Name: Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-06T12:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Scopri un protocollo per l'assemblaggio di nucleosomi in situ su DNA nativo per microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola. Questo metodo riduce i reagenti e il tempo di preparazione rispetto ai metodi tradizionali.

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<meta charset="utf8"></head><body>Ricostituzione nucleosomiale in situ per studi su singole molecole

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+A+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184, 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosome+core+particle+at+2.8+A+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution.</a> Nature. 389, 251-260 (1997).</li>
<li>Zhou, K., Gaullier, G., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+structure+and+dynamics+are+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome structure and dynamics are coming of age.</a> Nat Struct Mol Biol. 26, 3-13 (2019).</li>
<li>McGinty, R. K., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+nucleosome+recognition+by+chromatin+factors+and+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of nucleosome recognition by chromatin factors and enzymes.</a> Curr Opin Struct Biol. 71, 16-26 (2021).</li>
<li>Fierz, B., Poirier, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysics+of+chromatin+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Biophysics of chromatin dynamics.</a> Annu Rev Biophys. 48, 321-345 (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-molecule+techniques%3A+A+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: A laboratory manual</a>. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Chua, G. N. L., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+force+met+fluorescence%3A+Single-molecule+manipulation+and+visualization+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">When force met fluorescence: Single-molecule manipulation and visualization of protein-DNA interactions.</a> Annu Rev Biophys. , (2024).</li>
<li>Hashemi Shabestari, M., Meijering, A. E. C., Roos, W. H., Wuite, G. J. L., Peterman, E. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+Advances+in+biological+single-molecule+applications+of+optical+tweezers+and+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Recent Advances in biological single-molecule applications of optical tweezers and fluorescence microscopy.</a> Methods Enzymol. 582, 85-119 (2017).</li>
<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Lett%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Opt Lett. 11, 288(1986).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Sci+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev Sci Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Hansen, J. C., van Holde, K. E., Lohr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+nucleosome+assembly+onto+oligomers+of+the+sea+urchin+5+S+DNA+positioning+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The mechanism of nucleosome assembly onto oligomers of the sea urchin 5 S DNA positioning sequence.</a> J Biol Chem. 266, 4276-4282 (1991).</li>
<li>Salt Peterson, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gradient+dialysis+reconstitution+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">gradient dialysis reconstitution of nucleosomes.</a> CSH Protoc. 2008, 5113(2008).</li>
<li>Leicher, R., Liu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+interaction+between+chromatin+and+chromatin-associated+complexes+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the interaction between chromatin and chromatin-associated complexes with optical tweezers.</a> Methods Mol Biol. 2478, 313-327 (2022).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442, 772-778 (2006).</li>
<li>Ioshikhes, I. P., Albert, I., Zanton, S. J., Pugh, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+positions+predicted+through+comparative+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Nucleosome positions predicted through comparative genomics.</a> Nat Genet. 38, 1210-1215 (2006).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J Mol Biol. 276, 19-42 (1998).</li>
<li>Chipev, C. C., Wolffe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+organization+of+Xenopus+laevis+oocyte+and+somatic+5S+rRNA+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal organization of Xenopus laevis oocyte and somatic 5S rRNA genes in vivo.</a> Mol Cell Biol. 12, 45-55 (1992).</li>
<li>Crickard, J. B., Moevus, C. J., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rad54+drives+ATP+hydrolysis-dependent+DNA+sequence+alignment+during+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Rad54 drives ATP hydrolysis-dependent DNA sequence alignment during homologous recombination.</a> Cell. 181, 1380-1394 (2020).</li>
<li>Vlijm, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+the+assembly+and+handedness+dynamics+of+%28H3.3-H4%292+tetrasomes+to+canonical+tetrasomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparing the assembly and handedness dynamics of (H3.3-H4)2 tetrasomes to canonical tetrasomes.</a> PLoS One. 10, e0141267(2015).</li>
<li>Mazurkiewicz, J., Kepert, J. F., Rippe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+nucleosome+assembly+by+histone+chaperone+NAP1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of nucleosome assembly by histone chaperone NAP1.</a> J Biol Chem. 281, 16462-16472 (2006).</li>
<li>Nakagawa, T., Bulger, M., Muramatsu, M., Ito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+chromatin+assembly+on+supercoiled+plasmid+DNA+by+nucleosome+assembly+protein-1+and+ATP-utilizing+chromatin+assembly+and+remodeling+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Multistep chromatin assembly on supercoiled plasmid DNA by nucleosome assembly protein-1 and ATP-utilizing chromatin assembly and remodeling factor.</a> J Biol Chem. 276, 27384-27391 (2001).</li>
<li>Andrews, A. J., Chen, X., Zevin, A., Stargell, L. A., Luger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+chaperone+Nap1+promotes+nucleosome+assembly+by+eliminating+nonnucleosomal+histone+DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The histone chaperone Nap1 promotes nucleosome assembly by eliminating nonnucleosomal histone DNA interactions.</a> Mol Cell. 37, 834-842 (2010).</li>
<li>Wu, R., Taylor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+analysis+of+DNA.+II.+Complete+nucleotide+sequence+of+the+cohesive+ends+of+bacteriophage+lambda+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence analysis of DNA. II. Complete nucleotide sequence of the cohesive ends of bacteriophage lambda DNA.</a> J Mol Biol. 57, 491-511 (1971).</li>
<li>King, G. A., Peterman, E. J., Wuite, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+structural+plasticity+of+stretched+DNA+under+torsional+constraint%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Unravelling the structural plasticity of stretched DNA under torsional constraint.</a> Nat Commun. 7, 11810(2016).</li>
<li>Paik, D. H., Roskens, V. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsionally+constrained+DNA+for+single-molecule+assays%3A+An+efficient%2C+ligation-free+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Torsionally constrained DNA for single-molecule assays: An efficient, ligation-free method.</a> Nucleic Acids Res. 41, e179(2013).</li>
<li>Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tweezers+in+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Optical tweezers in single-molecule biophysics.</a> Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).</li>
<li>Diaz-Celis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assignment+of+structural+transitions+during+mechanical+unwrapping+of+nucleosomes+and+their+disassembly+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Assignment of structural transitions during mechanical unwrapping of nucleosomes and their disassembly products.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2206513119(2022).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+and+in+silico+dissection+of+the+interaction+between+Polycomb+repressive+complex+2+and+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule and in silico dissection of the interaction between Polycomb repressive complex 2 and chromatin.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 117, 30465-30475 (2020).</li>
<li>Chua, G. N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+dynamics+specify+MeCP2+function+at+methylated+DNA+and+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Differential dynamics specify MeCP2 function at methylated DNA and nucleosomes.</a> bioRxiv. , (2023).</li>
<li>Brower-Toland, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+disruption+of+individual+nucleosomes+reveals+a+reversible+multistage+release+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 99, 1960-1965 (2002).</li>
<li>McCauley, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+FACT+subunits+coordinate+to+catalyze+both+disassembly+and+reassembly+of+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human FACT subunits coordinate to catalyze both disassembly and reassembly of nucleosomes.</a> Cell Rep. 41, 111858(2022).</li>
<li>Mihardja, S., Spakowitz, A. J., Zhang, Y., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+force+on+mononucleosomal+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Effect of force on mononucleosomal dynamics.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15871-15876 (2006).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome-directed+replication+origin+licensing+independent+of+a+consensus+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Nucleosome-directed replication origin licensing independent of a consensus DNA sequence.</a> Nat Commun. 13, 4947(2022).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+recognition+complex+harbors+an+intrinsic+nucleosome+remodeling+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Origin recognition complex harbors an intrinsic nucleosome remodeling activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 119, e2211568119(2022).</li>
<li>Harada, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+nucleosome+translocation+by+RSC+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Stepwise nucleosome translocation by RSC remodeling complexes.</a> Elife. 5, e10051(2016).</li>
<li>Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+recombinant+histones+and+nucleosome+reconstitution%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of recombinant histones and nucleosome reconstitution.</a> Methods Mol Biol. 119, 1-16 (1999).</li>
<li>Rogge, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+nucleosomal+arrays+from+recombinant+core+histones+and+nucleosome+positioning+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assembly of nucleosomal arrays from recombinant core histones and nucleosome positioning DNA.</a> J Vis Exp. (79), e50354(2013).</li>
<li>Leicher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+nucleic+acid+binding+and+coacervation+by+linker+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-stranded nucleic acid binding and coacervation by linker histone H1.</a> Nat Struct Mol Biol. 29, 463-471 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x buffer HR</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>30 mM&nbsp; tris&nbsp; acetato pH 7,5, 20 mM di acetato di magnesio, 50 mM di cloruro di potassio, 0,1 mg/mL BSA&nbsp;</td></tr><tr><td>1x PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>137 mM di cloruro di sodio, 2,7 mM di cloruro di potassio, 10 mM di fosfato di sodio bibasico, 1,8 mM di fosfato di potassio monobasico.</td></tr><tr><td>Acido acetico, glaciale</td><td>Millipore Sigma</td><td>AX0074-6</td><td>Utilizzare per fare il tris acetato</td></tr><tr><td>Biotina-11-dUTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-803-BIOX-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dATP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-835-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Biotina-14-dCTP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-956-BIO14-S</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9418-50G</td><td>Dissolvere in H2O e passare attraverso il filtro da 0,22 um</td></tr><tr><td>Cy3 Maleimmide Colorante mono-reattivo</td><td>Cytiva</td><td>PA23031</td><td>Maleimmide funzionalizzato Cy3 fluoroforo</td></tr><tr><td>dGTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0442S</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5425 R</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-414-051</td><td>Centrifuga da banco con</td></tr><tr><td>raffreddamento Alcool etilico,</td><td>Millipore puro Sigma</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Millipore Sigma</td><td>E9884</td><td>Dissolvenza in H2O a 0,5</td></tr><tr><td>M Ottamero istonico umano (H4, L50C; H2A, K119C)&nbsp;</td><td>N/A</td><td>N/A Le</td><td>proteine istoniche ricombinanti e quelle che presentavano mutazioni marcanti sono state purificate internamente come descritto in precedenza (vedi rif. 33, 34, 35, 36). In breve, gli istoni ricombinanti sono stati espressi in cellule pLySS BL21 (De3) (Promega). I corpi di inclusione sono stati isolati dopo la sonicazione e gli istoni sono stati estratti in condizioni di denaturazione. Gli istoni sono stati dializzati nel tampone A (7 M urea, 10 mM tris cloridrato pH 8,0, 100 mM di cloruro di sodio, 1 mM EDTA e 5 mM 2-mercaptoetanolo) e la soluzione è stata aggiunta a una colonna gravitazionale caricata con Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). Il flusso è stato quindi aggiunto a una colonna a gravità caricata con SP Sepharose Fast Flow (Cytiva) e gli istoni sono stati eluiti dalla colonna aggiungendo il tampone A integrato con 600 mM di cloruro di sodio. Istoni che ospitano mutazioni marcanti (H4, L50C; H2A, K119C) sono stati purificati e quindi coniugati al fluoroforo desiderato tramite coloranti funzionalizzati con maleimmide (Cytiva, Lumidyne) utilizzando un rapporto molare colorante-proteina di 20:1 (vedi rif. 33, 34). Gli ottameri istonici sono stati assemblati aggiungendo un rapporto molare uguale di ciascun istone wild-type o marcato con fluoroforo in condizioni di denaturazione, dializzati in un tampone ad alto contenuto di sale contenente 2 M di cloruro di sodio e quindi purificati mediante cromatografia ad esclusione dimensionale come descritto in precedenza (vedi rif. 36, 37). In alternativa, singole proteine istoniche e ottameri istonici già pronti possono essere acquistati in commercio (ad esempio, Epicypher).</td></tr><tr><td>Tampone immagine</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>20 mM tris cloridrato pH 8,0, 100 mM cloruro di sodio</td></tr><tr><td>Frammento di Klenow (da 3' a 5' exo-)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>Lambda DNA (dam-, dcm-)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SD0021</td><td>Senza metilazione &lambda; DNA</td></tr><tr><td>LD655-MAL</td><td>Lumidyne Technologies</td><td>9</td><td>Maleimmide funzionalizzato LD655 fluoroforo</td></tr><tr><td>Linker istone H1.4 (A4C)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Proteina ricombinante purificata prodotta internamente (vedi rif. 38)</td></tr><tr><td>LUMICKS C-Trap Dymo</td><td>LUMICKS</td><td>N/A</td><td>Configurazione a doppia trappola; materiali standard per lo strumento forniti dal produttore</td></tr><tr><td>Soluzione di acetato di magnesio</td><td>Millipore Sigma</td><td>63052-100ML</td><td>Utilizzare per realizzare il tampone HR</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>Incluso con il kit di frammenti Klenow</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Millipore Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Sciogliere in H2O e passare attraverso un filtro da 0,22 um</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Millipore Sigma</td><td>P3911</td><td>Utilizzare per produrre tampone PBS e HR</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Millipore Sigma</td><td>P0662</td><td>Utilizzare per rendere PBS</td></tr><tr><td>S. cerevisiae Nap1</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Nap1 è stato purificato internamente come descritto in precedenza (vedi rif. 33, 34). In alternativa, Nap1 può essere acquistato in commercio (ad esempio, Active Motif).</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>241245</td><td>Dissolvere in H2O a 3 M</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9888</td><td>Utilizzare per fare PBS e tampone di immagine</td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Millipore Sigma</td><td>S9763</td><td>Utilizzare per fare PBS</td></tr><tr><td>SPHERO Particelle rivestite di biotina (3,0-3,4 &; m)</td><td>Spherotech</td><td>TP-30-5</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Spettrofotometro NanoDrop 2000/2000c</td><td>Fisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>NanoDrop Spettrofotometro</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>Dissolvere in H2O e regolare al pH appropriato; utilizzare per creare buffer di immagine e tris acetato</td></tr></tbody></table>

assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Utilizzando la configurazione descritta nel passaggio 3 (Figura 1A), la formazione di nucleosomi lungo il cavo del DNA è stata visualizzata come l'aspetto di focolai fluorescenti rossi su una scansione 2D (Figure 1B, a sinistra) o traiettorie nel tempo su un chimografo (Figura 1B, a destra). I nucleosomi correttamente avvolti hanno prodotto traiettorie di fluorescenza che sono rimaste stazionarie nel tempo entro il limite di diffrazione del rilevamento confocale (~300 nm). In particolare, più nucleosomi formati l'uno vicino all'altro al di sotto del limite di diffrazione non possono essere risolti spazialmente e appaiono come focolai o traiettorie più luminose. Tuttavia, sono state analizzate le fasi di fotobleaching delle singole traiettorie nucleosomiche e spesso hanno mostrato eventi di fotobleaching a 1 fase (Figura 1C) o a 2 fasi (Figura 1D), il che indica che i focolai contenevano principalmente mononucleosomi dato il tasso di marcatura di circa il 70% della proteina H4 in questo campione. Inoltre, sulla base del numero medio di fotoni per un singolo fluoroforo LD655 in questa condizione sperimentale, è stato stimato il numero di copie H4 marcate in ciascuna traiettoria del nucleosoma e ha mostrato che i loci nucleosomici contenevano prevalentemente (&gt;75%) 1 o 2 copie H2A marcate (Figura 1E), ancora una volta in linea con l'idea che fossero caricati principalmente come mononucleosomi spazialmente separati. Gli altri focolai più luminosi contenevano più di 3 copie di H4 marcato, probabilmente rappresentanti più nucleosomi entro il limite di diffrazione.
La formazione dei nucleosomi è stata monitorata anche da un aumento della tensione lungo il cavo quando le posizioni degli OT sono rimaste costanti man mano che più DNA è stato avvolto attorno agli ottameri istonici (Figura 1B, in basso). In assenza di Nap1, gli ottameri istonici possono ancora legare il DNA ma rimanere per lo più sfasciati, poiché la tensione associata quando le posizioni OT sono state mantenute è rimasta costante (Figura 1F). È possibile che il legame non specifico degli ottameri istonici al DNA avvenga anche in presenza di Nap1. In un altro esperimento, è stato eseguito lo stesso protocollo per formare nucleosomi contenenti H2A marcato con Cy3, che ha prodotto risultati simili a quelli eseguiti con H4 marcato con LD655 (Figura 1G), indicando l'assemblaggio di ottameri intatti in nucleosomi.
Utilizzando la configurazione descritta nel passaggio 4 (Figura 2A), lo srotolamento del nucleosoma è stato visualizzato nel tempo su un chimografo all'aumentare della distanza del cavo (Figura 2B). In precedenza è stato riportato che gli ottameri istonici spesso rimangono legati al DNA dopo essere stati scartati30,31 e, pertanto, le traiettorie fluorescenti spesso persistono anche ad alte tensioni. Anche lo srotolamento dei nucleosomi è stato monitorato sulla curva FD associata (Figura 2C). Le caratteristiche quantificabili della curva FD includono la forza con cui i nucleosomi si srotolano (vedi "Transizione F" nel riquadro della Figura 2C) così come la lunghezza del DNA che è stato rilasciato dall'ottamero dell'istone (vedi "ΔL" nel riquadro della Figura 2C), che esiste in multipli di ~24 nm, coerente con lo srotolamento indipendente delle spire interne del DNA dei singoli nucleosomi27, 30. Questi parametri possono essere utilizzati per stimare il numero di nucleosomi formati su ciascun cavo o per ulteriori analisi a valle della meccanica dei nucleosomi. Pertanto, il numero di rotture del giro interno ottenute da esperimenti di trazione meccanica è stato confrontato con il numero stimato di copie di H4 marcate in ciascuna traiettoria del nucleosoma in base all'intensità del monomero, il che ha dimostrato che i numeri sono in gran parte coerenti (esempi mostrati nelle Figure 2D-G). Tuttavia, è stato notato che non corrispondono perfettamente a causa dell'efficienza marcata del ~70% della proteina H4 nel campione e di qualsiasi legame residuo dell'istone indipendente da Nap1 al DNA, come mostrato nella Figura 1F. Infine, come previsto, l'allungamento dei legami di DNA nudo legati a Nap1 (senza istoni) non genera transizioni indotte dalla forza (Figura 2H), indicando che Nap1 da solo non distorce significativamente il DNA.
Utilizzando la configurazione descritta nel passaggio 5 (Figura 3A), il legame dell'istone linker H1 alla cromatina è stato visualizzato come la comparsa di focolai fluorescenti verdi lungo il cavo della cromatina (Figura 3B). In particolare, i nucleosomi legati a H1 hanno generato traiettorie a doppio colore (vedi frecce bianche nella Figura 3B) che sono apparse stazionarie nel tempo. Inoltre, sono state osservate traiettorie H1 diffuse attraverso regioni di DNA prive di nucleosomi (vedi stelle verdi nella Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig01.jpg"> Figura 1: Formazione di nucleosomi in situ mediati da Nap1. (A) Schema del setup sperimentale descritto nel protocollo di formazione dei nucleosomi in situ mediato da Nap1 (step 3). Un paio di perle sono state intrappolate otticamente nel capitolo 1 e una singola molecola di DNA λ è stata legata tra le perle attraverso il legame biotina-streptavidina nel capitolo 2. Il cavo è stato quindi spostato al canale 4, contenente ottameri istonici marcati con LD655 (rosso) e Nap1 per la formazione in tempo reale di nucleosomi attraverso il DNA. (B) Scansione 2D rappresentativa (a sinistra) e chimografo (a destra) di un cavo di DNA contenente nucleosoma marcato con LD655-H4. La lettura della forza associata (in basso) mostra un aumento della forza immediatamente quando il cavo viene spostato al canale 4 quando le posizioni OT sono mantenute costanti, indicando l'avvolgimento del nucleosoma. Traiettorie più luminose indicano più nucleosomi adiacenti situati entro il limite di diffrazione di ~300 nm. (C) Esempio di chimografo che mostra un evento di fotobleaching in 1 fase (freccia bianca) di un nucleosoma contenente LD655-H4. (D) Esempio di chimografo che mostra un evento di fotobleaching in 2 fasi (frecce bianche) di un nucleosoma contenente LD655-H4. (E) Frequenza relativa del numero di H4 marcati con LD655 per traiettoria stimata dalla loro intensità di fluorescenza. (F) Chimografo rappresentativo di un cavo legato con ottameri istonici in assenza di Nap1. La lettura della forza associata (in basso) rimane invariata anche se gli ottameri istonici legano il DNA. (G) Chimografo rappresentativo di un cavo di DNA contenente nucleosoma marcato con Cy3-H2A. La lettura della forza associata (in basso) mostra un aumento della forza immediatamente quando il cavo viene spostato al canale 4 (contenente ottameri e Nap1), poiché i nucleosomi si formano quando le posizioni OT vengono mantenute costanti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig02.jpg"> Figura 2: Saggio di srotolamento dei nucleosomi. (A) Schema della configurazione sperimentale descritta nel protocollo di srotolamento dei nucleosomi (fase 4). Il cavo di DNA contenente i nucleosomi è stato spostato al canale 3 contenente un tampone di immagine privo di proteine in cui la distanza tra le perline è stata aumentata e i nucleosomi sono stati scartati. (B) Chimografo rappresentativo di un cavo di DNA contenente nucleosoma tirato ad alte forze aumentando gradualmente la distanza tra le perline. La diminuzione dell'intensità della fluorescenza verso la perlina inferiore era probabilmente dovuta al fatto che il DNA si inclinava leggermente fuori linea dal fuoco di scansione. (C) La curva FD associata che mostra le transizioni indotte dalla forza dello srotolamento della curva interna che si verificano tra 8-37 pN. Il riquadro mostra una vista ingrandita di un esempio di transizione per la quale è possibile registrare e analizzare ulteriormente la distanza srotolata (ΔL = ~24 nm per il giro interno del DNA dei singoli nucleosomi) e la forza di transizione (transizione F). Per questo cavo, sono stati srotolati 26 nucleosomi e il cavo si è rotto a ~65 pN, come indicato dalla linea tratteggiata bianca nel chimografo. (D,E) Esempio: cavo contenente nucleosoma LD655-H4 tirato a forze elevate, in cui il numero di H4 per traiettoria è stimato tramite l'intensità della fluorescenza (indicata nel chimografo, D) e il numero di nucleosomi avvolti è stimato tramite la dimensione della variazione della distanza indotta dalla forza (indicata nella curva forza-distanza associata, E). (F,G) Un altro esempio come in (D,E). (H) Cavi di DNA (n = 5) tirati ad alte forze dopo essere stati incubati in un canale contenente solo Nap1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66579/66579fig03.jpg"> Figura 3: Visualizzazione dell'interazione proteina-cromatina. (A) Schema del setup sperimentale descritto nel protocollo di visualizzazione del legame proteico alla cromatina (fase 5). Il cavo di DNA contenente i nucleosomi è stato spostato al canale 5, contenente 10 nM di istone H1 linker marcato con Cy3 (verde). (B) Chimografo rappresentativo a due colori del legame di H1 a un cavo di DNA contenente nucleosomi. Gli eventi di colocalizzazione del nucleosoma H1 sono indicati con frecce bianche. La traiettoria del nucleosoma non legato è indicata con la freccia magenta. Le molecole H1 che si diffondono sul DNA nudo sono indicate con stelle verdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66579/66579fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

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