Name: Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 16 s
Description: Scopri la microscopia intravitale a due fotoni per studiare i meccanismi immunitari nel polmone trapiantato di topo. Questo metodo rivela le interazioni cellulari dinamiche e il ruolo dei monociti nel rigetto.

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<meta charset="utf8"></head><body>Monitoraggio in tempo reale delle dinamiche cellulari nel trapianto di polmone di topo

<table><tbody><tr><td>0,75% povidone-iodio</td><td>Aplicare</td><td>NDC 52380-0126-2</td><td>Per disinfettante</td></tr><tr><td>Catetere IV da 1 pollice 20G</td><td>Terumo</td><td>SROX2025CA</td><td>Per tubo endotracheale (ETT)</td></tr><tr><td>Nastro di seta da 1 pollice</td><td>Durapore</td><td>3M ID 7100057168</td><td>Per fissare il mouse in posizione</td></tr><tr><td>Obiettivo lungo ad immersione in acqua 20x</td> Colla <td></td><td></td> Olympus N20X-PFH <td></td></tr><tr><td>3M Vetbond</td><td>Medi-Vet.com</td><td>10872</td><td>Per incollare il vetro coprioggetto ai punti</td></tr><tr><td>quantici non mirati da 655 nm</td><td>ThermoFisher</td><td>Q21021MP</td><td>Per l'etichettatura di vasi sanguigni</td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EX0281</td><td>Per disinfettante</td></tr><tr><td>Argent High Temp Penna cauterica a punta fine</td><td>McKesson</td><td>231</td><td></td></tr><tr><td>Black O-ring (2 cm)</td><td>Ferramenta</td><td>N/A</td><td>Per imaging su misura bullone</td></tr><tr><td>della camera (2)</td><td>Negozio di ferramenta</td><td>N/A</td><td>Per camera di imaging su misura</td></tr><tr><td>Dado a testa zigrinata in ottone (2)</td><td>Negozio di ferramenta</td><td>N/A</td><td>Per camera di imaging su misura</td></tr><tr><td>Buprenorfina 1,3 mg/mL</td><td>Fidelis Animal Health</td><td>NDC 86084-100-30</td><td>Per il controllo del dolore</td></tr><tr><td>Laser pulsato a femtosecondi camaleonte titanio-zaffiro</td><td>Coerente</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vetro di copertura (24 mm x 50 mm)</td><td>Thomas Scientific</td><td>1202F63</td><td>Per camera di imaging su misura</td></tr><tr><td>Morsetto per zanzare curvo (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>13009-12</td><td></td></tr><tr><td>Controller riscaldatore a doppio canale</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>15040-11</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio verticale a tavolino fisso</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Garza (tagliata a 1 cm x 3 cm)</td><td>McKesson</td><td>476709</td><td>Da posizionare sotto il polmone sinistro</td></tr><tr><td>Grasso per alto vuoto</td><td>Dow Corning</td><td>N/A</td><td>Per far aderire il vetro coprioggetto sulla piastra superiore</td></tr><tr><td>Isoflurano 1%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26675-46-7</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Ketamina cloridrato 100 mg/mL</td><td>Vedco</td><td>NDC 50989-996-06</td><td>Per anestesia</td></tr><tr><td>Foglio metallico (3 cm x 7 cm)</td><td>Ferramenta</td><td>N/A</td><td>Per camera di imaging su misura</td></tr><tr><td>Applicatori appuntiti con punta in cotone</td><td>Solon</td><td>56225</td><td>Per manipolare i polmoni e per la dissezione contundente</td></tr><tr><td>Power Pro Ultra</td><td>clipper Oster</td><td>078400-020-001</td><td></td></tr><tr><td>Unguento per gli occhi Puralube Vet</td><td>Medi-Vet.com</td><td>11897</td><td>Per prevenire la disidratazione oculare</td></tr><tr><td>Ventilatore per piccoli animali</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>55-0000</td><td></td></tr><tr><td>Pinze diritte (1)</td><td>Fine Science Tools</td><td>91113-10</td><td></td></tr><tr><td>Driver per otturatore a tre canali</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D3</td><td>Scanner risonante</td></tr><tr><td>x.y.z motore passo-passo ottico</td><td>Prior Scientific</td><td>OptiScan II</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina 20 mg/mL</td><td>Akorn</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Per il controllo del dolore</td></tr></tbody></table>

microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

Intravital Two-Photon Microscopy of the Transplanted Mouse Lung

Dopo 1 ora di conservazione ischemica a freddo a 4 °C, abbiamo trapiantato ortotopicamente il polmone sinistro da un topo B6 a un B6. LysM-GFP sul topo4, e quindi è stato eseguito l'imaging intravitale a due fotoni, come descritto sopra. Abbiamo eseguito l'imaging in due punti temporali dopo il trapianto: 2 ore (Figura 3A) e 24 ore (Figura 3B). I vasi sanguigni sono etichettati in rosso dai punti q iniettati immediatamente prima dell'imaging. Inoltre, possiamo visualizzare i monociti che hanno assorbito i punti q a 24 ore4. I neutrofili derivati dal ricevente con etichetta verde possono essere visti infiltrarsi nell'innesto polmonare nel video corrispondente a 24 ore dopo il trapianto (Video supplementare 1). Gli alveoli possono essere visualizzati come crateri scuri dovuti all'SHG del collagene (frecce bianche nella Figura 3). Osserviamo che a 24 ore dopo il trapianto, ci sono più neutrofili nel polmone rispetto a 2 ore dopo il trapianto (Figura 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig01.jpg"> Figura 1: Preparazione del topo per l'imaging a due fotoni. (A) Riapertura della pelle sopra la toracotomia sinistra. (B) Cute e tessuti molli asportati sul torace sinistro. (C, D) Nervature bloccate per 10 s prima della divisione. (E) Costole sinistra della3a-5a resecate per creare una finestra che misura ~0,8 cm cranio-audalmente x 1,0 cm antero-posteriormente. (F) Polmone sinistro sollevato dal torace sinistro e posto su una striscia di garza. (G) Una camera di imaging con una finestra di imaging si sovrappone al polmone sinistro. (H) La camera di imaging è posizionata sul tavolino del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig02.jpg"> Figura 2: Configurazione della camera di imaging. (A) La camera di imaging posizionata sul tavolino del microscopio. (B) Vista ingrandita del meccanismo dell'otturatore caricato a molla per fissare la piastra superiore sul polmone sinistro. (C) Parte anteriore e posteriore della piastra superiore con O-ring e vetro di copertura applicati. Le linee bianche rappresentano l'area in cui viene applicato il grasso sottovuoto per far aderire il vetro coprioggetto alla piastra superiore. Il cerchio grigio rappresenta un anello di colla da applicare sul vetro di copertura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66566/66566fig03.jpg"> Figura 3: Imaging intravitale a due fotoni di trapianto di polmone sinistro di topo da B6 a B6. Topo LysM-GFP con 1 ora di conservazione ischemica a freddo. L'imaging viene eseguito a (A) 2 ore e (B) 24 ore dopo il trapianto. Il rosso rappresenta i punti q. Il verde rappresenta i neutrofili della B6. Ricevente di LysM-GFP. Il blu rappresenta l'SHG degli alveoli ricchi di collagene. Le frecce bianche mostrano gli spazi aerei alveolari. La barra della scala rappresenta 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/66566fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura supplementare 1: Piastra superiore con due resistenze attaccate per fornire un riscaldamento aggiuntivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/Supplemental%20Figure%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Video supplementare 1: Imaging time-lapse a due fotoni del polmone sinistro di topo trapiantato da B6 a B6. Topo LysM-GFP con 1 ora di conservazione ischemica a freddo, eseguita a 24 ore dopo il trapianto. Il rosso rappresenta i punti q. Il verde rappresenta i neutrofili del ricevente di LysM-GFP. Il blu rappresenta la seconda generazione armonica degli alveoli ricchi di collagene. La barra della scala rappresenta 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66566/Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

Complications after lung transplantation are largely related to the host immune system responding to the graft. Such immune responses are regulated by ...

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Abbiamo sviluppato strumenti di laboratorio nuovi e protocolli per l'acquisizione di immagini intravitale del timo. La nostra tecnica dovrebbe aiutare nell'identificazione di "nicchie" all'interno del timo in cui lo sviluppo delle cellule T si verifica.

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multifotone per eseguire l'imaging a lungo termine ad alta risoluzione di una singola cellula del polmone intatto in tempo reale utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto.

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Questo protocollo descrive l'imaging videomicroscopia di topi transgenici che esprimono marcatori fluorescenti cellula-specifico. Videomicroscopia imaging fornisce un metodo non invasivo per osservazioni ad alta risoluzione in animali vivi utilizzando windows impiantabili attraverso il quale è possibile la visualizzazione microscopica dei processi. Questo metodo è particolarmente utile per studiare i processi longitudinali.

Videomicroscopia microscopia del sistema vascolare del tumore-associati utilizzando avanzate dorsale dello Skinfold finestra Chambers su topi transgenici fluorescenti

In questo studio, presentiamo un protocollo per eseguire due-fotone videomicroscopia imaging e cella analisi di interazione nella mucosa trachea murino dopo infezione con virus dell'influenza. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che studiano la dinamica delle cellule immuni durante le infezioni respiratorie.

La formazione immagine interazione cellula nella Mucosa trachea durante l'infezione da Virus influenzale usando la microscopia Intravital due-fotone

Il protocollo introdotto qui permette la caratterizzazione della capacità polmonare homing dei linfociti primari umani sotto condizioni infiammatorie in vivo. Infiltrazione polmonare delle cellule immuni umane passivamente trasferite in un modello murino di infiammazione allergica può essere imaged e quantificato mediante microscopia a fluorescenza di luce-foglio di tessuto polmonare chimicamente deselezionata.

Formazione immagine dei linfociti umani di Homing polmonare in un sperimentale In Vivo modello di infiammazione allergica basato su microscopia luce-scheda Avanzate

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Qui presentiamo un protocollo per l'impianto chirurgico di una finestra ottica permanentemente a dimora per il torace murino, che consente l'imaging intravitale ad alta risoluzione del polmone. La permanenza della finestra la rende adatta allo studio dei processi cellulari dinamici nel polmone, in particolare quelli che si stanno lentamente evolvendo, come la progressione metastatica delle cellule tumorali disseminate.

Una finestra permanente per indagare sulle metastasi del cancro al polmone

Descriviamo il trapianto intraparenchimale di cellule progenitrici neurali umane trasdotte con un doppio vettore reporter che esprime la proteina fluorescente verde luciferasi (GFP) nel cervello del topo. Dopo il trapianto, il segnale della luciferasi viene ripetutamente misurato utilizzando bioluminescenza in vivo e cellule innestate che esprimono GFP identificate in sezioni cerebrali utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Trapianto intracerebrale e monitoraggio della bioluminescenza in vivo delle cellule progenitrici neurali umane nel cervello del topo

Il manoscritto descrive una metodologia per l'instaurazione e il monitoraggio longitudinale della crescita delle metastasi polmonari spontanee da tumori mammari iniettati ortotopicamente, suscettibili di intervento in tutte le fasi della cascata metastatica.

In vivo Imaging per misurare le metastasi polmonari spontanee di cellule tumorali mammarie iniettate ortotopicamente

La terapia cellulare offre un intervento promettente per la fibrosi polmonare utilizzando cellule progenitrici per riparare i tessuti danneggiati e migliorare la funzione polmonare. Poiché l'imaging svolge un ruolo fondamentale nel tracciamento dell'integrazione cellulare, in questo articolo descriviamo il tracciamento in vivo guidato dall'imaging con particelle magnetiche della terapia cellulare per la fibrosi polmonare in un modello murino.

Tracciamento in vivo guidato da immagini di cellule progenitrici epiteliali polmonari distali trapiantate per la fibrosi polmonare mediante imaging con particelle magnetiche

Qui presentiamo un protocollo per l'imaging intravitale di Mycobacterium tuberculosis approvato BSL-2 attenuato. Ceppo nel polmone murino utilizzando una finestra polmonare permanente. Questo approccio consente un'analisi longitudinale a risoluzione monocellulare delle prime interazioni ospite-patogeno, inclusa localizzazione bacillare, dinamica vascolare e assorbimento di macrofagi nello stesso microambiente polmonare.

Imaging intravitale dell'attenuazione dell'Auxotrophic Mycobacterium tuberculosis nel polmone murino durante l'infezione intravascolare precoce

Scopri la microscopia intravitale a due fotoni per studiare i meccanismi immunitari nel polmone trapiantato di topo. Questo metodo rivela le interazioni cellulari dinamiche e il ruolo dei monociti nel rigetto.

Microscopia intravitale a due fotoni del polmone di topo trapiantato

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