Name: Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T13:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Scopri come generare e mantenere embrioni di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili. Questo metodo consente di studiare le interazioni ospite-microbiota e il loro impatto sullo sviluppo e l'immunità.

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Ringraziamo sinceramente il supporto del Chongqing Medical University Talent Project (n. R4014 a DSP e R4020 a PPJ), della National Natural Science Foundation of China (NSFC, n. 32200386 a PPJ), del Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) e del Programma del Centro congiunto Cina-Sri Lanka per la ricerca e la dimostrazione sulla tecnologia dell'acqua dell'Accademia cinese delle scienze (CAS) / Centro congiunto Cina-Sri Lanka per l'istruzione e la ricerca di CAS.

Ottimizzazione dei modelli GF Zebrafish: generazione, manutenzione e studi microbici

Il protocollo di GF Artemia è stato concesso come brevetto dalla China National Intellectual Property Administration, che allevierà l'uso limitato del metodo dopo aver ottenuto il permesso degli autori. Gli autori dichiarano di non avere altri interessi concorrenti o finanziari.

Passaggi critici all'interno dei protocolli di GF fish e preparazione del cibo GF Durante la generazione di modelli di pesci GF, sono state coinvolte diverse fasi critiche, tra cui la preparazione di materiali sterili, la sterilizzazione degli embrioni, il rinnovo giornaliero del GZM, la raccolta di vari campioni e l'esame sterile di ciascun campione utilizzando più metodi. Tra questi passaggi, il trattamento iniziale degli embrioni è fondamentale e decisivo per il successo dei modelli GF. Gli agenti di controllo, le loro concentrazioni e i tempi di trattamento sono fondamentali per ottenere tassi di sterilizzazione ottimali e il successo della schiusa. È necessaria un'attenzione particolare quando si maneggiano embrioni di pesce GF in larve, comportando cambi giornalieri del terreno e assicurandosi che i materiali e le piattaforme siano accuratamente sterilizzati utilizzando la luce ultravioletta o in autoclave quando si rimuovono le piastre dall'incubatrice. Il monitoraggio delle condizioni di temperatura e del tempo di funzionamento durante l'inverno è essenziale per prevenire la morte larvale causata da temperature più basse nei banchi puliti.
Il tuorlo d'uovo sterile e l'artemia GF devono essere rilevati prima di essere somministrati ai pesci dopo 7 dpf per garantire il loro stato sterile per i modelli GF a lungo termine. Durante il periodo di alimentazione, la pulizia dei residui di cibo è importante come parte dei campioni raccolti per il rilevamento durante il rinnovo del mezzo di scarto. Il contenitore, il volume di GZM e la massa di cibo devono essere regolati insieme alle fasi di crescita e sviluppo per prevenire la perdita di pesci GF a causa dell'ambiente limitato e dei problemi di qualità dell'acqua. Il monitoraggio regolare e le regolazioni di questi parametri contribuiscono al mantenimento di successo dei modelli di pesce GF.
Modifiche e significato di questi protocolli Il processo semplificato in tre fasi per la generazione di embrioni GF zebrafish, che coinvolge agenti, concentrazioni e tempi di esposizione ottimizzati delle soluzioni AB-GZM, PVP-I e NaClO, garantisce un elevato tasso di sterilità e un sano sviluppo dei modelli. Inoltre, i metodi di rilevamento sterile per i campioni giornalieri sono stati perfezionati per includere piastre e colture di terreno liquido in condizioni aerobiche e anaerobiche, insieme a tecniche molecolari che utilizzano comuni primer batterici. Ulteriori esperienze nei test per contaminanti batterici e fungini mirano a ottimizzare i contaminanti isolatori e i test sterili durante le tecniche di GF su animali48.
Il protocollo specifico per i naupli GF Artemia come cibo vivo per modelli di pesci è stato studiato nel nostro studio e un brevetto è stato concesso a PPJ e DSP dalla China National Intellectual Property Administration (n. ZL202210482684.8). I modelli di pesce GF a lungo termine sono costantemente limitati da un'alimentazione inadeguata e inadatta, esacerbando le debolezze nelle funzioni intestinali legate alla digestione e all'assorbimento. Come fonte di cibo credibile per i modelli di medaka e zebrafish in diverse fasi di vita, GF Artemia sp. dovrebbe essere facile da preparare con una procedura semplice, un breve tempo di incubazione e un rilevamento sterile in tempo reale per l'uso quotidiano. In questo metodo, le cisti artemiche normali vengono risciacquate in una concentrazione sufficiente di NaClO per essere asettiche e quindi incubate in un flacone rivestito con film, nonché su una piastra e in un mezzo liquido per la rilevazione. Questo supporta i naupli appena nati per l'alimentazione dei pesci GF. Il tasso di sterilità e il tasso di schiusa dell'Artemia, così come la lunghezza del corpo, il peso e l'attività di, sono eccellenti, indicando le applicazioni disponibili nella pratica.
Il significato di queste modifiche nei protocolli alimentari GF fish e GF avvantaggia i ricercatori nella generazione di modelli a embrioni, larve, stadi giovanili e persino primi stadi adulti e adulti in modalità marina e d'acqua dolceμspecies. Gli animali GF a lungo termine forniranno il permesso come modelli in vivo nella ricerca sullo screening dei farmaci e sulle funzioni microbiche durante la crescita e lo sviluppo dell'ospite, in particolare nella maturità dell'immunità e delle relative linee cellulari intestinali. Ad esempio, le larve di pesce zebra possiedono un'immunità innata solo nella prima settimana, quindi sviluppano il sistema immunitario adattativo durante 7-21 dpf, insieme alla maturità del timo 31,49. Inoltre, i modelli di pesce GF possono fornire la possibilità di analizzare le interazioni batteri-batteri e microbiota-ospite con l'osservazione dal vivo dei processi di colonizzazione e migrazione dinamica negli organismi50,51.
Limitazioni del metodo L'allevamento di pesci GF da giovani a primi adulti (28 dpf-2,5 mpf) e adulti sessualmente maturi (>2,5 mpf) rimane difficile a causa dell'aumento della mortalità e del rischio di contaminazione batterica durante il mantenimento del modello. Queste limitazioni derivano principalmente dall'assenza di sistemi di autocoltura adatti per i pesci che vivono in un ambiente GF. Questi sistemi dovrebbero includere aria pulita, acqua e un sistema alimentare per mantenere efficacemente gli animali e i loro ambienti, garantendo il completo isolamento dai microrganismi esterni. A differenza di altri modelli animali GF come topi e polli52, ottenere il pesce zebra GF attraverso operazioni anatomiche dai genitori CR è difficile a causa delle loro abitudini acquatiche e dello stile di fecondazione naturale.
Anche trattare gli animali adulti come completamente privi di microbiota intestinale è difficile. Mentre il trattamento antibiotico può indurre uno stato simile a quello degli animali privi di patogeni specifici (SPF), caratterizzato da un microbiota ridotto rilevato nei campioni fecali, il raggiungimento di veri modelli di pesci adulti GF rimane difficile. Le sfide legate alla creazione e al mantenimento dei modelli di GF, specialmente durante la transizione dagli stati giovanili a quelli a lungo termine, sono significative. L'importanza della prole GF, come le uova GF F1 o F2 di pesci GF adulti, nella ricerca microbica è riconosciuta. Tuttavia, superare le sfide nella creazione e nel mantenimento di modelli di pesci GF adulti a lungo termine richiede molto tempo.
Vale la pena notare che è stato sviluppato un pesce zebra gnotobiotico con una specifica colonizzazione batterica, che mostra una sopravvivenza cronica basata su modelli GF. Tuttavia, rimane incerto se questi modelli possano servire come valide alternative ai modelli GF nelle infezioni batteriche e nella ricerca biomedica.
Applicazioni future dei modelli di pesce GF In questo studio, abbiamo perfezionato il protocollo per la generazione di modelli di pesce zebra GF, progredendo dagli embrioni ai giovani. Questo progresso ha applicazioni significative nella biologia dello sviluppo, nell'immunologia, nella ricerca sulle malattie umane e nell'organogenesi. Attraverso l'isolamento e l'identificazione di massa, lo studio esplora le funzioni, i meccanismi e i metaboliti derivati dall'intestino di singoli ceppi batterici. L'indagine prevede l'infezione dei modelli di pesce zebra GF dopo che lo sfiato ha aperto la fase47,53. Inoltre, i batteri marcati con fluorescenza facilitano l'osservazione della colonizzazione e della distribuzione nelle larve di GF vive, prive di altre influenze microbiche54. Modelli di pesci GF simili, come la medaka marina o d'acqua dolce, possono essere creati utilizzando metodi comparabili con vari agenti o cambiamenti del mezzo.
Per sondare i meccanismi delle malattie umane, lo studio utilizza metodi FMT, trasferendo campioni da pazienti o donatori ad animali sani o modelli GF55. A differenza degli animali allevati in modo convenzionale (CR), i modelli GF offrono prove solide di funzioni, impatti o risposte microbiche nell'ospite, in particolare se combinati con batteriofagi per regolare i batteri bersaglio nel microbiota46.
In sintesi, i pesci zebra GF fungono da potenti modelli per valutare la sicurezza batterica, l'efficacia dei farmaci, la tossicità degli inquinanti o l'interferenza dei composti, grazie al loro ambiente intestinale sensibile e puro. L'esplorazione futura delle applicazioni dei pesci GF dovrebbe comprendere vari campi, con la necessità di creare modelli di pesci GF adulti per una comprensione più profonda delle funzioni microbiche nelle diverse fasi della vita.

Il microbiota (cioè Archaea, Batteri, Eucarya e virus) svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute dell'ospite e contribuisce allo sviluppo di varie malattie influenzando i processi fisiologici e patologici attraverso interazioni simbiotiche all'interno della barriera intestinale, della superficie epiteliale e delle funzioni della mucina negli individui 1,2,3. La composizione del microbiota nelle diverse fasi della vita, dall'infanzia alla giovinezza, all'età adulta e all'invecchiamento, nonché la sua presenza in vari luoghi come narici, siti orali, cutanei e intestinali, è modellata dinamicamente da diversi habitat e ambienti4. Il microbiota intestinale negli organismi è coinvolto nell'assorbimento dei nutrienti, nella risposta immunitaria, nell'invasione dei patogeni, nella regolazione metabolica, ecc. 5,6. Studi su pazienti hanno dimostrato che le interruzioni del microbiota intestinale sono correlate all'obesità umana, ai disturbi del sonno, alla depressione, alle malattie infiammatorie intestinali (IBD), alle malattie neurodegenerative (Parkinson, Alzheimer), all'invecchiamento e a vari tipi di cancro 7,8,9. Inoltre, i percorsi interattivi tra il microbiota intestinale e gli ospiti coinvolgono fattori infiammatori, neurotrasmettitori, metaboliti, barriera intestinale e stress ossidativo, come osservato in precedenti ricerche utilizzando modelli di topi e pesci10,11.
Recentemente, sono stati esplorati diversi approcci o terapie correlate ai batteri, inclusi potenziali probiotici e trapianto di microbiota fecale (FMT), per questi disturbi in modelli clinici e animali. Queste esplorazioni si basano su scoperte relative all'asse microbiota-intestino-cervello/fegato/rene, ai prodotti derivati dal microbiota e all'alterazione dell'attività dei recettori12,13. Tuttavia, lo sviluppo, le varie funzioni e i meccanismi del sistema microbiota-ospite sono ancora incompleti e identificati a causa della complessità della comunità microbica e della sfida di generare potenti modelli di malattia simili a quelli umani.
Per affrontare questi problemi, a metà delXIX secolo furono proposti con urgenza modelli animali privi di germi (GF) e sviluppati principalmente nel corso del XXsecolo. I successivi perfezionamenti, compresi i modelli trattati con antibiotici e gnotobiotici, insieme ai progressi nelle tecnologie di rilevamento e osservazione microbica, hanno ulteriormente perfezionato questi modelli 14,15,16. Gli animali GF, creati cancellando il proprio background ed evitando i microbi ambientali, offrono un'eccellente strategia per esplorare le interazioni tra i microrganismi e i loro ospiti17. Attraverso l'applicazione di modelli animali e protocolli raffinati, i ricercatori hanno replicato con successo composizioni microbiche simili trovate nei pazienti nei topi e nei pesci GF. Inoltre, altri modelli animali GF, come cani, polli e maiali, forniscono diverse opzioni come soggetti di ricerca 18,19,20,21. Questo approccio ha permesso di studiare i potenziali effetti terapeutici dei microbiomi commensali su varie malattie, tra cui l'immunoterapia del cancro nell'uomo16,18. I modelli GF offrono informazioni più accurate sulle caratteristiche e sui meccanismi di specifica colonizzazione, migrazione, moltiplicazione e interazione batterica all'interno degli ospiti. Ciò fornisce nuove informazioni cruciali sull'insorgenza e lo sviluppo di malattie correlate al microbiota22,23. La storia della creazione e dell'applicazione del pesce zebra GF nella ricerca microbica si è evoluta dai rapporti di Rawls et al. nel 2004 e Bates et al. nel 2006 al protocollo di Melancon et al. nel 2017 16,24,25. Tuttavia, la fattibilità di modelli GF adulti o riproduttori è ancora un processo prolungato, accompagnato da longevità, tassi di successo e problemi di salute variabili.
Tra i vari modelli animali, il pesce zebra (Danio rerio) si distingue come uno strumento fondamentale sia per la ricerca di base che per quella biomedica grazie alla sua vantaggiosa somiglianza con gli organi umani e la genomica, il breve ciclo di sviluppo, l'elevata fecondità e gli embrioni trasparenti19,26. I pesci zebra, che fungono da modelli affidabili di malattie umane, offrono una rappresentazione visiva dei processi fisiologici e patologici in vivo, fornendo informazioni sulle caratteristiche interessanti delle interazioni ospite-microbo. In particolare, il pesce zebra mostra linee cellulari distinte, consentendo l'imaging della fisiologia intestinale, della dinamica microbica, delle gonadi e dello sviluppo riproduttivo, della maturazione del sistema immunitario dell'ospite, del comportamento e del metabolismo27. Gli embrioni di pesce zebra si sviluppano all'interno di corioni protettivi fino alla schiusa, diventando larve a 3 giorni dopo la fecondazione (dpf). Cercano attivamente cibo a 5 dpf e raggiungono la maturità sessuale circa 3 mesi dopo la fecondazione (mpf)28. Il primo pesce zebra privo di germi (GF) di successo, riportato da Rawls et al.24, ha mostrato che le larve alimentate con mangime autoclavato dopo l'assorbimento del tuorlo mostravano necrosi tissutale da 8 dpf e morte totale a 20 dpf. Ciò ha indicato gli effetti della dieta o l'importanza di considerare l'apporto di nutrienti esogeni negli esperimenti che coinvolgono pesci GF a lungo termine (>7 dpf)29. Studi successivi hanno migliorato il protocollo di generazione dei pesci GF, impiegando cibo sterile e metodi perfezionati in diversi modelli di pesce16.
Tuttavia, la maggior parte della ricerca sui modelli di pesce zebra GF si è concentrata sulle prime fasi di vita, che coinvolgono l'infezione batterica a 5 dpf per 24-48 ore, con campioni raccolti prima di 7 dpf alla conclusione degli esperimenti 25,30,31. È ampiamente riconosciuto che il microbiota negli organismi, compresi gli esseri umani e il pesce zebra, è colonizzato all'inizio della vita e modellato durante la crescita e lo sviluppo. La composizione rimane stabile negli stadi adulti, con i ruoli del microbiota nell'ospite cruciali per tutta la vita, specialmente negli aspetti dell'invecchiamento, dell'obesità neurodegenerativa e metabolica e delle malattie intestinali3. Pertanto, le prospettive degli animali GF con sopravvivenza più lunga possono fornire informazioni sui meccanismi dei ruoli microbici nello sviluppo e nelle funzioni degli organi ospiti, considerando i sistemi immunitari e riproduttivi immaturi delle larve di pesce nei primi anni di vita. Mentre i ceppi batterici nell'intestino del pesce zebra sono stati isolati e identificati in studi precedenti, offrendo il potenziale per infettare i modelli animali GF per selezionare probiotici o ricercare funzioni batteriche nell'ospite19,25, la generazione e l'applicazione di modelli di pesce GF sono state principalmente limitate alle prime fasi della vita. Questa limitazione, attribuita al complesso processo di produzione, agli elevati costi di manutenzione e ai problemi associati al cibo e all'immunità, ostacola gli sforzi di ricerca volti a studiare gli effetti dello sviluppo e cronici del microbiota nell'ospite.
Il tasso di sopravvivenza, il comportamento, la crescita, la maturazione e la salute generale dei pesci, specialmente nei modelli privi di germi (GF), sono significativamente influenzati dalle pratiche alimentari, che comprendono l'assunzione e l'assorbimento del nutrimento durante il periodo di apertura della bocca dalle prime larve ai giovani32,33. Tuttavia, una delle sfide nell'allevamento di pesci GF è la scarsità di diete sterili adeguate, che limita l'efficacia del supporto nutrizionale per sostenere la crescita e la sopravvivenza delle larve. Risolvere questo problema è fondamentale per ripristinare la vita dei pesci GF, considerando i loro meccanismi di difesa dello sviluppo e le deboli capacità di digestione dovute all'assenza di un microbioma intestinale. In termini di cibo, i gamberetti in salamoia vivi (Artemia sp.) emergono come la dieta più adatta per le larve a bocca aperta e per i pesci giovani. È stato osservato che i pesci nutriti con artemia salina vivi mostrano tassi di crescita e sopravvivenza più elevati rispetto a quelli alimentati con tuorlo d'uovo cotto o altre esche naturali e sintetiche34. Mentre i modelli di vita precoce dei pesci GF possono sopravvivere con il supporto del tuorlo e i modelli di larve GF possono essere mantenuti con l'alimentazione sterile, la generazione di modelli a lungo termine dalle larve ai giovani e il raggiungimento della maturità sessuale rimane una sfida. Inoltre, il cibo in scaglie o in polvere è limitato da una composizione nutrizionale ineguale e può influire sulla qualità dell'acqua. Al contrario, l'artemia viva presenta vantaggi come la sopravvivenza sia in acqua salata che in acqua dolce, dimensioni ridotte adatte alle larve agli adulti, facilità di dosaggio e maggiore qualità di schiusa35. Basandoci sui metodi precedenti 16,24,30, abbiamo semplificato il complesso processo di trattamento e affrontato la sfida della dieta stabilendo Artemia sp. GF viva facilmente incubata come alimento sterile per periodi più lunghi rispetto ai pesci GF all'inizio della vita.
Questo studio presenta un protocollo ottimizzato che copre (1) generazione, (2) mantenimento, (3) identificazione del tasso di sterilità e (4) mantenimento e alimentazione per garantire la crescita di zebrafish privo di germi (GF) dagli embrioni alle larve e agli stadi giovanili. I risultati offrono prove preliminari sulla schiusa, la sopravvivenza, la crescita e la sterilità del pesce zebra GF, insieme agli indici essenziali per GF Artemia sp. come alimento sterile. Le fasi dettagliate nella generazione del modello e nella preparazione di alimenti vivi sterili forniscono un supporto tecnico cruciale per la costruzione e l'applicazione di modelli di pesce GF a lungo termine, nonché GF Artemia sp. nella ricerca sull'interazione microbiota-ospite. Il protocollo affronta l'isolamento, l'identificazione e l'infezione batterica su modelli di pesci GF, delineando metodi per l'etichettatura della fluorescenza batterica e osservando la loro colonizzazione nell'intestino dei pesci al microscopio. I pesci GF, i pesci gnotobiotici con infezione batterica o i modelli di microbiota umano trasferiti saranno sottoposti a vari rilevamenti per chiarire le loro funzioni ed effetti sull'immunità dell'ospite, sulla digestione, sul comportamento, sulla regolazione trascrittomica e sugli aspetti metabolici. A lungo termine, questo protocollo può essere esteso a diverse specie ittiche selvatiche, come il medaka marino, e potenzialmente ad altre linee di pesce zebra transgenico selezionate correlate a tessuti o malattie specifici.

<table><tbody><tr><td>AB-GZM</td><td>Amfotericina:Solarbio; &nbsp; kanamicina:Solarbio; Ampicillina:Solarbio.</td><td>Amfotericina:CAS:1397-89-3; kanamicina:CAS: 25380-94-0; Ampicillina: CAS: 69-52-313.</td><td>49,6 mL GZM, 50 &; micro; L. soluzione madre di amfotericina (250 &micro; g/mL), 25 &micro; L. kanamicina soluzione madre (10 mg/mL) e 250 &micro; L. soluzione madre di ampicillina (20 mg/mL).</td></tr><tr><td>Provette EP da 1,5 mL, 15 mL, 50 mL</td><td>biosharp</td><td>BS-15-M</td><td>Per raccogliere campioni e trattenere agenti</td></tr><tr><td>2,4 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>Diluito con soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'8%.</td></tr><tr><td>piastre a 6 pozzetti, piastre a 24, 48 pozzetti</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>11112</td><td>Per allevare pesci</td></tr><tr><td>Aeronomas</td><td>NCBI database</td><td>n.MK178499</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>Piastre TSA anaerobiche</td><td>triptone:Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp; agar in polvere: BioFroxx.</td><td>triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112; POLVERE DI AGAR: 9002-18-0.</td><td>Le piastre TSA sono state preparate con 400 ml di terreno contenente 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia, 2 g di NaCl e 6 g di polvere di agar sotto il sistema anaerobico.</td></tr><tr><td>Stazione di lavoro anaerobica</td><td>GENE SCIENCE</td><td>E200G</td><td>Isolamento batterico, test sterili</td></tr><tr><td>Analisi GraphPad</td><td>Prism 5</td><td>v6.07</td><td>Per analizzare i</td></tr><tr><td>dati API 20 E kits</td><td>&nbsp; BioMerieux SA, Francia</td><td>No.1005915090</td><td>Ref 20100 Kit per rilevare il metabolismo batterico</td></tr><tr><td>Artemia (Gamberetti in salamoia)</td><td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>Cisti di artemia <td>di marca Aquamaster</td><td>e uova di artemia salina</td></tr><tr><td>Sistema di ciclo automatico per l'allevamento di pesci</td><td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td><td>No Cat</td><td>Mantenere il pesce</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Zeal Way</td><td>G154DWS</td><td>Preparare i materiali</td></tr><tr><td>BHI Aerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>BHI medium è stato preparato, in cui 100 mL di terreno includevano 3,7 g di polvere BHI.</td></tr><tr><td>BHI Anaerobic</td><td>Coolaber</td><td>Cat#PM0640</td><td>Il terreno BHI è stato preparato e diviso in tubi anaerobici sotto il sistema anaerobico.</td></tr><tr><td>Incubatore biochimico</td><td>LongYue Co., Ltd</td><td>SPX</td><td>Per pesci e piatti</td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza</td><td>Haier</td><td>HR40-IIA2</td><td>Trattamento e test sterili</td></tr><tr><td>Agente sbiancante di 0,02 g/L NaClO</td><td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>CAS: 7681-52-9</td><td>Soluzione di lavoro con ipoclorito di sodio (NaClO) concentrazione: diluita con soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'8% o 166,6 uL di ipoclorito di sodio al 6% con 500 mL di acqua distillata.</td></tr><tr><td>Piastre di sangue</td> sangue <td>di pecora: Solarbio</td><td>N. di cat. TX0030</td><td>Il sangue di pecora defibrinato sterile è stato aggiunto alla TSA per preparare piastre di sangue al 5%.</td></tr><tr><td>Pallone per colture cellulari</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>Per la coltura di pesci</td></tr><tr><td>Coloranti CM-Dil</td><td>Sonde molecolari</td><td>Cat#C7000&nbsp; &nbsp;</td><td>Per etichettare i batteri</td></tr><tr><td>Incubatore con agitazione a temperatura costante</td><td>Peiving Co., Ltd</td><td>HZQ-X100</td><td>Database di colture batteriche</td></tr><tr><td></td><td>NCBI Database di</td><td>batteri e archei</td><td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Batteri FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td></tr> <tr><td>Pipetta Pasteur monouso</td><td>biosharp</td><td>bs-xh-03l</td><td>Utilizzato per cambiare l'acqua e trasferire le uova</td></tr><tr><td>Piastra di Petri monouso</td><td>biosharp</td><td>BS-90-D</td><td>Per la coltura di kit di DNA di pesce</td></tr><tr><td></td><td>Solaribio</td><td>Cat#D1600</td><td>Kit di estrazione del DNA genomico batterico...</td></tr><tr><td>Pipetta elettrica</td><td>SCILOGEX</td><td>Levo me</td><td>Cambia l'acqua</td></tr><tr><td>Exiguobacterium</td><td>NCBI database</td><td>n.MK178504</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr><tr><td>GZM</td><td>Sale marino:LANDEBAO Co., Ltd.</td><td>No Cat</td><td>Composto da 1 L di acqua e 1,5 mL di soluzione di sale marino (40 g/L), sterilizzato in autoclave. Il contenuto di sale marino nella soluzione di GZM era di 60 mg/L.</td></tr><tr><td>Sistema di acqua pura da laboratorio</td><td>Hitech Co., Ltd</td><td>Prima-S15</td><td>Preparare gli agenti</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>Con luce fluorescente per osservare le larve di pesce</td></tr><tr><td>Kit PCR</td><td>TIANGEN</td><td>Cat#ET101</td><td>Taq Kit DNA polimerasi</td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>LABSELECT&nbsp;</td><td>sp-013-10</td><td>Cambia l'acqua</td></tr><tr><td>: iodio povidone (PVP-I)</td><td>Aladdin</td><td>Lot#H1217005</td><td>Soluzione acquosa, iodio povidone 0,4 g/L di acqua pura.</td></tr><tr><td>Convertitore di temporizzazione</td><td>PinYi Co., Ltd</td><td>AL-06</td><td>Per regolare la luce</td></tr><tr><td>TSA piastre</td><td>triptone: Oxoid ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp; agar in polvere: BioFroxx.</td><td>triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112; POLVERE DI AGAR: 9002-18-0.</td><td>Le piastre TSA sono state preparate con 400 ml di terreno contenente 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia, 2 g di NaCl, 6 g di agar in polvere.</td></tr><tr><td>TSB Triptone aerobico</td><td>:Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp;</td><td>triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112;</td><td>È stato preparato un terreno TSB, in cui 400 ml di terreno includevano 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia e 2 g di NaCl.</td></tr><tr><td>TSB Triptone anaerobico</td><td>:Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp;</td><td>triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112;</td><td>Il terreno TSB è stato preparato e diviso nei tubi anaerobici sotto il sistema anaerobico.</td></tr><tr><td>Banco da lavoro ultra-pulito</td><td>Airtech</td><td>SW-CJ-2FD</td><td>Trattamento e test sterili</td></tr><tr><td>Sistema di flusso ultrapuro per l'allevamento ittico</td><td>Azienda di attrezzature biologiche marine</td><td>No Cat</td><td>Produce acqua per pesci</td></tr><tr><td>Vibrio</td><td>NCBI database</td><td>n.MK178501</td><td>2019-JPP-ESN</td></tr></tbody></table>

generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

I pesci zebra fungono da modelli preziosi per la ricerca sulla crescita, l'immunità e il microbiota intestinale grazie alle loro somiglianze genomiche con i mammiferi, agli embrioni trasparenti sviluppati in un ambiente corionico relativamente pulito e allo sviluppo estremamente rapido delle larve rispetto ai modelli di roditori. Il pesce zebra privo di germi (Danio rerio) è fondamentale per valutare la tossicità degli inquinanti e stabilire modelli di malattie simili a quelle umane correlate alle funzioni microbiche. Rispetto ai modelli allevati in modo convenzionale (CR) (pesci in allevamento comune), il pesce zebra GF consente una manipolazione più accurata del microbiota dell'ospite, aiutando a determinare la relazione causale tra microrganismi e ospiti. Di conseguenza, svolgono un ruolo fondamentale nel far progredire la nostra comprensione di queste relazioni. Tuttavia, i modelli di pesce zebra GF sono tipicamente generati e studiati durante le prime fasi di vita (dagli embrioni alle larve) a causa delle limitazioni nella funzione immunitaria e nell'assorbimento dei nutrienti. Questo studio ottimizza la generazione, il mantenimento e l'identificazione dei primi modelli di pesce zebra GF senza alimentazione e con alimentazione a lungo termine utilizzando alimenti GF (come Artemia sp., artemia salina). Durante tutto il processo, sono stati eseguiti campionamenti e colture giornalieri e identificati attraverso rilevamenti multipli, tra cui piastre e sequenziamento dell'rRNA 16S. Sono stati registrati il tasso asettico, la sopravvivenza e gli indici di sviluppo del pesce zebra GF per garantire la qualità e la quantità dei modelli generati. È importante sottolineare che questo studio fornisce dettagli sull'isolamento batterico e sulle tecniche di infezione per i pesci GF, consentendo la creazione efficiente di modelli di pesci GF dalle larve agli stadi giovanili con supporto alimentare GF. Applicando queste procedure nella ricerca biomedica, gli scienziati possono comprendere meglio le relazioni tra le funzioni batteriche intestinali e la salute dell'ospite.

I modelli GF zebrafish possono essere prodotti in modo efficiente utilizzando le abbondanti uova deposte dalle coppie di zebrafish, con il protocollo ottimizzato sulla base dei precedenti modelli di pesce GF35. Una singola piastra a 6 pozzetti può coltivare circa 30-48 embrioni/larve, consentendo un'ampia raccolta di dati e analisi statistiche. Dopo il trattamento sterile, gli embrioni GF vengono coltivati in un'incubatrice pulita fino alla schiusa in larve a 48-72 ore e cambiati GZM ogni giorno con il rilevamento dei campioni raccolti, che è fondamentale per mantenere lo stato privo di germi (Figura 1). Dopo 7 dpf, il cibo di tuorlo d'uovo e artemia viva dovrebbe essere preparato per le larve fino agli stadi giovanili. Durante la crescita e lo sviluppo dei pesci, il volume, il contenitore e la densità di GZM devono essere regolati o modificati in tempo per evitare la morte e il fallimento dello stato di sterilità. Se il rilevamento non mostra inquinamento batterico, i modelli GF di successo possono essere mantenuti come cronici dall'età giovanile alla prima età adulta, ma il tasso di sopravvivenza è molto più basso nella pratica. Infine, è possibile misurare il tasso di sterilità, il tasso di sopravvivenza, l'indice di sviluppo, il comportamento, l'analisi istopatologica e il profilo di trascrizione dei modelli di pesci GF e CR per esplorare l'influenza del microbiota e dei campi di screening farmacologico. In questo studio, sono stati confrontati i principali indici di sviluppo (Figura supplementare 1) e il tasso di schiusa dei pesci GF era inferiore del 45,7% rispetto ai pesci CR, con il 60% a 72 hpf. La frequenza cardiaca delle larve GF a 7 dpf era significativamente più bassa a 18,2 battiti/10 s rispetto ai pesci CR con 22,6 battiti/10 s, ma non c'era differenza tra i due gruppi a 14 dpf con frequenze di 23,5-23,8 battiti/10 s. Il tasso di sopravvivenza dei pesci GF a 7 dpf era lo stesso dei pesci CR all'86,7%, ma è diminuito al 60% a 14 dpf rispetto all'80% dei pesci CR. Tuttavia, i tassi di sopravvivenza dei pesci GF e CR sono diminuiti al 25%-10% dopo il periodo di apertura della bocca quando hanno acquisito capacità o abitudini alimentari. L'incapacità di mantenere lo stato sterile dei pesci è stata una delle ragioni del basso tasso di sopravvivenza. Pertanto, l'alimentazione e il mantenimento dei nutrienti dalla fase giovanile a quella della prima età adulta sono sfide critiche nell'allevamento ittico.
Un altro fattore chiave che influenza la crescita e lo sviluppo dei pesci è l'alimentazione. In questo studio, esploriamo diversi metodi per ottenere GF Artemia come cibo vivo per larve di pesce zebra GF a lungo termine per giovani e adulti (processo mostrato nella Figura 2). A causa dell'uso quotidiano di mangime per pesci GF, il protocollo ottimizzato per GF Artemia dovrebbe essere facile, veloce ed economico nella pratica. Dopo aver confrontato il movimento attivo e la morte/immobilità dei naupli osservati al microscopio, le caratteristiche dei naupli, le uova non schiuse e il guscio, il metodo viene perfezionato. Dopo l'incubazione giornaliera, sono stati osservati e misurati al microscopio gli indici di GF Artemia fresca ottenuti dalle bottiglie, tra cui il tasso di schiusa, sopravvivenza e deformità, la lunghezza e il peso dei naupli (Figura 3). Dopo il trattamento, il tasso di schiusa delle cisti di Artemia era elevato, con una media dell'88,15%, la sopravvivenza dei naupli nuotatori era del 77,83% e il tasso di malformazione era dell'1,87%. La lunghezza del corpo dei naupli era di 546,70 μm e l'indice di peso corporeo era di 3,80 mg/100, che sono adatti per la cattura e l'alimentazione dei pesci dal periodo di apertura del mese delle larve agli stadi giovanili e adulti.
Il rilevamento di GF fish e GF Artemia è importante anche per il mantenimento del modello. In base alla raccolta del campione e ai molteplici metodi di test, i risultati possono fornire il successo degli embrioni di zebrafish trattati e delle cisti di Artemia nella piastra coltivata e nel terreno liquido (Figura 4). I vari campioni raccolti giornalmente devono essere rilevati come sterili in tutti i metodi di prova, che possono quindi indicare i modelli GF al momento della raccolta. L'artemia GF deve essere rilevata prima di nutrirsi con pesci GF, oppure i risultati della piastra e dell'incubatrice media devono riferirsi allo stato sterile dei naupli vivi freschi. Cioè, coltivare GF Artemia da cisti su piastre TSA o vetro medio liquido TSB o BHI in incubazione con agitazione, che potrebbe essere utilizzato per generare GF Artemia e verifica sterile allo stesso tempo. Il protocollo GF Artemia può ospitare un numero limitato di larve per l'alimentazione. Durante il processo di alimentazione, era evidente che la GF Artemia nuotava all'interno del GZM e poi veniva catturata e consumata dalle larve di pesce GF.
Le applicazioni dei modelli di pesce GF coinvolgono vari campi della biologia e della medicina, consentendo lo studio delle funzioni microbiche, della crescita e dello sviluppo, dei meccanismi della malattia e dello screening di probiotici o farmaci, tra gli altri46. In questo studio, ad esempio, due importanti batteri intestinali, Aeromonas sp. e Vibrio sp., sono stati isolati dal pesce zebra. Sono state eseguite le caratteristiche e l'identificazione della colonia e sono state misurate molteplici funzioni metaboliche in vitro utilizzando kit disponibili in commercio (Figura 5). Questi batteri sono stati isolati e identificati con il sequenziamento 16S e i risultati dell'esplosione sono stati presentati in un precedente rapporto42. I ceppi batterici identificati consentono la ricerca scientifica sull'impatto del microbiota singolo o combinato sulla salute dell'ospite infettando i modelli di pesci GF. La trasparenza delle larve di pesce consente l'osservazione di cellule batteriche marcate con fluorescenza utilizzando coloranti CM-Dil, rivelando la colonizzazione e la distribuzione nell'intestino dei pesci GF (mostrato in Figura 6). Dopo l'infezione batterica a 5 dpf, le larve di pesce zebra GF possono essere visualizzate con un microscopio a fluorescenza e osservate continuamente da 6 a 14 dpf, fornendo informazioni sulle funzioni microbiche combinate con indici di sviluppo, cambiamenti istopatologici e alterazioni molecolari47.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig01.jpg"> Figura 1: Protocollo del pesce zebra GF dagli embrioni alle larve e ai giovani. I passaggi chiave nella generazione del pesce zebra GF includono: (1) Raccolta di embrioni da pesce zebra wild-type e posizionamento in AB-GZM. (2) Trattamento di risciacquo con agenti PVP-I e NaClO per garantire la completa sterilità. (3) Coltura di embrioni/larve GF in piastre a 6 pozzetti con GZM, rinnovando il terreno quotidianamente. (4) Regolazione delle condizioni di coltura per una crescita e uno sviluppo ottimali. (5) Campionamento in varie fasi di sviluppo, seguito da test di sterilità con metodi su piastra e mezzo liquido. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig02.jpg"> Figura 2: Protocollo della preparazione dell'artemia GF come cibo vivo per i pesci GF. I passaggi chiave includono: (1) Trattamento di risciacquo delle cisti artemiche per la completa sterilità. (2) Preparazione di cisti GF nel terreno. (3) Incubazione in soluzione salina per 24 ore per favorire la schiusa. (4) Filtrazione della mancata schiusa e delle uova vuote per raccogliere i naupli attivi. (5) Lavaggio dei naupli raccolti per rimuovere i detriti, garantendo alimenti vivi di alta qualità e privi di contaminanti. (6) Test di sterilità dell'artemia GF prima dell'alimentazione delle larve di pesce GF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig03.jpg"> Figura 3: Indici di cisti e naupli di Artemia GF incubati per 24 ore. (A) Cisti di Artemia non trattate con pellicola di impurità (barra della scala: 500 μm). (B) Cisti di artemia trattate con una superficie leggermente convessa dopo l'assorbimento d'acqua e un aspetto più pulito (barra graduata: 500 μm). (C) Esame microscopico di naupli di Artemia GF vivi appena incubati (barra della scala: 2000 μm) e (D) ingrandimento con una barra della scala di 1000 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig04.jpg"> Figura 4: Rilevamento sterile di pesci GF in ogni fase della vita e GF Artemia. (A) Test sterili di campioni di pesce CR e GF utilizzando terreno liquido TSB e BHI, TSA e piastre di sangue in condizioni aerobiche e anaerobiche. (B) Test sterili di cisti artemiche non trattate, cisti di artemia GF e naupli utilizzando terreno liquido TSB e BHI, TSA e piastre di sangue in condizioni aerobiche e anaerobiche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig05.jpg"> Figura 5: Isolamento e identificazione dei batteri intestinali nel pesce zebra. (A) Ceppi batterici, caratteristiche delle colonie, mappe di sequenziamento 16S (esempi: Aeromonas sp. e Vibrio sp.). (B) Genere e accessioni NCBI. (C) Funzioni metaboliche di batteri isolati dall'intestino del pesce zebra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66512/66512fig06.jpg"> Figura 6: Infezione e colonizzazione di ceppi di batteri intestinali nel pesce zebra GF. (A) Recupero di ceppi batterici isolati e identificati per esperimenti di infezione. (B) Marcatura di batteri con coloranti fluorescenti e infezione di larve di pesce zebra GF a 5 dpf. Ingrandimento: 1x. (C) Osservazione della distribuzione e della colonizzazione dei batteri (Vibrio sp.) nei tessuti intestinali in vivo. Ingrandimento: 3x. (D) Conteggio delle CFU di batteri (Aeromonas sp. e Vibrio sp.) in ciascuna larva di pesce mediante campionamento giornaliero. I dati presenti significano ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/66512fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Primer</td>
			<td>Sequenze (5'-3')</td>
			<td>Lunghezza del prodotto</td>
		</tr><tr><td>27F</td>
			<td>AGAGTTTGATCMTGGCTCAG</td>
			<td rowspan="2">1465 punti base</td>
		</tr><tr><td>1492R</td>
			<td>ACGGYTACCTTGTTACGACTT</td>
		</tr><tr><td>63F</td>
			<td>CAGGCCTAACACATGCAAGTC</td>
			<td rowspan="2">1324 punti base</td>
		</tr><tr><td>1387R</td>
			<td>GGGCGGWGTGTACAAGGC</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Primer utilizzati per la rilevazione batterica.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Componenti</td>
			<td>Unità</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr><tr><td>Taq DNA polimerasi</td>
			<td>2,5 U/μL</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>10× tampone (mg2+)</td>
			<td>---</td>
			<td>2.1</td>
		</tr><tr><td>Miscela dNTP</td>
			<td>2,5 mM</td>
			<td>1.6</td>
		</tr><tr><td>Primer 27F</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Primer 1492R</td>
			<td>10 μM</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Senza DNA/RNA H2O</td>
			<td>---</td>
			<td>13.2</td>
		</tr><tr><td>DNA modello</td>
			<td>---</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>Volume totale</td>
			<td>---</td>
			<td>20</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Concentrazione finale e volume dei componenti per reazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Passo</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Ore</td>
			<td>Cicli</td>
		</tr><tr><td>Denaturazione iniziale</td>
			<td>95 °C</td>
			<td>4 minuti</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>Denaturazione</td>
			<td>94 °C</td>
			<td>1 minuto</td>
			<td rowspan="3">35</td>
		</tr><tr><td>Ricottura</td>
			<td>55 °C</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>Estensione</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>1 minuto</td>
		</tr><tr><td>Estensione finale</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>10 minuti</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td>Tenere</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>∞</td>
			<td>--</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Programma PCR per l'amplificazione del gene 16S rRNA.
Figura 1 supplementare: Gli indici critici di sviluppo dei modelli di zebrafish GF e CR. (A) Il tasso di schiusa del pesce zebra CR e GF a 72 hpf, e (B) battiti cardiaci/10 s dei pesci CR e GF a 7 dpf e 14 dpf. I tassi di sopravvivenza (%) dei pesci CR e GF sono diminuiti da 7 giorni e 14 giorni con l'86%, 60%-80% a 10%-25% a 30 dpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66512/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo delinea i passaggi principali per ottenere embrioni di pesce privi di germi (GF) e mantenerli dalle larve fino allo stadio giovanile, compreso il campionamento e il rilevamento del loro stato di sterilità. L'uso di modelli GF con infezione è importante per comprendere il ruolo dei microbi nella salute dell'ospite.

Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Lo scopo di questa ricerca è la generazione di nuovi modelli animali privi di germi, che saranno strumenti utili e potenti nello studio di varie funzioni del microbioma. In questo campo, i primi modelli di pesci privi di germi sono stati utilizzati di recente, ma i modelli a lungo termine sono ancora limitati a causa delle varie condizioni di coltura e della difesa dello sviluppo del personale. Gli attuali modelli di pesci GF sono normalmente quelli dei primi anni di vita.Pertanto, le tecnologie tra cui la bilancia sterile, i metodi di rilevamento dei campioni e la fornitura di cibo sterile sono sfide molto importanti da superare. Il modello di pesce zebra privo di germi è fondamentale per studiare l'interazione ospite-microbiota e il loro impatto sullo sviluppo, sull'immunità e sulla malattia. Questo modello consente ai ricercatori di manipolare con precisione i singoli batteri intestinali e osservarne l'effetto sugli embrioni trasparenti di pesce zebra.Fornisce preziose informazioni sui ruoli dei microbi intestinali che ereditano la malattia. In futuro, la nostra ricerca si concentrerà principalmente sulla creazione di un modello di zebrafish privo di germi per l'intero ciclo di vita per comprendere meglio la funzione del microbioma intestinale.

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