Name: Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Scopri un saggio di mobilizzazione del calcio ottimizzato per caratterizzare i modulatori dei recettori attivati dalla proteasi nelle cellule endoteliali. Questo metodo riduce i tempi di analisi e migliora la riproducibilità per studiare potenziali farmaci.

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<meta charset="utf8"></head><body>Studio dei ligandi del recettore attivati dalla proteasi nelle cellule endoteliali

<table><tbody><tr><td>Reagenti per colture cellulari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellule aderenti EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>CellStripper Reagente di dissociazione cellulare</td><td>Corning</td><td>25-056-CI</td><td>La tripsina può essere utilizzata opzionalmente, ma dovrebbe essere assolutamente evitata con i saggi PAR2.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con rosso fenolo</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-091</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina da pelle suina</td><td>MilliporeSigma</td><td>G2500</td><td>Utilizzare per preparare una soluzione acquosa allo 0,4% (p/v) con acqua deionizzata. Autoclave prima dell'uso per sterilizzare.</td></tr><tr><td>Pen/Streptococco (100X)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue (0,4% p/v)</td><td>Corning</td><td>25-900-C<I</td><td></td></tr><tr><td>>strongCalcium Mobilization Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosulfonico (HEPES)Thermo</td><td></td> <td>172571000</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Avantor</td><td>97061-420</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Thermo</td><td>42352-0250</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Thermo</td><td>J66650-AD</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank (Ca/Mg/fenolo-rosso libero)</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (Poloxamer 407)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>P1166</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>TCI America</td><td>P1975</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>VWR International</td><td>BDH9292</td><td></td></tr><tr><td>TFLLRN-NH2 (sale TFA)</td><td></td><td></td><td>Preparato da Trudy Holyst presso il Versiti Blood Istituto di ricerca</td></tr><tr><td>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti trattata con coltura, pareti nere, fondo trasparente Piastra</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>con coperchi trasparenti</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga, 15 mL</td><td>Avantor</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga, 50 mL</td><td>Avantor</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Pallone di coltura, T-75</td><td>Corning</td><td>353136</td><td>coltura tissutale trattata</td></tr><tr><td>Serbatoio di reagenti monouso, 50 mL</td><td>Corning</td><td>RES-V-50-S</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di piastre Enspire</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Fuori produzione</td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga, 1,5 mL</td><td>Avantor</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur, 9"</td><td>Fisher</td><td>13-678-6B</td><td>deve essere sterilizzata</td></tr><tr><td>Striscia di provette PCR con piatto separato strisce per tappi</td><td>Avantor</td><td>76318-802</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 20 &; micro; L</td><td>Biotix</td><td>63300042</td><td>puntali sterili e filtrati</td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 200 & micro; L</td><td>Biotix</td><td>63300044</td><td>puntali sterili filtrati</td></tr><tr><td>Puntali per pipette, 1250 &; L</td><td>Biotix</td><td>63300047</td><td>puntali sterili e filtrati</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td></td><td>volume 6 pipetta</td></tr><tr><td>sierologica usata, 5 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5005</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 10 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5010</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sierologica, 25 mL</td><td>Tradewinds Direct</td><td>&nbsp; 07-5025</td><td></td></tr></tbody></table>

caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

Characterizing Modulators of Protease-Activated Receptors with a Calcium Mobilization Assay Using a Plate Reader

Lo scopo di questo test è generalmente quello di produrre curve concentrazione-risposta (CRC) per tre o quattro nuove parmoduline. Su ogni piastra di analisi, viene spesso generato un CRC aggiuntivo per un composto noto, come NRD-21, che funge da controllo di qualità per l'esperimento grazie al suo noto IC50. Per generare CRC, è necessario pianificare una mappa delle placche come quella illustrata nella Tabella 1 . Se invece si desiderano risposte di concentrazione a punto singolo, i composti a concentrazioni finali di 10 μM (o altre concentrazioni preferite) devono essere aggiunti ad almeno tre pozzetti.
Quando si esegue il test, dovrebbe esserci un rapido aumento della fluorescenza (l'aumento dovrebbe iniziare entro le prime 3-4 scansioni) visualizzato dal lettore di piastre (vedere la Figura 2A per un output di esempio rispetto all'output fallito nella Figura 2B). È importante notare che l'agonista deve essere aggiunto rapidamente (entro 15 s) affinché il lettore di piastre sia in grado di catturare con precisione l'aumento della fluorescenza. In un esperimento di lavoro, il segnale di fluorescenza per il pozzetto del veicolo dovrebbe rimanere piatto, mentre il segnale di fluorescenza nei pozzetti di controllo positivo (veicolo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) dovrebbe iniziare ad aumentare dopo tre o quattro scansioni. Una volta raggiunto il valore massimo (dopo ~10 scansioni), il segnale di fluorescenza dovrebbe iniziare a diminuire lentamente. Negli esperimenti con antagonisti altamente efficaci, i pozzetti con le più alte concentrazioni di antagonisti dovrebbero avere un segnale che rimane relativamente piatto, simile al controllo negativo. Ci dovrebbe essere anche poca differenza tra il segnale dei pozzetti di controllo positivi e quelli con basse concentrazioni dell'antagonista (Figura 2C). Se le concentrazioni più basse di antagonista continuano a inibire la mobilizzazione del calcio, le concentrazioni sottoposte a screening devono essere aggiustate per includere concentrazioni più basse. I CRC generati devono avere almeno un punto dati ~100% per mostrare completamente la natura sigmoidale della curva.
Il segno più comune che un esperimento non ha funzionato è se il pozzetto di controllo positivo (veicolo + 6,5 μM TFLLRN-NH2) non mostra un grande aumento della fluorescenza (Figura 2B). Ciò potrebbe accadere per una serie di motivi: la conta cellulare potrebbe essere bassa (se la confluenza non è stata confermata), la soluzione agonista potrebbe essere compromessa o le quantità inadeguate di colorante potrebbero essere state assunte dalle cellule. È anche possibile erroneamente non aggiungere l'agonista a certi pozzetti.
Con un metodo programmato, i dati vengono emessi come sei fogli di calcolo separati, ciascuno contenente dati per due colonne. Le cinque scansioni della fluorescenza basale sono in una riga separata, con le 20 scansioni effettuate dopo l'aggiunta dell'agonista nella riga immediatamente sottostante (vedere la Figura 3 per l'output rappresentativo). Per un esempio di calcolo, verrà utilizzata una colonna di un esperimento che utilizza NRD-21. Nel file esportato (Figura 3), la fluorescenza basale di ciascun pozzetto viene emessa nelle colonne da C a G e i dati successivi all'aggiunta dell'agonista (le successive 20 scansioni) vengono emessi nelle colonne da C a V nella riga successiva. Le righe 14-17 del file contengono il controllo positivo di due colonne separate. La media della fila basale per uno dei pozzetti di controllo positivi è stata calcolata utilizzando il comando "=AVERAGE(C16:G16)", che ha dato un valore di 1.039,8. Questo comando è stato ripetuto per le misurazioni basali aggiuntive in ciascun pozzetto. Il massimo delle scansioni sperimentali è stato calcolato utilizzando il comando "=MAX(C16:V16)", che ha dato un valore di 2.629. Ancora una volta, il comando fu ripetuto per tutti i pozzi. La fluorescenza basale per ogni pozzetto è stata quindi sottratta dal valore massimo. In questo esperimento, i dati sono stati normalizzati sottraendo la variazione della fluorescenza nel controllo negativo da ciascun pozzetto (che era 142,6 nella colonna di esempio). Questi valori sono stati poi divisi per il valore calcolato in modo simile del controllo positivo. In questa colonna, il valore massimo era 2.629, la misura basale media era 1.039,8 e il valore sottratto per il bianco era 142,6. Il valore del controllo positivo rettificato è quindi 1.446,6 (calcolato dall'equazione). Questa equazione viene ripetuta per ogni pozzetto nella colonna e i valori calcolati vengono divisi per 1.446,6 per ottenere la loro variazione relativa in fluorescenza. I rapporti sono stati poi convertiti in percentuali e sono stati copiati nel software analitico. Questo processo è stato ripetuto per le altre 11 colonne.
Per elaborare i dati utilizzando il software di riferimento, è necessario selezionare una tabella XY con l'opzione di avere tre misurazioni ripetute in colonne affiancate. I valori -log di ciascuna concentrazione devono essere inseriti nei valori x e le percentuali calcolate devono essere aggiunte ai valori y. Sui dati deve essere eseguita un'analisi di regressione non lineare, che provoca la produzione di quattro curve concentrazione-risposta. Il programma produce anche valori IC50 , statistiche di errore quantificate e statistiche sulla bontà dell'adattamento.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig01.jpg"> Figura 1: Fluo-4/AM caricato nelle celle EA.hy926. Fluo-4 caricato selettivamente in celle EA.hy926, dopo l'incubazione del colorante e le fasi di lavaggio. Tutta la fluorescenza avviene all'interno delle cellule, senza perdite di colorante. Immagine ottenuta utilizzando l'impostazione GTP su un imager a celle EVOS e ingrandimento 20x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig02.jpg"> Figura 2: Output potenziale del saggio. (A) Output rappresentativo del lettore di piastre di un test funzionante. La riga A è il controllo negativo e non ha alcun cambiamento nella fluorescenza. La riga B è il controllo positivo e mostra un rapido aumento della fluorescenza. Le file C-H sono i pozzetti sperimentali, con le concentrazioni più elevate di parmodulina più basse nella piastra. (B) Esempio di output di un esperimento fallito. Non si osserva alcun aumento della fluorescenza nella riga B, che è il controllo positivo. (C) Variazione della fluorescenza nel tempo indotta dall'agonista PAR1 TFLLRN-NH2. La scansione di due colonne di una piastra a 96 pozzetti utilizzando le impostazioni fornite richiede ~5 minuti sul lettore di piastre PerkinElmer EnSpire (ovvero, ~15 s tra le scansioni di ciascun pozzetto). Diverse soluzioni di NRD-21 sono come indicato, "Agonista" è 6,5 μM TFLLRN-NH2, n = 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig03.jpg"> Figura 3: Esempio di output Excel per un saggio funzionante. La fluorescenza basale viene emessa in righe pari a partire dalla riga 10 e il risultato delle prime 10 scansioni dopo l'aggiunta dell'agonista viene mostrato nelle successive righe dispari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig04.jpg"> Figura 4: Manipolazione robotica dei liquidi rispetto al "flicking". Il prerivestimento delle piastre di analisi con gelatina e l'esecuzione manuale della sostituzione dei terreni mediante scorrimento della piastra e tamponamento a secco producono curve concentrazione-risposta con minore variabilità. (A) Curve concentrazione-risposta delle parmoduline ML161 e NRD-21 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (manipolazione automatizzata dei liquidi). (B) Curve concentrazione-risposta delle parmoduline ML161 e NRD-21 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (piastre rivestite di gelatina, sfogliate). I dati sono mezzi ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig05.jpg"> Figura 5: Studi sulla temperatura. L'esecuzione del test a 37 °C genera dati più riproducibili rispetto a temperatura ambiente. (A) Curve concentrazione-risposta di ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (temperatura ambiente). (B) Curve concentrazione-risposta di ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (37 °C). I dati sono mezzi ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig06.jpg"> Figura 6: Studi sulla densità cellulare. La densità cellulare ottimale è di 60.000 cellule/pozzetto quando si semina 16-24 ore prima dell'inizio di un saggio. (A) Curve concentrazione-risposta di TFLLRN-NH2 a diverse densità cellulari, n = 3. (B) Curva concentrazione-risposta di TFLLRN-NH2 alla densità cellulare ottimale di 60.000 cellule/pozzetto. I dati sono mezzi ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig07.jpg"> Figura 7: Volume del saggio. L'utilizzo di un volume di saggio di 100 μl genera curve concentrazione-risposta più riproducibili rispetto ai saggi che utilizzano un volume finale di 200 μl. (A) Curve concentrazione-risposta di ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (volume finale di 200 μl). (B) Curve concentrazione-risposta di ML161 e 5 μM TFLLRN-NH2, n = 3 (100 μL di volume finale). I dati sono mezzi ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig08.jpg"> Figura 8: Generazione dei fattori Z' per determinare la capacità del saggio di rilevare un composto colpito. Risposte di mobilizzazione del calcio con 6,5 μM TFLLRN-NH2 (colonna B) più antagonisti PAR1 opzionali 10 μM NRD-21 (colonna C) o 0,316 μM vorapaxar (colonna D). (A) Saggio completato 16 ore dopo la semina cellulare. (B) Saggio completato 24 ore dopo la semina cellulare. (C) Tabella dei fattori Z' calcolati utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66507/66507eq01v5.jpg" style="margin: auto;">, doveσ p è la deviazione standard del controllo positivo, σn è la deviazione standard del controllo negativo o del campione, μp è la media del controllo positivo e μn è la media del controllo negativo o del campione. Ogni valore viene calcolato designando il veicolo + 6,5 μM TFLLRN-NH2 come controllo positivo e confrontandolo con la condizione indicata come controllo negativo (veicolo) o campione (NRD-21 e vorapaxar). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66507/66507fig09.jpg"> Figura 9: Mobilizzazione del calcio da un agonista PAR2. Variazione della fluorescenza nel tempo indotta da 10 μM SLIGKV-NH2, n = 4. I dati sono mezzi ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507fig09large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Esempio di mappa su piastra a 96 pozzetti per lo screening dei composti. Ogni concentrazione è misurata in triplice copia. La riga A contiene controlli negativi (nessun antagonista, nessun agonista) e la riga B contiene controlli positivi (nessun antagonista, agonista). Le colonne da 1 a 3 contengono sei concentrazioni di mezzo log della parmodulina NRD-21 che possono essere utilizzate opzionalmente per il controllo di qualità. PM-A, PM-B, PM-C sono parmoduline senza nome. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%201.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Confronto tra il protocollo pubblicato in precedenza e il nuovo protocollo ottimizzato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66507/66507_Table%202.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Caratterizzazione dei modulatori dei recettori attivati dalla proteasi con un saggio di mobilizzazione del calcio utilizzando un lettore di piastre

Changes in calcium concentration in cells are rapidly monitored in a high-throughput fashion with the use of intracellular, fluorescent, calcium-binding ...

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