBS. 
		NOTA: Se la velocità di gocciolamento rallenta notevolmente, sostituire prontamente la colonna per evitare che le impurità ostruiscano i pori e influenzino il recupero cellulare.</li>
		<li>Eseguire la colorazione con arancio acridino/ioduro di propidio (AO/PI) e il conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Utilizzare i seguenti criteri di accettazione: vitalità cellulare ≥ 85%, tasso di aggregazione cellulare < 20% e nessun globulo rosso visibile o frammenti di cellule.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Procedura di dissociazione per il kit di dissociazione multitessuto (Alternativa)
	<ol>
		<li>Miscelare 2,5 mL di RPMI 1640, 100 μL di enzima D, 50 μL di enzima R e 12,5 μL di enzima A1 in una provetta delicata MACS C (componenti del Multi Tissue Dissociation Kit).</li>
		<li>Trasferire il fazzoletto nella delicata provetta MACS C contenente la miscela enzimatica e chiuderla ermeticamente.</li>
		<li>Posizionare la provetta a 37 °C in un bagno d'acqua per 90 minuti con una leggera inversione ogni 10 minuti per garantire un'adeguata esposizione dei tessuti alla soluzione di dissociazione.</li>
		<li>Scartare la soluzione di dissociazione e lavare i fazzoletti con DPBS.</li>
		<li>Far passare in sequenza le sospensioni a singola cella attraverso filtri cellulari da 70 μm e 40 μm e centrifugare a 4 °C per 10 minuti a 300 x g.</li>
		<li>Lisi i globuli rossi utilizzando il reagente di lisi dei globuli rossi seguendo la stessa procedura descritta al punto 2.3.</li>
		<li>Rimuovere le celle morte utilizzando il kit di rimozione delle celle morte seguendo la stessa procedura del passaggio 2.58.</li>
		<li>Eseguite la colorazione AO/PI e il conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato. Utilizzare i seguenti criteri di accettazione: vitalità cellulare ≥ 85%, tasso di aggregazione cellulare < 20% e nessun globulo rosso visibile o frammenti di cellule.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Optimized Protocol for Mouse Wound Healing Model with Stem Cell-Derived Exosomes

<ol><li>Zomer, H. D., Trentin, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+wound+healing+in+humans+and+mice%3A+Challenges+in+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dermatol+Sci%22%5BJournal%5D)">Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research.</a> J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).</li>
<li>Wu, J., Landén, N. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+skin+wound+healing+using+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigation of skin wound healing using a mouse model.</a> Meth Mol Biol. 2154, 239-247 (2020).</li>
<li>Reinke, J. M., Sorg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Wound repair and regeneration.</a> Eur Surg Res. 49 (1), 35-43 (2012).</li>
<li>Dunn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of wound healing.</a> J Vis Exp. (75), e50265(2013).</li>
<li>Ganguli-Indra, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+cutaneous+wound+healing+assay+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocol for cutaneous wound healing assay in a murine model.</a> Meth Mol Biol. 1210, 151-159 (2014).</li>
<li>Burja, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+tissue+dissociation+protocol+for+single-cell+rna+sequencing+analysis+of+fresh+and+cultured+human+skin+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 872688(2022).</li>
<li>Levenberg, S., Ferreira, L. S., Chen-Konak, L., Kraehenbuehl, T. P., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+differentiation+and+characterization+of+vascular+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, differentiation and characterization of vascular cells derived from human embryonic stem cells.</a> Nat Protoc. 5 (6), 1115-1126 (2010).</li>
<li>Dead cell removal kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline">https://static.miltenyibiotec.com/asset/150655405641/document_9ndq9pouph0pvf6lmr5osgv41s?content-disposition=inline</a> (2015).</li>
<li>Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., Dipietro, L. A., Koh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+murine+excisional+wound+model%3A+Contraction+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">The murine excisional wound model: Contraction revisited.</a> Wound Repair Regen. 23 (6), 874-877 (2015).</li>
<li>Rowland, M. B., Moore, P. E., Bui, C., Correll, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+wound+closure+in+mice+using+skin-punch+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Assessing wound closure in mice using skin-punch biopsy.</a> STAR Protoc. 4 (1), 101989(2023).</li>
<li>Gao, C., Zhang, M., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comparison+of+two+single-cell+sequencing+platforms%3A+Bd+rhapsody+and+10x+genomics+chromium%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">The comparison of two single-cell sequencing platforms: Bd rhapsody and 10x genomics chromium.</a> Curr Genomics. 21 (8), 602-609 (2020).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+rna-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Diversi passaggi cruciali sono stati essenziali per il successo del protocollo. Questi passaggi includevano una preparazione precisa dell'area della ferita mediante rasatura e pulizia accurata, la creazione di ferite standardizzate di dimensioni e profondità specifiche e una diligente cura post-ferita per monitorare le infezioni e somministrare trattamenti appropriati. La standardizzazione di queste procedure ha garantito la coerenza tra le condizioni sperimentali, migliorando così l'affidabilità e la riproducibilità dei risultati10.
Abbiamo utilizzato la marcatura del timbro della ferita per il sequenziamento, poiché altri metodi introducono variabili aggiuntive come il graffio della ferita del topo e la lacerazione della sutura 2,5. Il modello a timbro migliora la consistenza iniziale delle ferite nei topi e fornisce un punto di riferimento standardizzato per la valutazione della guarigione delle ferite, riducendo le potenziali imprecisioni nella stima del tasso di guarigione delle ferite nei modelli murini. Inoltre, il timbro facilita l'uso di software come ImageJ. Tuttavia, poiché non viene utilizzata una medicazione per coprire la ferita, il metodo di stampaggio ha requisiti di disinfezione molto più elevati per l'ambiente. L'esperimento dovrà essere ripetuto se si verifica un'infezione.
La variabilità biologica tra i singoli topi può introdurre variabilità nei risultati sperimentali, richiedendo campioni di dimensioni maggiori per solide analisi statistiche. Questo modello può essere esteso ad altre tecniche di sequenziamento, come il sequenziamento spaziale, per migliorarne ulteriormente l'utilità.
L'ottimizzazione delle condizioni per la dissociazione scRNA-Seq e la selezione di metodi di dissociazione appropriati sono passaggi critici nel flusso di lavoro sperimentale. Attualmente, le metodologie comunemente utilizzate includono la digestione enzimatica in combinazione con l'approccio raccomandato basato su reagenti genomici10x 11. In particolare, la digestione enzimatica è significativamente più economica rispetto al metodo basato su reagenti; Tuttavia, richiede più iterazioni pre-sperimentali per ottimizzare la selezione degli enzimi e la durata della digestione.
In questo studio, sono stati condotti esperimenti preliminari utilizzando varie combinazioni di enzimi. Il metodo selezionato soddisfaceva i requisiti di base per il controllo di qualità a valle, nonostante la mancanza di un kit di reagenti genomici 10x specificamente progettato per la dissociazione cutanea a tutto spessore del topo. Invece, il kit di dissociazione multi-tessuto 1 è stato utilizzato per ottenere sospensioni unicellulari di alta qualità. Tuttavia, è importante notare il costo relativamente elevato associato a questo metodo, sebbene offra una stabilità superiore rispetto alle tecniche di digestione enzimatica interne. Per campioni di valore, si consiglia l'uso del metodo di dissociazione basato su reagenti genomici 10x.
È fondamentale considerare il potenziale impatto della variabilità interindividuale sulla vitalità cellulare, in quanto ciò potrebbe comportare che alcuni campioni non soddisfino i criteri richiesti e quindi influire sulla qualità dei dati a valle12.
Sul lato positivo, questo metodo offre opportunità di integrazione con la trascrittomica spaziale o altri approcci multi-omici, offrendo così un quadro analitico più completo13. Inoltre, le sue potenziali applicazioni cliniche ne evidenziano la versatilità e la rilevanza al di là dei contesti di ricerca di base.

Il topo è un modello animale ampiamente riconosciuto nella ricerca per la sua sequenza genetica altamente omologa agli esseri umani, la riproduzione rapida, l'economicità e le dimensioni gestibili1. Tuttavia, esistono differenze nella struttura della pelle tra topi e esseri umani. I topi hanno uno strato distinto della membrana cutanea che contribuisce alla contrazione della pelle, svolgendo un ruolo cruciale nella guarigione delle ferite in questa specie. Al contrario, la guarigione delle ferite umane comporta principalmente la riepitelizzazione e la formazione di tessuto di granulazione1.
Nonostante queste differenze interspecie nella struttura della pelle, il modello murino rimane la scelta preferita nella ricerca sulla riparazione delle ferite e mantiene un'importanza significativa rispetto ad altri modelli animali2,3. Quando si utilizza la pelle di topo per imitare i processi di guarigione delle ferite umane, è essenziale considerare attentamente i vari fattori di influenza. Questi fattori includono la selezione di siti appropriati per le procedure chirurgiche, la contabilizzazione del ciclo del follicolo pilifero del topo e la comprensione degli effetti della contrazione della membrana cutanea4,5. L'attuazione di misure corrispondenti è fondamentale per ottimizzare le condizioni sperimentali e migliorare l'accuratezza dei risultati osservativi.
Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) sequenzia le cellule a un livello molto più raffinato rispetto al sequenziamento convenzionale dell'RNA e ha un requisito molto più elevato per la qualità del campione con differenze minime all'interno del gruppo. Sono stati condotti diversi esperimenti per perfezionare un modello stabile di difetto cutaneo acuto a tutto spessore nel topo. Questi esperimenti hanno utilizzato una combinazione di metodi consolidati dalla letteratura e approcci innovativi per valutare la guarigione delle ferite in modo completo2,5. Per sviluppare il modello di guarigione delle ferite, è stata utilizzata l'escissione cutanea a tutto spessore di topo per replicare il processo fisiologico di riparazione e rigenerazione delle ferite. Il suo obiettivo era quello di valutare le potenziali alterazioni indotte da vari trattamenti utilizzando scRNA-seq. La dissociazione del tessuto cutaneo dai topi pone sfide, tra cui una bassa vitalità cellulare e alti tassi di aggregazione, durante la preparazione di sospensioni a singola cellula6. Queste difficoltà possono causare problemi come l'intasamento degli strumenti e la cattura anomala delle celle, che possono compromettere la qualità dei dati. Dato il costo considerevole del sequenziamento di singole cellule, la conduzione di più esperimenti preliminari è fondamentale per garantire la stabilità e l'affidabilità della sospensione a singola cellula. Questo studio ha valutato l'efficacia della dissociazione enzimatica mista e del metodo di dissociazione del kit tissutale per identificare l'approccio ottimale per la dissociazione tissutale6,7. Questo studio stabilisce una solida base per ulteriori indagini approfondite.

<table><tbody><tr><td>75% Alcolchol</td><td>Liuhe</td><td>JIUJING500ML</td><td></td></tr><tr><td>C57 / BL6J topi</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D + Dispase II</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi I</td><td>Roche</td><td>5349907103</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi IV</td><td>Roche</td><td>5267439001</td><td></td></tr><tr><td>Cotton Swabs</td><td>Haishi</td><td>MIANQIAN</td><td></td></tr><tr><td>Kit di rimozione delle cellule morte</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-10</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>dissociatore gentleMAC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>Filo di nylon medico</td><td>Jinlong</td><td>HM507</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dissociazione multitissutale 1</td> punzone <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-201</td><td></td></tr><tr><td> ago per biopsia</td><td>Integra Miltex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>soluzione di lisi dei globuli rossi</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Forbice chirurgica</td><td>Jinglu</td><td>JIANDAO Petrolato</td><td></td></tr><tr><td>bianco</td><td>Shangyuan</td><td>BAIFANSHILIN</td><td></td></tr></tbody></table>

modelli di ferita nel topo e preparazione di sospensioni a cellula singola

Mouse Wound Models and Preparation of Single-Cell Suspensions

La gestione delle lesioni cutanee acute a tutto spessore rappresenta una sfida considerevole nella pratica clinica. La complessità della guarigione delle ferite, che coinvolge diverse popolazioni cellulari e l'intricato microambiente della ferita, complica la valutazione degli effetti del trattamento e delle loro interazioni utilizzando approcci sperimentali tradizionali. La tecnologia di sequenziamento del trascrittoma a singola cellula ha rivoluzionato la comprensione delle funzioni e dei meccanismi cellulari durante la guarigione delle ferite. Tuttavia, la variabilità delle metodologie per la creazione di modelli di ferite murine introduce fattori confondenti che possono influire sui risultati sperimentali. Inoltre, il processo di dissociazione dei tessuti cutanei di topo presenta notevoli ostacoli tecnici, evidenziando la necessità critica di sospensioni di singole cellule di alta qualità per un sequenziamento accurato del trascrittoma. Pertanto, questo studio mira a ottimizzare la costruzione di modelli murini di ferite per valutare accuratamente i cambiamenti nella chiusura della ferita, eliminando le variabili che potrebbero influenzare il successivo risultato del sequenziamento. Inoltre, la preparazione di sospensioni a singola cellula è stata eseguita utilizzando sia protocolli di preparazione enzimatica che protocolli di kit di test per ottimizzare i costi e l'efficacia.

Sono state esplorate diverse varianti della procedura. I protocolli di stampaggio sono stati preferiti poiché comportano un minimo interferenza con il processo di guarigione della ferita e mantengono l'integrità della ferita da influenze come il graffio o i punti di sutura. Questo per evitare l'introduzione di rumore a livello singola-cellula per il successivo sequenziamento. Posizionare le ferite su entrambi i lati di un topo ha comportato differenze evidenti nell'area della ferita a causa dell'elasticità intrinseca della pelle del topo (Figura 3A,B). Le punture bilaterali posizionavano le ferite più vicino ai margini, una regione suscettibile al comportamento di auto-graffio del topo. Topi di età pari o superiore a 7 settimane sono stati considerati non idonei per lo studio, poiché un sottogruppo di essi ha mostrato un'inscurimento irregolare della pelle dorsale intorno al 10o giorno dopo l'intervento chirurgico, indicativo dell'inizio della ricrescita del pelo (Figura 4A). Ciò ha introdotto una variabile aggiuntiva non desiderata.
Quando si utilizzavano anelli di gomma, indipendentemente dal fatto che fosse gomma morbida o dura, questi tendevano a staccarsi e spesso si dislocavano dal sito della ferita entro circa 12 h a causa dei frequenti movimenti dei topi e delle limitate proprietà adesive degli anelli. Gli anelli di gomma fissati con punti di sutura erano soggetti a lacerazioni, richiedendo ripetuti interventi di sutura per la stabilizzazione. Questa procedura iterativa di sutura, a sua volta, provocava ulteriori traumi nei topi (Figura 4B,C). Al contrario, gli anelli metallici hanno dimostrato una stabilità superiore e migliori proprietà di ritenzione, consentendo la valutazione degli effetti di ri-epitelizzazione senza interferenze da parte della contrazione della ferita.
Considerando il potenziale del supporto con anello metallico e sutura di causare danni cutanei aggiuntivi al di fuori dell'area della ferita e di applicare sollecitazioni meccaniche non uniformi sulla ferita, è stato utilizzato un timbro standardizzato di dimensioni fisse per facilitare le analisi successive.
L'indagine ha rivelato che il gruppo sottoposto al trattamento esemplificativo (hucMSC-Exo) ha mostrato un ritmo di guarigione più rapido rispetto al gruppo di controllo (Figura 5A). Sebbene la guarigione completa si sia verificata più rapidamente nel modello con timbro rispetto al gruppo con anello metallico suturato, che limita la contrazione della ferita, non è stata osservata alcuna differenza statisticamente significativa nei tassi di guarigione durante il periodo iniziale di 7 giorni (Figura 5B). Questi risultati sono in linea con ricerche precedenti di Lin et al., che suggeriscono come i primi 10 giorni della riparazione cutanea nei topi coinvolgano principalmente la ri-epitelizzazione piuttosto che la contrazione9.
Confronto della dissociazione 
Dopo un'ampia ottimizzazione della composizione enzimatica, la combinazione di Dispase II e collaghenasi ha dimostrato prestazioni superiori rispetto all'uso di un singolo enzima (Tabella 1). In modo significativo, la presenza di globuli rossi o detriti cellulari è risultata minima, soddisfacendo i criteri essenziali per l'uso in macchina, che includono una vitalità cellulare superiore all'85% e un tasso di aggregazione inferiore al 20%.
Al contrario, l'approccio con kit di prova ha mostrato risultati promettenti, con una viabilità cellulare relativamente più elevata e una minore percentuale di aggregazione cellulare (Tabella 1). Inoltre, non sono stati osservati globuli rossi né frammenti cellulari, indicando una qualità cellulare complessivamente superiore rispetto ad altri metodi.
<img alt="Dispositivo chirurgico sulla pelle dell'animale; diagramma dell'incisione circolare; ferita con misurazione tramite righello." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Modello finale di ferita nel topo. (A) Immagine rappresentativa dell'anello metallico personalizzato suturato. (B) Immagine rappresentativa del timbro cutaneo e della ferita escissa. Diametro: 8 mm. Margine: 1 cm. (C) Tasso di chiusura della ferita. Barre d'errore: errore standard. Test T a due code (n=6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig01large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Processo di preparazione delle cellule: preparazione del campione, dissociazione, lisi dei globuli rossi, rimozione delle cellule morte, sospensioni cellulari singole." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Schema della preparazione di sospensioni cellulari singole. I passaggi includono il prelievo del campione, la dissociazione, la lisi dei globuli rossi, la rimozione delle cellule morte e la preparazione della sospensione cellulare singola. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig02large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Esperimento di guarigione delle ferite nei ratti; immagini della linea temporale, giorno 1 e 6 post-operatorio; righello di misurazione." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Modello murino di ferita con lesioni su entrambi i lati. (A) Viene mostrata un'immagine rappresentativa del modello murino di ferita con lesioni su entrambi i lati. Diametro di riferimento rotondo bianco: 8 mm. (B) Immagine rappresentativa della guarigione delle ferite in diversi momenti temporali per le lesioni su entrambi i lati. La cute sul dorso del topo vicino alla coda guarisce più rapidamente rispetto a quella vicina al collo. Lato dell'oggetto di riferimento quadrato bianco: 1 cm. Diametro dell'oggetto di riferimento rotondo bianco: 8 mm. Abbreviazioni: POD = giorni post-operatori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig03large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Diagramma dell'esperimento di guarigione delle ferite con misurazione, dal giorno postoperatorio 1 al giorno postoperatorio 10, studio su incisione cutanea nel ratto." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Modello murino di ferita con ferite singole. (A) Immagine rappresentativa della guarigione delle ferite in diverse fasi della crescita del pelo in topi di 7 settimane. I topi si trovano in diverse fasi della crescita del pelo al giorno postoperatorio 10. La pelle più scura guarisce più rapidamente. (B) Immagine rappresentativa di anelli adesivi in gomma. Lato dell'oggetto di riferimento quadrato bianco: 1 cm. (C) Immagine rappresentativa delle linee di sutura. Diametro dell'oggetto di riferimento rotondo bianco: 8 mm. Abbreviazioni: POD = Giorni postoperatori. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig04large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Tasso di chiusura della ferita nel tempo; grafici a barre sperimentali che confrontano l'efficacia del trattamento; analisi statistica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66499/66499fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
Figura 5: Tasso di chiusura della ferita. (A) Confronto tra i gruppi controllo ed hucMSC-Exo. Le barre di errore rappresentano gli errori standard. Test T a due code (n=6). (B) Confronto tra i gruppi stampa e anello metallico. Le barre di errore rappresentano gli errori standard. L'analisi di significatività è stata effettuata mediante test t a due code (n=6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66499/66499fig05large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Tasso di vitalità cellulare</td>
			<td>Tasso di aggregazione cellulare</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Approccio interno</td>
			<td>86,90%</td>
			<td>18,50%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Approccio con kit di prova</td>
			<td>90,65%</td>
			<td>13,73%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabella 1: Viabilità e tasso di aggregazione dei due approcci di preparazione delle cellule.

Questo studio presenta due tecniche sperimentali cruciali: la costruzione di un modello di ferita murina per valutare la chiusura della ferita e la preparazione di sospensioni unicellulari dalla pelle murina per preservare la vitalità cellulare.

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