Valutazione in tempo reale del Ca2+ assoluto, citosolico, libero e della corrispondente contrattilità in vasi linfatici isolati e pressurizzati
22 marzo 2024
Questo protocollo descrive un metodo per misurare simultaneamente il calcio libero [Ca2+]i e il diametro dei vasi nei vasi linfatici in contrazione in tempo reale e quindi calcolare le concentrazioni assolute di Ca2+ e i parametri di contrattilità/ritmicità. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il Ca2+ e la dinamica contrattile in una varietà di condizioni sperimentali.
Studiamo i meccanismi di contrazione dei vasi linfatici e del flusso linfatico per comprendere meglio la patologia alla base del linfedema correlato al cancro, nonché la connessione tra il sistema linfatico e l'ipertensione. Il nostro obiettivo è identificare bersagli terapeutici all'interno del sistema vascolare linfatico in modo da poter sviluppare nuovi trattamenti per le malattie linfatiche. Recenti scoperte di diversi canali dell'ang nel muscolo linfatico e nelle cellule endoteliali, che contribuiscono alla dinamica del calcio sottostante, si sono dimostrate determinanti per far avanzare il campo.
I vasi isolati e il microscopio intravitale sono state tecniche cruciali per lo studio delle funzioni dei vasi linfatici. Più recentemente, c'è stata una tendenza all'aumento dell'uso di organi su chip e vasi microfabbricati per studiare molti aspetti della biologia linfatica. Le sfide delle dimensioni molto ridotte dei tessuti, lo studio della vascolarizzazione linfatica, richiedono molto tempo, pazienza e lo sviluppo di nuove tecnologie.
L'indisponibilità di marcatori specifici per le cellule muscolari linfatiche è un altro ostacolo per l'intera comunità scientifica. Il vantaggio di questo protocollo è la capacità di misurare le contrazioni linfatiche e le concentrazioni assolute di calcio all'interno dello stesso vaso. Ciò fornisce ulteriori informazioni sulla segnalazione del calcio, sui meccanismi di contrazione e sulla capacità di misurare i confronti di base tra i gruppi di trattamento.
Rispetto ad altre tecniche che possono basarsi su cambiamenti relativi nel calcio o sui vasi paralizzati.
Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per misurare in tempo reale le concentrazioni di calcio citosolico e il diametro dei vasi linfatici in contrazione. Permette lo studio della dinamica del calcio e della contrattilità in diverse condizioni sperimentali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia vascolare
- Segnalazione del calcio
Sfondo
- Comprendere le contrazioni dei vasi linfatici è fondamentale per affrontare il linfedema correlato al cancro.
- Le scoperte recenti sui canali ionici hanno fatto progredire il campo della biologia linfatica.
- Tecniche come l'isolamento dei vasi e la microscopia intravitale sono essenziali per lo studio delle funzioni linfatiche.
- Le sfide includono le ridotte dimensioni del tessuto e la mancanza di marcatori specifici per le cellule muscolari linfatiche.
Scopo dello studio
- Identificare bersagli terapeutici all'interno della vascolarizzazione linfatica.
- Sviluppare nuovi trattamenti per le malattie linfatiche.
- Fornire informazioni sui meccanismi di segnalazione del calcio e di contrazione.
Metodi Utilizzati
- Isolamento e cannullatura dei vasi linfatici mesenterici da ratti eutanasati.
- Misurazione del diametro del vaso e delle concentrazioni di calcio mediante microscopia a fluorescenza.
- Utilizzo di reagenti specifici per visualizzare la dinamica del calcio.
- Applicazione di pressione per mantenere condizioni fisiologiche durante gli esperimenti.
Risultati principali
- È stata ottenuta una misurazione simultanea delle concentrazioni di calcio e del diametro del vaso.
- Il protocollo consente confronti di base tra gruppi sottoposti a trattamento.
- Sono state ottenute informazioni sui meccanismi della contrazione.
- È stata dimostrata una migliore comprensione della segnalazione del calcio nei vasi linfatici.
Conclusioni
- Questo metodo fornisce un approccio solido per lo studio della funzione dei vasi linfatici.
- Offre vantaggi rispetto alle tecniche basate su variazioni relative del calcio.
- Il protocollo può facilitare future ricerche in biologia linfatica e nelle malattie correlate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione in tempo reale del Ca2+ libero citosolico e della contrattilità nei vasi linfatici isolati consente una valutazione meccanicistica dei rischi associati agli studi sulla funzione linfatica. Questo approccio basato su due parametri supporta una maggiore affidabilità predittiva nella validazione di bersagli terapeutici in ambito di patologie linfatiche e biologia vascolare. Il metodo fornisce una base solida per valutare la modulazione farmacologica della contrattilità linfatica e del segnale del calcio in modelli preclinici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette l'analisi diretta dei meccanismi contrattili dipendenti dal calcio nei vasi linfatici.
- Supporta la validazione funzionale delle proteine bersaglio correlando l'attività dei canali ionici con la contrattilità del vaso.
- Facilita la riduzione del rischio meccanicistico per i bersagli candidati che influenzano il tono linfatico e il flusso.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce letture quantitative e validate sia della dinamica del Ca2+ sia dei parametri contrattili per lo sviluppo di saggi.
- Permette confronti riproducibili tra gruppi di controllo e trattati mediante misurazioni assolute.
- Consente lo screening di agenti farmacologici per valutarne gli effetti sulla contrattilità linfatica e sul segnale del calcio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli preclinici a endpoint funzionali del sistema linfatico pertinenti alla malattia.
- Permette lo sviluppo di biomarcatori traslazionali collegando il segnale di Ca2+ a fenotipi contrattili.
- Supporta la progressione terapeutica mirata al sistema linfatico con valutazione del rischio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si integra nel percorso dalla scoperta allo sviluppo preclinico di farmaci per il sistema linfatico e vascolare, supportando sia studi meccanicistici sia analisi farmacologiche.
- Biologia della scoperta: Quantifica la relazione tra segnalazione del Ca2+ e contrattilità linfatica per la verifica delle ipotesi.
- Screening: Fornisce output standardizzati e quantitativi per la valutazione di composti e la riproducibilità dei saggi.
- Analisi: Offre misurazioni assolute in tempo reale delle variabili dipendenti per un'analisi statistica solida.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati meccanicistici ottenuti in vitro con modelli di malattia in vivo attraverso endpoint funzionali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione di diversi modulatori della funzione linfatica.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi e nella comprensione meccanicistica della contrattilità linfatica.
- Valore operativo: Standardizza la misurazione dei principali parametri fisiologici per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Orienta le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati quantitativi ancorati a basi meccanicistiche.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi degli obiettivi linfatici e vascolari nei primi stadi dei processi di sviluppo.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento dei vasi, nell'immagine di fluorescenza e nell'analisi quantitativa.
- Richiede strumentazione specializzata, inclusi microscopi a fluorescenza e software per il rilevamento dei margini.
- Necessita di una standardizzazione tra gruppi diversi dei protocolli di calibrazione e misurazione.
- L'adattamento ad altri tipi di vasi o specie potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo.
- La ridotta dimensione del tessuto e la mancanza di marcatori specifici rappresentano sfide pratiche per un'adozione più ampia.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:53
Setting Up the Perfusion Chamber to Measure Contractility in Isolated, Pressurized Lymph Vessels
2:34
Isolation and Cannulation of Mesenteric Lymph Vessels to Measure Cytosolic, Free Calcium and Vessel Diameter in Contracting Lymph Vessels
4:29
Measurement of the Absolute Concentrations of [Ca2+i2+]i in Isolated, Pressurized Lymph Vessels
