Name: Misurazione quantitativa della lunghezza dei telomeri PCR multiplex monocromatica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-22T14:50:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: Impara a misurare la lunghezza dei telomeri con MMqPCR per studi sull'invecchiamento cellulare in campioni di DNA umano. Questo metodo offre precisione e riproducibilità per ricerche di popolazione.

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<meta charset="utf8"></head><body>Valutazione accurata della lunghezza dei telomeri negli studi sulla popolazione umana

<ol><li>Hemann, M., Strong, M., Hao, L., Greider, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+shortest+telomere%2C+not+average+telomere+length%2C+is+critical+for+cell+viability+and+chromosome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The shortest telomere, not average telomere length, is critical for cell viability and chromosome stability.</a> Cell. 107 (1), 67-77 (2001).</li>
<li>Xu, L., Li, S., Stohr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+telomere+biology+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Pathol%3A+Mech+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of telomere biology in cancer.</a> Ann Rev Pathol: Mech Dis. 8, 49-78 (2013).</li>
<li>Lindrose, A., Drury, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimum+reporting+recommendations+for+pcr-based+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Telomere+Research+Network%22%5BJournal%5D)">Minimum reporting recommendations for pcr-based telomere length measurement.</a> Telomere Research Network. , (2020).</li>
<li>Verhulst, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commentary%3A+The+reliability+of+telomere+length+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Commentary: The reliability of telomere length measurements.</a> Int J Epidemiol. 44 (5), 1683-1686 (2015).</li>
<li>Aubert, G., Hills, M., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement-caveats+and+a+critical+assessment+of+the+available+technologies+and+tools%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement-caveats and a critical assessment of the available technologies and tools.</a> Mutat Res. 730 (1-2), 59-67 (2012).</li>
<li>Mundstock, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+obesity+on+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">Effect of obesity on telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Obesity. 23 (11), 2165-2174 (2015).</li>
<li>Haycock, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leucocyte+telomere+length+and+risk+of+cardiovascular+disease%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Leucocyte telomere length and risk of cardiovascular disease: Systematic review and meta-analysis.</a> BMJ. 349, 4227(2014).</li>
<li>Astuti, Y., Wardhana, A., Watkins, J., Wulaningsih, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoking+and+telomere+length%3A+A+systematic+review+of+84+studies+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Res%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoking and telomere length: A systematic review of 84 studies and meta-analysis.</a> Environ Res. 158, 480-489 (2017).</li>
<li>Ridout, K. K., Ridout, S. J., Price, L. H., Sen, S., Tyrka, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depression+and+telomere+length%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Affect+Disord%22%5BJournal%5D)">Depression and telomere length: A meta-analysis.</a> J Affect Disord. 191, 237-247 (2016).</li>
<li>Wang, Q., Zhan, Y., Pedersen, N. L., Fang, F., Hägg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+all-cause+mortality%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Telomere length and all-cause mortality: A meta-analysis.</a> Ageing Res Rev. 48, 11-20 (2018).</li>
<li>Hu, R., Hua, X. G., Jiang, Q. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+telomere+length+in+risk+and+recurrence+of+prostate+cancer%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Associations of telomere length in risk and recurrence of prostate cancer: A meta-analysis.</a> Andrologia. 51 (7), e13304(2019).</li>
<li>Schneider, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+telomere+length+with+risk+of+disease+and+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Inter+Med%22%5BJournal%5D)">Association of telomere length with risk of disease and mortality.</a> JAMA Inter Med. 182 (3), 291-300 (2022).</li>
<li>Deng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+and+the+risk+of+cardiovascular+diseases%3A+A+mendelian+randomization+study%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Telomere length and the risk of cardiovascular diseases: A mendelian randomization study.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 1012615(2022).</li>
<li>D'mello, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+shortened+leukocyte+telomere+length+and+cardiometabolic+outcomes%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%3A+Cardiovasc+Gene%22%5BJournal%5D)">Association between shortened leukocyte telomere length and cardiometabolic outcomes: Systematic review and meta-analysis.</a> Circulation: Cardiovasc Gene. 8 (1), 82-90 (2015).</li>
<li>Wilbourn, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+telomere+length+and+mortality+risk+in+non-model+vertebrate+systems%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The relationship between telomere length and mortality risk in non-model vertebrate systems: A meta-analysis.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160447(2018).</li>
<li>Gardner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gender+and+telomere+length%3A+Systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Gender and telomere length: Systematic review and meta-analysis.</a> Exp Gerontol. 51, 15-27 (2014).</li>
<li>Lai, T. -P., Wright, W. E., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+telomere+length+measurement+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Comparison of telomere length measurement methods.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 373 (1741), 20160451(2018).</li>
<li>Cawthon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+measurement+by+quatitative+pcr%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere measurement by quatitative pcr.</a> Nuc Acid Res. 30 (10), e47-e53 (2002).</li>
<li>Cawthon, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+measurement+by+a+novel+monochrome+multiplex+quantitative+pcr+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative pcr method.</a> Nuc Acid Res. 37 (3), e21-e21 (2009).</li>
<li>Lindrose, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+comparison+studies+of+telomere+length+measurement+using+qpcr+approaches%3A+A+critical+appraisal+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Method comparison studies of telomere length measurement using qpcr approaches: A critical appraisal of the literature.</a> PLoS One. 16 (1), e0245582(2021).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DNA+extraction%2C+DNA+integrity%2C+and+laboratory+on+the+precision+of+qpcr-based+telomere+length+measurement+-+a+multi-lab+impartial+study%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Effects of DNA extraction, DNA integrity, and laboratory on the precision of qpcr-based telomere length measurement - a multi-lab impartial study.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ph+and+ionic+strength+on+the+spectrophotometric+assessment+of+nucleic+acid+purity%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Effect of ph and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity.</a> Biotechniques. 22 (3), 474-481 (1997).</li>
<li>Boesenberg-Smith, K. A., Pessarakli, M. M., Wolk, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+DNA+yield+and+purity%3A+An+overlooked+detail+of+pcr+troubleshooting%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Newsletter%22%5BJournal%5D)">Assessment of DNA yield and purity: An overlooked detail of pcr troubleshooting.</a> Clin Microbiol Newsletter. 34 (1), 1-6 (2012).</li>
<li>Harley, C. B., Futcher, A. B., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeres+shorten+during+ageing+of+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts.</a> Nature. 345 (6274), 458-460 (1990).</li>
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<li>Dagnall, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pre-analytic+variables+on+the+reproducibility+of+qpcr+relative+telomere+length+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of pre-analytic variables on the reproducibility of qpcr relative telomere length measurement.</a> PLoS One. 12 (9), e0184098(2017).</li>
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</ol>

I telomeri sono complessi protettivi che si trovano all'estremità di tutti i cromosomi eucariotici, composti da sequenze di DNA ripetitive altamente conservate e proteine associate. Il telomero protegge l'integrità del DNA, preservando la stabilità cromosomica. L'accorciamento progressivo dei telomeri si verifica nelle cellule in divisione a causa di una sintesi incompleta del DNA a filamento ritardato, danni al DNA e altri fattori 1,2. L'aumento delle prove a sostegno della lunghezza dei telomeri (TL) come biomarcatore dell'invecchiamento e delle malattie legate all'età nel corso della vita umana è stato accompagnato da un aumento dei tipi di saggi di misurazione della TL utilizzati per valutare il ruolo della TL negli studi sull'esposizione, la malattia e la salute umana 3,4,5. Le meta-analisi hanno riportato associazioni di TL con la mortalità complessiva, le esposizioni ambientali e gli esiti di salute, tra cui cancro, malattie cardiovascolari e diabete 6,7,8,9,10,11,12,13 . Queste meta-associazioni derivano da studi che utilizzano una delle oltre due dozzine di diverse metodologie di misurazione del TL in cui i punti di forza delle associazioni tendono a variare tra le diverse metodologie 14,15,16. La selezione del metodo di misurazione TL ottimale per uno studio di ricerca è un passo cruciale per garantire risultati accurati, poiché ogni metodo possiede i propri vantaggi e svantaggi 5,17.
A causa del costo relativamente basso dei reagenti, della rapida inversione di tendenza dei saggi, della scalabilità e del minore fabbisogno iniziale di DNA, le tecniche di misurazione TL basate sulla PCR sono spesso utilizzate preferenzialmente quando si conducono studi con grandi popolazioni di campioni, studi con accesso limitato a campioni con alte concentrazioni di DNA o studi che danno priorità a un'elevata produttività. Il primo metodo di misurazione della TL basato sulla PCR, la reazione a catena della polimerasi quantitativa singleplex (qPCR) originariamente sviluppata da Richard Cawthon, utilizza il rapporto tra i segnali di fluorescenza del telomero (T) e l'amplificazione del gene a copia singola (S), eseguita su piastre PCR separate18. In questo approccio, primer complementari alle sequenze ripetute di DNA dei telomeri (T) vengono utilizzati per amplificare il contenuto totale di DNA telomerico nel campione e quantificato mediante rilevamento del reporter fluorescente SYBR green. Allo stesso modo, per quantificare il numero di copie del genoma vengono utilizzati primer complementari a una regione intergenica di un gene a copia singola (S) conservato. Queste due stime sono quantificate rispetto a una curva standard del DNA genomico utilizzata in tutti i saggi in un progetto per controllare la variazione da piastra a piastra. Dividendo il DNA telomerico totale (T) per il numero di copie del genoma singolo (S) si ottiene il rapporto T/S, una misura relativa senza unità che rappresenta il contenuto telomerico medio per cellula per un singolo campione di DNA18,19. Pertanto, il rapporto T/S non è una misura specifica della lunghezza funzionale; tuttavia, coerentemente con le norme della letteratura, utilizziamo il termine TL medio per campione in tutto questo protocollo.
Questo metodo è stato avanzato nel 2009 quando Richard Cawthon ha descritto il test qPCR multiplex monocromatico (MMqPCR) come un approccio per ridurre potenzialmente la variabilità del rapporto T/S rispetto al metodo qPCR singleplex originale19. Il test MMqPCR possiede i vantaggi del test qPCR con l'ulteriore vantaggio di misurare i segnali T e S all'interno dello stesso pozzetto di reazione utilizzando un fluoroforo di segnalazione, riducendo così l'errore relativo alla qPCR singleplex e ottenendo una maggiore precisione e riproducibilità19. Inoltre, questo metodo multiplex riduce potenzialmente i costi e migliora la produttività, poiché è necessaria la metà delle reazioni rispetto al saggio singleplex19.
Dati i vantaggi della misurazione MMqPCR TL, questo metodo è adatto per studi basati sulla popolazione delle associazioni di TL con esposizioni, esiti sanitari e processi biologici. Tuttavia, l'avvio del metodo può essere impegnativo. Per affrontare queste sfide, descriviamo in dettaglio il protocollo di misura MMqPCR TL utilizzato nel nostro laboratorio, evidenziando i passaggi chiave implementati per aumentare la precisione del saggio, ridurre il rischio di contaminazione e migliorare la ripetibilità.
Inoltre, questo protocollo delinea i passaggi per la pulizia dei dati e il calcolo del coefficiente di correlazione intraclasse (ICC), un'importante misura statistica della riproducibilità delle misurazioni TL2. Con i nostri risultati rappresentativi, dimostriamo la capacità di generare ICC elevati utilizzando questo protocollo. Inoltre, identifichiamo le fasi di controllo qualità (QC) e di risoluzione dei problemi che dovrebbero ridurre la variazione nelle misurazioni TL e aumentare l'ICC risultante. Grazie all'elevata ripetibilità, efficienza ed economicità di questo metodo, la misurazione MMqPCR TL è ideale per la ricerca epidemiologica TL. La Figura 1 fornisce una panoramica visiva del metodo MMqPCR come descritto in questo protocollo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig01v2.jpg"> Figura 1: Panoramica del metodo. Un'ampia panoramica del metodo di reazione a catena quantitativa della polimerasi multiplex monocromatica per misurare la lunghezza dei telomeri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Provette da 0,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1605-0099</td><td>Provette per microcentrifuga Seal-Rite da 0,5 mL, sterili Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Provette da 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5599</td><td>Seal-Rite Provette per microcentrifuga da 1,5 mL, sterili Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>100 mM DTT</td><td>In casa</td><td>Non applicabile</td><td>Realizzato con DTT di serie, acetato di sodio diluito e PCR Grado H2O Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C&nbsp;</td></tr>Provette da <tr><td>15 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-959-53A</td><td>Corning 352196 Falcon 15 ml Provette da centrifuga coniche Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td>Thermo Fisher</td><td>50152107</td><td>Biotang Inc 1 M MgCl2 Soluzione di cloruro di magnesio da 1 M, preparata in acqua da 18,2 megaohm e filtrata con filtro da 0,22 micron Temperatura e condizioni di conservazione: 4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>1x Tampone d'oro</td><td>in casa</td><td>non applicabile</td><td>10x Tampone d'oro diluito con grado PCR H2O Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>25mM dNTP</td><td>New England BioLabs</td><td>N0446S</td><td>Set di soluzioni di deossinucleotidi Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette da 5 ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>3391276</td><td>Argos Technologies Provette per microcentrifuga - 5 ml Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti Piastre</td> per <td>PCR a 96 pozzetti Bio-Rad HSP9601 Hard-Shell, a basso profilo, a parete sottile, bordate, bianche / trasparenti Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Deposito per ufficio</td><td>3489072</td><td>Reynolds Wrap Stanard Rotolo di foglio di alluminio, 12" x 75', argento Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold Kit &ndash; Polimerasi e tampone</td><td>Thermo Fisher</td><td>4311806</td><td>AmpliTaq Gold DNA Polimerasi con tampone d'oro e MgCl2 (MgCl2 in questo kit non viene utilizzato), 10X Gold Buffer, 2.5U AmpliTaq Gold Polymerase Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Betaina</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ77507AB</td><td>betaina, soluzione 5M, grado di biologia molecolare, ultrapura, 10mL Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Rack per provette grandi</td><td>Thermo Fisher</td><td>344817</td><td>Fisherbrand Rack per provette a 4 vie Fisherbrand Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Software CFX Maestro</td><td>Bio-Rad</td> 12004110 <td>per l'impostazione di piastre PCR in tempo reale, la raccolta dati, le statistiche e la rappresentazione grafica dei risultati Temperatura e condizioni di conservazione:</td><td></td></tr><tr><td>Modulo di reazione ottica CFX96 a temperatura ambiente per sistemi PCR in tempo reale con pacchetto iniziale</td><td>Bio-Rad</td><td>1845096</td><td>modulo ottico a 96 pozzetti per PCR in tempo reale Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ1539706</td><td>Ditiotreitolo, grado di biologia molecolare >99,5+, 5 g Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C&nbsp;</td></tr><tr><td>ELIMINase</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-32</td><td>ELIMINase Decontaminante da laboratorio Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Filtro HEPA</td> a temperatura ambiente Filtri di ricambio <td>USA Scientific</td><td>Filtro antiparticolato ad alta efficienza per workstation AirClean Temperatura e condizioni di stoccaggio: Temperatura ambiente</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Thermo Fisher</td><td>06666A</td><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Tergicristalli per attività delicate, 1 strato Temperatura e condizioni di stoccaggio: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Canale di caricamento Thermo</td><td>Fisher</td><td>14387069</td><td>Thermo Scientific Serbatoi di reagenti a matrice Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td></td><td>Microsoft Non applicabile</td><td>Pacchetto Microsoft 365, applicazione software Excel Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td> a temperatura ambiente Mini centrifuga <td>Genesee Scientific</td><td>31-500B</td><td>Poseidon 31-500B, coperchio blu Temperatura e condizioni di conservazione: PCR a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Grado H2O</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9937</td><td>Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC) Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Cappa PCR</td><td>USA Scientific</td><td>4263-2588</td><td>Stazione di lavoro per acidi nucleici con filtrazione HEPA, sistemi AirClean Combinazione PCR Workstation Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Strisce PCR</td> a temperatura ambiente <td>Thermo Fisher</td><td>AB0776</td><td>Provette a basso profilo e tappi piatti, strisce da 8 Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Rack per provette PCR</td> a temperatura ambiente <td>Thermo Fisher</td><td>344820</td><td>Fisherbrand Rack per provette PCR a 96 pozzetti Temperatura e condizioni di conservazione: Puntali</td></tr> per pipette a temperatura ambiente <tr><td>(multicanale)</td><td>Puntali</td> per pipette <td>Ranin 17005860</td><td>SR LTS 20&micro; L F 960A/5, 20&micro; L Massimo Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (canale singolo)</td><td>USA Scientific</td><td>1181-3850</td><td>10&micro; L Puntali con filtro Graduate TipOne RPT Temperatura e condizioni di conservazione: Puntali</td></tr><tr><td>per pipette a temperatura ambiente (canale singolo)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1850</td><td>20&micro; L Puntali con filtro TipOne RPT Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Puntali per pipette a temperatura ambiente (canale singolo)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0880</td><td>200&micro; L Natural TipOne Puntali per pipette in rack Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Puntali per pipette (canale singolo)</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2890</td><td>1000&micro; L Puntali per pipette Tip One graduati naturali in rack Temperatura e condizioni di conservazione: Pipettatori a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>(multicanale)</td><td>Pipetta multiplo Ranin</td><td>17013802</td><td>Pipet-Lite L8-10XLS, da 0,5 a 10&micro; L Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Pipettatori a temperatura ambiente (multicanale)</td><td>Ranin</td><td>17013803</td><td>Pipet-Lite Multi Pipette L8-20LS+, da 2 a 20&micro; L Temperatura e condizioni di conservazione: Pipettatori a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>(canale singolo)</td><td>Pipette classiche Thermo Fisher</td><td>F144802G</td><td>Gilson Pipetman, da 1 a 10&micro; L Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Pipettatori a temperatura ambiente (canale singolo)</td><td>Pipette classiche Thermo Fisher</td><td>F123600</td><td>Gilson Pipetman, da 2 a 20&micro; L Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Pipettatori a temperatura ambiente (canale singolo)</td><td>Pipette classiche Thermo Fisher</td><td>F123601</td><td>Gilson Pipetman, da 20 a 200&micro; L Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Pipettatori a temperatura ambiente (canale singolo)</td><td>Pipette Thermo Fisher</td><td>F123602</td><td>Gilson Pipetman Classic, da 200 a 1000&micro; L Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Pellicola sigillante per piastre</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>Microseal " B&rdquo; Pellicola sigillante per piastre PCR, adesivo, ottico Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Piastra Spinner</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-100-141</td><td>Fisherbrand Mini centrifuga centrifuga per piastre, 230 V Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Filtro pre-cappa</td><td>USA Scientific</td><td>4235-3724</td><td>Prefiltro per sistemi AirClean Workstations Temperatura e condizioni di conservazione: Stanza temperatura</td></tr><tr><td>R Software</td><td>Il progetto R per il calcolo statistico</td><td>Non applicabile</td><td>R versione 4.2.2 Temperatura e condizioni di stoccaggio: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-922-329</td><td>OHAUS 30430060 Bilancia analitica serie PR, 62 g Capacità Temperatura e condizioni di stoccaggio: Forbici a temperatura ambiente</td></tr><tr><td></td><td>Deposito 458612</td><td></td><td>Forbici di marca Office Depot, 8", dritte, nere, confezione da 2 Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td></td><td>Sharpies Sharpie</td><td>2151734</td><td>Pennello Pennarelli indelebili gemelli, nero Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Copia singola Gene Forward Primer</td><td>Tecnologie DNA integrate Personalizzato</td><td></td><td>Vedere la tabella separata Temperatura e condizioni di stoccaggio: meno 20 &deg; C quando reidratato</td></tr> Single <tr><td>Copy Gene Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td> Custom <td>Vedi tabella separata Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C quando reidratato</td></tr> Small <tr><td>Tube Rack</td><td>Thermo Fisher</td><td>21-402-17</td><td>Thermo Fisher 8601 Rack reversibili per microprovette con coperchio Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Thermo Fisher</td><td>J63560. EQE</td><td>3M NaOAc pH 5.2 Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Spatola in acciaio inox</td><td>Thermo Fisher</td><td>3990240</td><td>Bel-Art SP Scienceware Cucchiaio di campionamento e spatola in acciaio inossidabile Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>SYBR Green I Colorazione in gel per acido nucleico - 10.000X Concentrato in DMSO Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 gradi C quando reidratato</td></tr><tr><td>Filtri per siringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-927-55A</td><td>GD/X Filtro per siringa sterile da 25 mm, mezzo di filtrazione in acetato di cellulosa, 0,2 &; m Temperatura e condizioni di conservazione:</td></tr><tr><td>Siringhe a temperatura ambiente Siringhe</td> monouso <td>Thermo Fisher</td><td>148232A</td><td>BD Luer-Lok senza aghi, 10mL Temperatura e condizioni di conservazione: Tampone TE a temperatura ambiente</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2474100</td><td>TE Buffer, Tris-EDTA, soluzione 1X, pH 7,6, biologia molecolare, Fisher BioReagents Temperatura e condizioni di conservazione: temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Telomere Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies Custom</td><td></td><td>Vedi tabella separata Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C quando reidratato</td></tr><tr><td>Telomere Reverse Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>Custom</td><td>Vedere la tabella separata Temperatura e condizioni di conservazione: meno 20 &deg; C quando reidratata</td></tr><tr><td>Luce UV</td><td>USA Scientific</td><td>4288-2540</td><td>Lampadina UV per postazioni di lavoro Temperatura e condizioni di stoccaggio: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-955-151</td><td>Fisherbrand Mini Vortex Mixer, 115 V, 50/60 Hz Temperatura e condizioni di stoccaggio: Temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Pesa barca</td><td>Thermo Fisher</td><td>01-549-752</td><td>Fisherbrand Barca di pesatura esagonale sterile, 10mL Temperatura e condizioni di conservazione: Temperatura ambiente</td></tr></tbody></table>

misurazione quantitativa della lunghezza dei telomeri pcr multiplex monocromatica 

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

I risultati presentati nella Tabella 4 e nella Tabella 5 offrono un esempio di misure TL altamente ripetibili ottenute seguendo il protocollo. Per questi risultati, il DNA è stato estratto da 24 campioni di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) utilizzando un kit commerciale secondo le linee guida dei produttori. Questi 24 campioni sono stati analizzati su due piastre da 96 pozzetti. Tutti i campioni di DNA sono stati controllati per verificarne la qualità tramite spettrofotometro e fluorimetro, utilizzando il rapporto medio 260/280, il rapporto medio 260/230 e la concentrazione di dsDNA per determinare l'idoneità al test e il fattore di diluizione del campione (Tabella 6). La Tabella 6 evidenzia anche l'importanza di quantificare la concentrazione di dsDNA, che può differire dalla concentrazione di DNA misurata utilizzando uno spettrofotometro. Questa variabilità è il risultato di diversi approcci alla quantificazione. In particolare, lo spettrofotometro ricava la concentrazione di DNA in base all'assorbimento a 280 nm ed è suscettibile alle fluttuazioni dovute a contaminanti (ad esempio, proteine, sale, ecc.) che influiscono sulle letture dell'assorbanza. Al contrario, le concentrazioni di dsDNA misurate utilizzando un fluorimetro sono determinate dalla fluorescenza di un colorante che si lega specificamente al dsDNA e, come tale, si presume che rifletta più accuratamente il contenuto di DNA. I campioni di DNA hanno subito fino a tre cicli di congelamento-scongelamento prima dell'analisi MMqPCR TL. Il DNA di controllo è stato creato da estrazioni di DNA raggruppate di PBMC da un individuo, che è stato utilizzato per creare una diluizione seriale a sette punti da 2 ng/μL a 0,0313 ng/μL di DNA. Le curve standard indipendenti create per la PCR Step 9 (amplicone dei telomeri) e il Step 12 (amplicone genico a copia singola, albumina in questo protocollo) sono presentate nella Figura 6A,B. I saggi sono stati eseguiti su un sistema commerciale di rilevamento PCR in tempo reale che ha generato una curva di fusione che mostra i singoli prodotti ampliconi prodotti a temperature distinte, come mostrato nella Figura 8.
Tabella 4: Dati di output dalla misurazione MMqPCR per risultati rappresentativi ottimali. Rapporti T/S medi, SD, CV e TL con punteggio Z per 24 campioni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%204_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 5: Output dei dati sulla lunghezza dei telomeri. I dati grezzi del test MMqPCR vengono analizzati nel software, quindi aggiunti al modello di foglio di calcolo allegato come file supplementare 1 per ulteriori analisi e controllo qualità. Questo foglio di output del modello TL presenta un riepilogo dei dati, visualizzando gli ID dei campioni, i TL medi, i SD e i CV per ciascun campione su entrambe le lastre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%205_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 6: Spettrofotometro e fluorimetro Metriche di qualità del DNA per i risultati dei campioni. Dati di controllo qualità derivanti dall'analisi dello spettrofotometro duplicato e dalla misurazione con fluorimetro singolare del dsDNA e di eventuali contaminanti per campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%206_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig08.jpg"> Figura 8: Esempio di curva di fusione. Curva di fusione per i dati del campione generati nel software. Il picco precedente di ~80 °C rappresenta l'amplicone dei telomeri e il picco secondario a ~89 °C rappresenta l'amplicone dell'albumina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per questo progetto, l'efficienza media dei telomeri è stata del 98,6% con un intervallo da 90,7 a 102,1 e l'efficienza media dell'albumina è stata del 102,3% con un intervallo da 93,6 a 108,2 in tutte le esecuzioni. C'è stata una media di 0,97 repliche rimosse dalle curve standard, che soddisfa i criteri QC di questo protocollo. Il CV medio interplacca è stato dell'1,83% con una SD di 0,00616 e il CV medio intraplate è stato del 3,78% con una SD di 0,00658. I TL medi per questi campioni rappresentativi sono presentati nella Tabella 4 e nella Tabella 5. La TL media era 1,37 con una SD di 0,24 e un intervallo da 0,84 a 2,32. Il rapporto T/S, SD, CV e TL con punteggio Z per campione sono elencati nella Tabella 4. Poiché l'output del rapporto T/S del test MMqPCR è una misura relativa di TL, i rapporti sono stati trasformati in questo punteggio Z per consentire il confronto tra studi. L'ICC per questo progetto è stato calcolato utilizzando lo script R come descritto dalle linee guida TRN presenti nel file supplementare 2, tenendo conto degli effetti batch ed run20. Al fine di calcolare l'ICC intra-progetto, abbiamo riesaminato il 10% dei campioni superati, assicurandoci di popolare le piastre ICC con almeno un campione da ciascuna piastra della coorte. L'ICC complessivo del progetto di 0,801 [CI: 0,703, 0,86] indica l'elevata riproducibilità dei risultati TL.
Non tutti i risultati saranno ottimali. I risultati nella Figura 9 e nella Tabella 7 mostrano risultati non ottimali dal test MMqPCR. La Figura 9 mostra una curva standard con un'efficienza dei telomeri inferiore al 90%, che è inferiore agli standard QC, che richiede la ripetizione dell'intera piastra. I problemi con l'efficienza del primer sono solitamente dovuti a un problema con i reagenti, quindi è importante tenere traccia delle date in cui i reagenti vengono aliquotati e quando scadono come primo passo per determinare quale reagente è responsabile della bassa efficienza. I reagenti scaduti devono essere sostituiti prima di riavviare la piastra. La tabella 7 mostra una piastra che ha superato i criteri di controllo qualità iniziali a livello di campione, ma presenta un alto livello di variabilità tra le piastre, con conseguente fallimento del controllo qualità a livello di piastra. La variazione tra le piastre è solitamente dovuta a errori nelle tecniche di pipettaggio e riempimento delle piastre. In questo caso, il tecnico deve valutare eventuali problemi verificatisi durante l'impostazione della piastra e assicurarsi che le pipette siano calibrate.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66545/66545fig09.jpg"> Figura 9: Risultati non ottimali. Questa curva standard visualizzata nel software non è riuscita a superare il QC, poiché l'efficienza di amplificazione per l'innesco dei telomeri era inferiore al 90%. L'immagine è di P1, ma P2 aveva efficienze altrettanto basse. Non è stato possibile utilizzare i dati di questa corsa e tutti i campioni hanno dovuto essere rianalizzati dopo aver sostituito il reagente causale scaduto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/66545fig09large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 7: Risultati non ottimali. Nella tabella viene visualizzato il modello di dati dei telomeri per un'esecuzione in cui molti dei campioni non sono riusciti a soddisfare gli standard QC. I campioni che dovevano essere rieseguiti sono stati determinati in base ai valori CV, quindi il nome del campione è stato modificato in un carattere rosso per una facile identificazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Table%207_RE.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Fascicolo supplementare 1: Modello di foglio di calcolo dei dati dei telomeri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%201.%20MMqPCR%20Template_RE.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Fascicolo supplementare 2: Calcolo ICC. Questo protocollo è stato creato dalla Telomere Research Network (TRN). Questo file è stato modificato da20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%202.%20ICC%20Calculation_RE.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Fascicolo supplementare 3: Linee guida per la segnalazione TRN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66545/Supplemental%20File%203.%20TRN%20Reporting%20Guidelines_RE.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Misurazione quantitativa della lunghezza dei telomeri PCR multiplex monocromatica 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

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Misurazione quantitativa della lunghezza dei telomeri PCR multiplex monocromatica

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