Name: Previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Impara il docking molecolare combinato con l'assay di shift termico cellulare per prevedere e validare le interazioni tra piccole molecole e bersagli proteici. Questo protocollo riduce tempi e costi garantendo alta riproducibilità.

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Questo lavoro è stato supportato dalla National Natural Science Foundation of China (82004031) e dal Sichuan Science and Technology Program (2022NSFSC1303). Esprimiamo il nostro grande apprezzamento a Jiayi Sun dell'Istituto Innovativo di Medicina e Farmacia Cinese, Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, per l'assistenza con il western blot.

Convalida dell'interazione di Xanthatin-Keap1 con Docking e CETSA

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<li>Du, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+protein-ligand+interactions%3A+mechanisms%2C+models%2C+and+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods.</a> Int J Mol Sci. 17 (2), 144(2016).</li>
<li>Wu, Q., Peng, Z., Zhang, Y., Yang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COACH-D%3A+improved+protein-ligand+binding+sites+prediction+with+refined+ligand-binding+poses+through+molecular+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COACH-D: improved protein-ligand binding sites prediction with refined ligand-binding poses through molecular docking.</a> Nucleic Acids Res. 46, W438-W442 (2018).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PROBselect%3A+accurate+prediction+of+protein-binding+residues+from+proteins+sequences+via+dynamic+predictor+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo%22%5BJournal%5D)">PROBselect: accurate prediction of protein-binding residues from proteins sequences via dynamic predictor selection.</a> Bioinfo. 36, i735-i744 (2020).</li>
<li>Kandel, J., Tayara, H., Chong, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PUResNet%3A+prediction+of+protein-ligand+binding+sites+using+deep+residual+neural+network%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cheminfo%22%5BJournal%5D)">PUResNet: prediction of protein-ligand binding sites using deep residual neural network.</a> J Cheminfo. 13 (1), 65(2021).</li>
<li>Dhakal, A., Mckay, C., Tanner, J. J., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+in+the+prediction+of+protein-ligand+interactions%3A+recent+advances+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Brief+Bioinform%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence in the prediction of protein-ligand interactions: recent advances and future directions.</a> Brief Bioinform. 23 (1), 476(2022).</li>
<li>Hatty, C. R., Banati, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-ligand+and+membrane-ligand+interactions+in+pharmacology%3A+the+case+of+the+translocator+protein+%28TSPO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Protein-ligand and membrane-ligand interactions in pharmacology: the case of the translocator protein (TSPO).</a> Pharmacol Res. 100, 58-63 (2015).</li>
<li>Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetry+and+thermodynamics+in+drug+design%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Calorimetry and thermodynamics in drug design.</a> Ann Rev Biophys. 37, 135-151 (2008).</li>
<li>Huang, S. Y., Zou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+protein-ligand+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mo+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in protein-ligand docking.</a> Int J Mo Sci. 11 (8), 3016-3034 (2010).</li>
<li>Li, J., Fu, A., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+scoring+functions+used+for+protein-ligand+interactions+in+molecular+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Interdiscip+Sci%22%5BJournal%5D)">An overview of scoring functions used for protein-ligand interactions in molecular docking.</a> Interdiscip Sci. 11 (2), 320-328 (2019).</li>
<li>Crampon, K., Giorkallos, A., Deldossi, M., Baud, S., Steffenel, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Machine-learning+methods+for+ligand-protein+molecular+docking%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Machine-learning methods for ligand-protein molecular docking.</a> Drug Discov Today. 27 (1), 151-164 (2022).</li>
<li>Pinzi, L., Rastelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+docking%3A+Shifting+paradigms+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery.</a> Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).</li>
<li>Abdolmaleki, A., Ghasemi, F., Ghasemi, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+drug+design+to+explore+cyclodextrin+therapeutics+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Drug+Des%22%5BJournal%5D)">Computer-aided drug design to explore cyclodextrin therapeutics and biomedical applications.</a> Chem Biol Drug Des. 89 (2), 257-268 (2017).</li>
<li>Chen, G., Seukep, A. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+molecular+docking+for+the+research+and+discovery+of+potential+marine+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Mar+Drugs%22%5BJournal%5D)">Recent advances in molecular docking for the research and discovery of potential marine drugs.</a> Mar Drugs. 18 (11), 545(2020).</li>
<li>Li, T., Guo, R., Zong, Q., Ling, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+molecular+docking+in+elaborating+molecular+mechanisms+and+interactions+of+supramolecular+cyclodextrin%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Application of molecular docking in elaborating molecular mechanisms and interactions of supramolecular cyclodextrin.</a> Carbohydr Polym. 276, 118644(2022).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Tu, Y., Tan, L., Tao, H., Li, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+and+thermal+proteome+profiling+strategies+for+target+identification+and+drug+discovery+of+natural+products%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products.</a> Phytomedicine. 116, 154862(2023).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+cell+biology%3A+Monitoring+global+changes+of+protein+interaction+states+with+the+proteome-wide+cellular+thermal+shift+assay+%28CETSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Horizontal cell biology: Monitoring global changes of protein interaction states with the proteome-wide cellular thermal shift assay (CETSA).</a> Annu Rev Biochem. 88, 383-408 (2019).</li>
<li>Lade, D. M., Nicoletti, R., Mersch, J., Agazie, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+synthesis+of+improved+active-site+SHP2+inhibitors+with+anti-breast+cancer+cell+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Design and synthesis of improved active-site SHP2 inhibitors with anti-breast cancer cell effects.</a> Eur J Med Chem. 247, 115017(2023).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+chemical-structure+TPOR+agonist%2C+TMEA%2C+promotes+megakaryocytes+differentiation+and+thrombopoiesis+via+mTOR+and+ERK+signalings%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Novel chemical-structure TPOR agonist, TMEA, promotes megakaryocytes differentiation and thrombopoiesis via mTOR and ERK signalings.</a> Phytomedicine. 110, 154637(2023).</li>
<li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+proteome+profiling+for+interrogating+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Thermal proteome profiling for interrogating protein interactions.</a> Mol Syst Biol. 16 (3), 9232(2020).</li>
<li>Sanchez, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cellular+thermal+shift+assay+to+monitor+target+engagement%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Real-time cellular thermal shift assay to monitor target engagement.</a> ACS Chem Biol. 17 (9), 2471-2482 (2022).</li>
<li>Tolvanen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+advances+in+CETSA%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Current advances in CETSA.</a> Front Mol Biosci. 9, 866764(2022).</li>
<li>Liu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthatin+inhibits+STAT3+and+NF-%CE%BAB+signalling+by+covalently+binding+to+JAK+and+IKK+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Xanthatin inhibits STAT3 and NF-κB signalling by covalently binding to JAK and IKK kinases.</a> J Cell Mol Med. 23 (6), 4301-4312 (2019).</li>
<li>Liu, Y., Chen, W., Zheng, F., Yu, H., Wei, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthatin+alleviates+LPS-Induced+inflammatory+response+in+RAW264.7+macrophages+by+Inhibiting+NF-%CE%BAB%2C+MAPK+and+STATs+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Xanthatin alleviates LPS-Induced inflammatory response in RAW264.7 macrophages by Inhibiting NF-κB, MAPK and STATs activation.</a> Molecules. 27 (14), 4603(2022).</li>
<li>Dinkova-Kostova, A. T., Kostov, R. V., Canning, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1%2C+the+cysteine-based+mammalian+intracellular+sensor+for+electrophiles+and+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Keap1, the cysteine-based mammalian intracellular sensor for electrophiles and oxidants.</a> Arch Biochem Biophys. 617, 84-93 (2017).</li>
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<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+effective+identification+of+drug+targets+at+the+proteome+level+by+pH-dependent+protein+precipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Sci%22%5BJournal%5D)">Highly effective identification of drug targets at the proteome level by pH-dependent protein precipitation.</a> Chem Sci. 13 (42), 12403-12418 (2022).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+thermal+proteome+profiling+approach+to+screen+protein+targets+of+a+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">A simplified thermal proteome profiling approach to screen protein targets of a ligand.</a> Proteomics. 20, 1900372(2020).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2022).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiolacrenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiolacrenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'identificazione dei bersagli della malattia e la scoperta e lo sviluppo di farmaci sono strettamente interconnessi27. Mirando con precisione a bersagli specifici, è possibile sviluppare farmaci candidati per trattare particolari malattie in modo più efficace, riducendo al minimo gli effetti collaterali associati ai farmaci28,29. I bersagli più comunemente usati sono i bersagli proteici30. Tuttavia, l'identificazione di bersagli proteici speciali pone una sfida immensa a causa dell'ampia diversità di proteine all'interno delle cellule30,31. In questo articolo, abbiamo adottato un approccio che combina il docking molecolare con CETSA per identificare e convalidare i bersagli proteici. I risultati hanno rivelato un'interazione diretta tra xantilina e proteina Keap1. L'integrazione di tecnologia informatica ed esperimenti biologici può essere impiegata anche nello studio di altri farmaci e bersagli proteici per accertare la presenza di un'interazione diretta tra il farmaco e il bersaglio. Questo approccio, che combina la previsione con la verifica, riduce efficacemente sia il consumo di tempo che i costi economici. Inoltre, gli strumenti e i materiali sperimentali sono facili da ottenere e il processo operativo non è complicato. Infine, i campioni CETSA sono facili da preparare e testare con il metodo western blot, che garantisce la riproducibilità dei campioni.
Nella nostra esperienza, ci sono diversi aspetti critici che richiedono un'attenzione particolare durante le procedure sperimentali. In primo luogo, è essenziale selezionare la struttura cristallina della proteina risolta mediante analisi a raggi X quando si sceglie la struttura della proteina prima dell'aggancio molecolare. In secondo luogo, la densità cellulare e il tempo di congelamento/scongelamento sono fattori cruciali negli esperimenti CETSA. Le cellule in fase di crescita logaritmica dovrebbero essere selezionate per gli esperimenti CETSA poiché il loro stato di crescita è stabile e ha un impatto minimo sui risultati sperimentali. Durante il congelamento e lo scongelamento ripetuti delle cellule, la tempistica deve essere ben controllata con azoto liquido utilizzato per il congelamento fino a ottenere una forma solida bianca, seguita da uno scongelamento immediato a temperatura ambiente prima dei successivi cicli di congelamento. Infine, gli esperimenti di western blot devono essere completati prontamente dopo la preparazione dei campioni CETSA per prevenire la degradazione delle proteine.
Il docking molecolare e il CETSA sono entrambe tecniche consolidate che svolgono un ruolo cruciale nel campo dello sviluppo di farmaci. Il docking molecolare è fondamentale per prevedere le interazioni a livello molecolare tra i composti e i loro bersagli, offrendo preziose informazioni sulle potenziali modalità di legame10,11. Il CETSA, al contrario, si concentra sulla valutazione dell'impatto dei farmaci sulla stabilità termica delle proteine e funge da strumento per convalidare le interazioni farmaco-proteina17. Sebbene il CETSA sia un metodo relativamente semplice per la verifica, è anche un metodo a basso rendimento utilizzando il western blot per lo studio dello spostamento termico del complesso farmaco-proteina, e non dovrebbe essere l'unica tecnica su cui fare affidamento. Inoltre, le fasi del CETSA sono complicate e qualsiasi errore di passaggio durante l'operazione può avere un grande impatto sui risultati. Inoltre, il metodo CETSA non può determinare il sito di legame specifico e la modalità di legame del composto al bersaglio proteico e non può indicare se il legame è covalente o non covalente 17,18,23. Oltre al saggio di spostamento termico, altri tipi di saggi energetici, come la precipitazione proteica dipendente dal pH (pHDPP), possono essere utilizzati anche per lo studio delle interazioni ligando-proteina32. Inoltre, la profilazione del proteoma termico è un metodo basato sull'energia per rivelare le interazioni ligando-proteina, consentendo un'analisi ad alto rendimento e su larga scala delle interazioni proteina-farmaco combinando la proteomica con CETSA33.
Inoltre, la risonanza plasmonica di superficie localizzata (LSPR) può fornire ulteriori analisi qualitative e quantitative 34,35. Non solo determina l'esistenza di interazioni tra un farmaco e il suo bersaglio, ma misura anche i parametri di affinità e i parametri cinetici di queste interazioni intermolecolari, offrendo una comprensione più completa.
Oltre al saggio di spostamento termico, la precipitazione proteica dipendente dal pH (pHDPP) può essere utilizzata anche per lo studio delle interazioni ligando-proteina32. Il docking molecolare è un metodo di simulazione basato sulla fisico-meccanica per prevedere le interazioni tra piccole molecole e biomolecole. Questo metodo mira a ottenere il legame ottimizzando la conformazione e l'orientamento di piccole molecole per produrre la migliore complementarietà tra loro e le biomolecole. La previsione del bersaglio utilizza tecniche di intelligenza artificiale per prevedere i siti di legame tra piccole molecole e biomolecole. I due approcci presentano differenze fondamentali nell'applicazione del metodo e nell'accuratezza della previsione. Applicazione del metodo: il docking molecolare viene utilizzato principalmente per la progettazione e l'ottimizzazione di farmaci, fornendo una base teorica per la scoperta di nuovi farmaci. La previsione del bersaglio, con l'aiuto di un'intelligenza artificiale più avanzata, viene applicata più spesso allo screening ad alto rendimento e alla rapida scoperta di composti guida per migliorare l'efficienza della scoperta di farmaci. Accuratezza della previsione: poiché il docking molecolare si basa su simulazioni fisiche, la sua precisione di previsione è maggiore, ma anche il costo computazionale è relativamente alto. Sebbene la previsione del target abbia un costo computazionale inferiore, l'accuratezza della previsione dipende dall'abbondanza di dati di addestramento e dalla selezione del modello.

Le proteine sono macromolecole molto importanti negli organismi viventi e possiedono una vasta gamma di funzioni uniche all'interno delle cellule, come la composizione della membrana, la formazione del citoscheletro, l'attività enzimatica, il trasporto, la segnalazione cellulare e il coinvolgimento nei meccanismi intracellulari ed extracellulari 1,2,3. Le proteine manifestano le loro funzioni biologiche principalmente attraverso interazioni specifiche con una varietà di molecole, tra cui altre proteine, acidi nucleici, ligandi di piccole molecole e ioni metallici 1,4. I ligandi sono piccoli composti molecolari che si legano specificamente alle proteine di un organismo. L'interazione tra proteine e ligandi avviene in siti specifici sulla proteina, chiamati siti di legame, noti anche come tasche di legame5. Nella ricerca in chimica farmaceutica, l'attenzione si concentra sull'identificazione di proteine chiave che sono chiaramente associate a malattie, che fungono da bersagli per i farmaci6. Pertanto, acquisire una profonda comprensione dei siti di legame tra proteine e ligandi è della massima importanza per promuovere la scoperta, la progettazione e la ricerca di farmaci 7,8.
Il docking molecolare è uno strumento computazionale ampiamente utilizzato per lo studio del legame proteina-ligando, che impiega le strutture tridimensionali di proteine e ligandi per esplorare le loro modalità e affinità di legame primarie durante la formazione di complessi stabili 9,10,11. L'applicazione della tecnologia di docking molecolare è nata negli anni '1970. Sulla base del principio di accoppiamento di serratura e chiave e utilizzando gli algoritmi del software di docking molecolare, è possibile determinare l'interazione tra composti e bersagli molecolari analizzando i risultati dell'attracco. Questo approccio consente la previsione dei siti di legame attivi sia per il composto che per la molecola bersaglio. Di conseguenza, facilita l'identificazione di una conformazione di legame ottimale (qui chiamata modello di legame) per le interazioni ligando-recettore, che è cruciale per comprendere la meccanica di questi impegni molecolari 12,13,14,15. Mentre il docking molecolare fornisce preziose previsioni basate su computer delle interazioni ligando-recettore, è importante notare che si tratta di risultati preliminari. Di conseguenza, un'ulteriore verifica sperimentale è essenziale per confermare queste interazioni.
Il saggio di spostamento termico cellulare (CETSA), inizialmente proposto dal team di ricerca di Pär Nordlund nel 2013, funge da metodo per convalidare le interazioni farmaco-proteina bersaglio. Questa tecnica testa specificamente la stabilità termica delle proteine bersaglio indotta dal legame farmacologico, fornendo un approccio pratico per confermare le interazioni molecolari 16,17,18. Questo approccio si basa sul principio fondamentale che il legame del ligando avvia uno spostamento termico all'interno delle proteine bersaglio ed è applicabile a un'ampia gamma di campioni biologici, inclusi lisati cellulari, cellule viventi intatte e tessuti 19,20. CETSA supporta l'impegno diretto del bersaglio di piccole molecole in cellule intatte rilevando la stabilizzazione termodinamica delle proteine dovuta al legame del ligando e collegando la risposta fenotipica osservata al composto bersaglio21,22. Tra le varie metodologie derivate dal CETSA, il Western Blot-CETSA (WB-CETSA) è considerato un approccio classico. Dopo la preparazione del campione con il metodo CETSA, viene utilizzata l'analisi western blot per rilevare alterazioni nella stabilità termica della proteina bersaglio. Ciò consente la determinazione precisa delle interazioni farmaco-proteina all'interno dei sistemi cellulari17,23.
La xantitina è un composto bioattivo isolato dalla pianta Xanthium L. con proprietà antinfiammatorie, che è stato utilizzato nella medicina tradizionale cinese per trattare malattie come la sinusite nasale e l'artrite24,25. La proteina 1 associata a ECH (Keap1) è un componente del complesso proteico multi-subunità ubiquitina ligasi Cullin-RING E3 basato su Cullin3 e un importante regolatore dell'omeostasi redox intracellulare, che influenza l'intensità e la durata della risposta infiammatoria modulando lo stato redox intracellulare26. In questo studio, abbiamo prima utilizzato il docking molecolare per studiare l'interazione tra xantilina (piccola molecola) e proteina Keap1, con l'obiettivo di prevedere la loro modalità di legame. Successivamente, abbiamo utilizzato il metodo CETSA per convalidare questa interazione valutando l'impatto della xantilina sulla stabilità termica della proteina Keap1.

<table><tbody><tr><td>0,45 &mu; m Membrana di fluoruro di polivinilidene</td><td>Millipore</td><td>PR05509</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo anidro</td><td>Sostanze chimiche Chron</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>BioFroxx</td><td>4240GR100</td><td></td></tr><tr><td>Miscele di inibitori della proteasi ad ampio spettro Boster</td><td>Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1193</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Reagente a chemiluminescenza potenziato</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>P0018S</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GAPDH</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>10494-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di imaging su gel</td><td>E-BLOT</td><td>Touch Imager Pro</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di PCR a gradiente</td><td>Biometra TADVANCED</td><td>Biometra Tadvanced 96SG</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td> <td>di congelamento ad alta velocitàBeckman Coulter</td><td>Allegra X-30R</td><td></td></tr><tr><td>Rafano perossidasi coniugato affiniPure anticorpo di capra</td><td>ProteinTech Group Co., Ltd</td><td>SA00001-2</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico&nbsp;</td><td>Chron chemicals</td><td>67-63-0</td><td></td></tr><tr><td>Keap1 anticorpo</td><td>Zen BioScience Co., Ltd</td><td>R26935</td><td></td></tr><tr><td>Bagno di metallo</td><td>Analytik Jena</td><td>TSC</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Chron chemicals</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Ncmblot tampone di trasferimento rapido (20&times;)</td><td>NCM Biotech Co., Ltd</td><td>WB4600</td><td></td></tr><tr><td>Omni-Easy OneStep PAGE gel preparazione rapida kie</td><td>Epizyme Biotech Co., Ltd</td><td>PG212</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>Prestained Color Protein Marker</td><td>Biosharp&nbsp;</td><td>BL741A</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi per blotting proteico</td><td>Bio-Rad</td><td>MiniPROTEAN&Ograve; Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 cella</td><td>Beyotime Biotechnology Co., Ltd</td><td>C7505</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7 terreno specifico per cellule</td><td>Procell Life Science& Technology Co., Ltd</td><td>CM-0597</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE tampone di caricamento delle proteine</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>AR1112-10</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE polvere tampone in esecuzione</td><td>Servicebio</td><td>G2018</td><td></td></tr><tr><td>Tris polvere salina tamponata</td><td>Servicebio</td><td>G0001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BioFroxx</td><td>1247ML100</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Memmert</td><td>WNE10</td><td></td></tr><tr><td>Depuratore d'acqua</td><td>Millipore</td><td>Milli- IQ 7005</td><td></td></tr><tr><td>Xanthatin</td><td>ChemConst Biotechnology Co., Ltd</td><td>CONST210706</td><td></td></tr></tbody></table>

previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola

Protein Target Prediction and Validation of Small Molecule Compound

Le proteine sono fondamentali per la fisiologia umana, con i loro bersagli cruciali nella ricerca e nello sviluppo di farmaci. L'identificazione e la convalida di bersagli proteici cruciali sono diventate parte integrante dello sviluppo di farmaci. Il docking molecolare è uno strumento computazionale ampiamente utilizzato per studiare il legame proteina-ligando, specialmente nel contesto delle interazioni farmaco-bersaglio proteico. Per la verifica sperimentale del legame e per accedere direttamente al legame del farmaco e del suo bersaglio, viene utilizzato il metodo del saggio di spostamento termico cellulare (CETSA). Questo studio mirava a integrare il docking molecolare con CETSA per prevedere e convalidare le interazioni tra farmaci e bersagli proteici vitali. In particolare, abbiamo previsto l'interazione tra xantilina e proteina Keap1 e la sua modalità di legame attraverso l'analisi di docking molecolare, seguita dalla verifica dell'interazione utilizzando il saggio CETSA. I nostri risultati hanno dimostrato che la xantilina potrebbe stabilire legami idrogeno con specifici residui amminoacidici della proteina Keap1 e ridurre la termostabilità della proteina Keap1, indicando che la xantilina potrebbe interagire direttamente con la proteina Keap1.

L'analisi di docking molecolare ha predetto l'interazione tra xantitina e proteina Keap1. La Figura 2 mostra la formazione di legami idrogeno tra xantitina e residui amminoacidici Gly-367 e Val-606 della proteina Keap1, con una lunghezza del legame idrogeno di 2,17 Å per Gly-367 e 2,13 Å per Val-606. Inoltre, il punteggio di docking calcolato di -5,69 kcal/mol indica una buona affinità di legame tra xantitina e proteina Keap1.
Il metodo CETSA ha mostrato che il legame con la xantilina ha spostato la stabilità termica della proteina Keap1, confermando l'interazione tra la xantilina e la proteina Keap121. La Figura 3 indica che la xantilina sposta notevolmente la stabilità termica della proteina Keap1 all'interno dell'intervallo di temperatura compreso tra 48 °C e 57 °C, rispetto al gruppo DMSO. Per garantire un carico di campioni uniforme, in primo luogo, la densità di inoculazione cellulare in cui abbiamo eseguito gli esperimenti era coerente; in secondo luogo, i campioni cellulari del gruppo DMSO e del gruppo xantatina sono stati mescolati bene nelle piastre di coltura cellulare e poi sono stati equamente distribuiti in due provette da microcentrifuga, che hanno assicurato una quantità costante di campioni cellulari, e il volume di surnatante aggiunto a ciascuna provetta PCR era di 60 μL e, infine, il volume di ciascun campione caricato nel Western blot era di 20 μL, che garantiva un carico uguale per i campioni riscaldati. La degradazione delle proteine nei campioni a partire da circa 51 °C è dovuta principalmente a cambiamenti nella struttura delle proteine e reazioni chimiche accelerate causate dalle alte temperature. I risultati di cui sopra dimostrano che la xantilina potrebbe legarsi direttamente alla proteina Keap1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig01.jpg"> Figura 1: Ordine di caricamento del western blot. La temperatura in ordine da sinistra a destra era di 45 °C, 48 °C, 51 °C, 54 °C, 57 °C, 60 °C e 63 °C.  La prima corsia è stata aggiunta con un indicatore; sono state utilizzate due corsie per ogni temperatura; la prima corsia era il gruppo DMSO e la seconda corsia era il gruppo xanthatin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig02.jpg"> Figura 2: Interazione tra xantitina e proteina Keap1 (PDB: 2FLU). (A) La rappresentazione 2D del legame della xantalina a Keap1. (B) La visualizzazione 3D della xantilina e della proteina Keap1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66564/66564fig03.jpg"> Figura 3: Effetto della xantilina sulla stabilità termica della proteina Keap1. (A) Gli effetti della xantilina sulla stabilità termica di Keap1 sono stati rilevati dal CETSA. (B) Le densità ottiche di Keap1 sono state normalizzate a quelle ottenute a 45 °C. I dati sono rappresentati come media ± SD. L'analisi statistica è stata eseguita mediante analisi unidirezionale della varianza (ANOVA unidirezionale). n = 3. *p &lt; 0,05, **p &lt; 0,01, p &lt; 0,001, p &lt; 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66564/66564fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con il saggio di spostamento termico cellulare per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole e bersagli proteici.

Previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola

Proteins are fundamental to human physiology, with their targets being crucial in research and drug development. The identification and validation of ...

La nostra ricerca si concentra su bersagli proteici, predizione e validazione di piccoli composti molecolari. L'esperimento qui utilizzato mostra un metodo di docking molecolare combinato con un simile saggio di spostamento termico per prevedere e convalidare l'interazione tra piccole molecole e bersagli proteici. Queste fasi del CETSA sono complicate e qualsiasi errore durante l'operazione può avere un grande impatto sui risultati.Il nostro protocollo combina la previsione con la verifica, riducendo efficacemente sia il consumo di tempo che i costi economici. Inoltre, gli strumenti e i materiali sperimentali sono facili da accettare. Infine, i campioni CETSA sono facili da preparare in prova, il che garantisce la producibilità dei campioni.

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Linee guida per computer basato su caratterizzazione strutturale e funzionale di proteine ​​utilizzando l'I-Tasser pipeline è descritto. Partendo dalla sequenza della proteina query, i modelli 3D sono generate utilizzando più allineamenti threading e iterativo simulazioni di assemblaggio strutturale. Inferenze funzionali sono successivamente redatto in base alle corrispondenze di proteine ​​con struttura nota e funzioni.

Un protocollo per la Computer-Based Protein Structure Prediction e Funzione

Descriviamo qui un metodo per l'identificazione di proteine che legano piccole molecole utilizzando l'etichettatura di fotoaffinità. Il vantaggio di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare vivo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

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Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alta produttività basata su biosensore per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina

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Predizione farmacologica di rete e convalida metabolomica del meccanismo di Fructus phyllanthi contro l'iperlipidemia

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Previsione e validazione del bersaglio proteico di un composto a piccola molecola

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