Name: Preparazione di campioni retinici per microscopia elettronica volumetrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 3 min 48 s
Description: Impara la preparazione di campioni retinali per microscopia elettronica volumetrica con FIB-SEM su tessuto di topo. Questo protocollo consente la ricostruzione 3D dei terminali dei fotorecettori con alta risoluzione nanometrica.

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<meta charset="utf8"></head><body>Visualizzazione delle strutture sinaptiche retiniche in 3D con la microscopia elettronica volumetrica

<ol><li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4 (9), 877-886 (2001).</li>
<li>Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+electron+microscopy+in+molecular+structural+biology%3A+A+historical+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Transmission electron microscopy in molecular structural biology: A historical survey.</a> Arch Biochem Biophys. 581, 3-18 (2015).</li>
<li>Varsano, N., Wolf, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+cellular+ultrastructure+in+three+dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of cellular ultrastructure in three dimensions.</a> Curr Opin Struct Biol. 76, 102444(2022).</li>
<li>Briggman, K. L., Bock, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+electron+microscopy+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Volume electron microscopy for neuronal circuit reconstruction.</a> Curr Opin Neurobiol. 22 (1), 154-161 (2012).</li>
<li>Titze, B., Genoud, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+scanning+electron+microscopy+for+imaging+biological+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure.</a> Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).</li>
<li>Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structure and function of ribbon synapses.</a> Trends Neurosci. 28 (1), 20-29 (2005).</li>
<li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog Retin Eye Res. 24 (6), 682-720 (2005).</li>
<li>Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+rod+and+cone+ribbon+synapses+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Transmission at rod and cone ribbon synapses in the retina.</a> Pflugers Arch. 473 (9), 1469-1491 (2021).</li>
<li>Moser, T., Grabner, C. P., Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+processing+at+ribbon+synapses+in+the+retina+and+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sensory processing at ribbon synapses in the retina and the cochlea.</a> Physiol Rev. 100 (1), 103-144 (2020).</li>
<li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+making+of+synaptic+ribbons%3A+how+they+are+built+and+what+they+do%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscientist%22%5BJournal%5D)">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15 (6), 611-624 (2009).</li>
<li>Kantardzhieva, A., Peppi, M., Lane, W. S., Sewell, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+of+immunoprecipitated+synaptic+ribbons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Prot+Res%22%5BJournal%5D)">Protein composition of immunoprecipitated synaptic ribbons.</a> J Prot Res. 11 (2), 1163-1174 (2011).</li>
<li>Zampighi, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conical+tomography+of+a+ribbon+synapse%3A+structural+evidence+for+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conical tomography of a ribbon synapse: structural evidence for vesicle fusion.</a> PLoS One. 6 (3), e16944(2011).</li>
<li>Barnes, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+diversity+of+the+rod+spherule%3A+A+study+of+serially+reconstructed+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Morphological diversity of the rod spherule: A study of serially reconstructed electron micrographs.</a> Plos One. 11 (3), e0150024(2016).</li>
<li>Xu, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+FIB-SEM+systems+for+large-volume+3D+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Enhanced FIB-SEM systems for large-volume 3D imaging.</a> Elife. 6, e25916(2017).</li>
<li>Crewe, A. V., Lin, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+backscattered+electrons+for+imaging+purposes+in+a+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">The use of backscattered electrons for imaging purposes in a scanning electron microscope.</a> Ultramicroscopy. 1 (3), 231-238 (1976).</li>
<li>Richards, R. G., Gwynn, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Backscattered+electron+imaging+of+the+undersurface+of+resin-embedded+cells+by+field-emission+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Backscattered electron imaging of the undersurface of resin-embedded cells by field-emission scanning electron microscopy.</a> J Microsc. 177, Pt 1 43-52 (1995).</li>
<li>Wergin, W. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+thin+and+thick+sections+of+biological+tissue+with+the+secondary+electron+detector+in+a+field-emission+scanning+electron+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Scanning%22%5BJournal%5D)">Imaging thin and thick sections of biological tissue with the secondary electron detector in a field-emission scanning electron microscope.</a> Scanning. 19 (6), 386-395 (1997).</li>
<li>Willingham, M. C., Rutherford, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+osmium-thiocarbohydrazide-osmium+%28OTO%29+and+ferrocyanide-reduced+osmium+methods+to+enhance+membrane+contrast+and+preservation+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">The use of osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) and ferrocyanide-reduced osmium methods to enhance membrane contrast and preservation in cultured cells.</a> J Histochem Cytochem. 32 (4), 455-460 (1984).</li>
<li>Buravkov, S. V., Chernikov, V. P., Buravkova, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+method+of+specimen+preparation+for+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Simple method of specimen preparation for scanning electron microscopy.</a> Bull Exp Biol Med. 151 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+diversity+in+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal diversity in the retina.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (4), 431-436 (2001).</li>
<li>Svara, F. N., Kornfeld, J., Denk, W., Bollmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+EM+reconstruction+of+spinal+cord+reveals+wiring+specificity+in+speed-related+motor+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Volume EM reconstruction of spinal cord reveals wiring specificity in speed-related motor circuits.</a> Cell Rep. 23 (10), 2942-2954 (2018).</li>
<li>Kubota, Y., Sohn, J., Kawaguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+volume+electron+microscopy+and+neural+microcircuit+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Large volume electron microscopy and neural microcircuit analysis.</a> Front Neural Circuits. 12, 98(2018).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+approach+using+cryofixation+for+high-resolution+3D+analysis+by+FIB-SEM%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">An optimized approach using cryofixation for high-resolution 3D analysis by FIB-SEM.</a> J Struct Biol. 212 (1), 107600(2020).</li>
<li>Seligman, A. M., Wasserkrug, H. L., Hanker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+staining+method+%28OTO%29+for+enhancing+contrast+of+lipid-containing+membranes+and+droplets+in+osmium+tetroxide-fixed+tissue+with+osmiophilic+thiocarbohydrazide+%28TCH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A new staining method (OTO) for enhancing contrast of lipid-containing membranes and droplets in osmium tetroxide-fixed tissue with osmiophilic thiocarbohydrazide (TCH).</a> J Cell Biol. 30 (2), 424-432 (1966).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2,2,2-Tribromoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Acetone Microscopia Elettronica</td><td>Scienza 10000</td><td></td></tr><tr><td>Amira 6.8</td><td>Thermo Fisher Scientific CaCl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2</td><td>Sigma</td><td>C-2661</td><td></td></tr><tr><td>Stampo da incasso</td><td>Beijing Zhongjingkeyi Technology</td><td>GP10590</td><td></td></tr><tr><td>Epon resina</td><td>Microscopia elettronica Scienza</td><td>14900</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>Microscopia elettronica Scienza</td><td>16020</td><td></td></tr><tr><td>Helios NanoLab 600i a doppio raggio SEM</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acido L-aspartico</td><td>Sigma</td><td>56-84-8</td><td></td></tr><tr><td>Nitrato di piombo</td><td>Sigma</td><td>10099-74-8</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>Un componente del tampone fosfato</td></tr><tr><td>NaH2PO4. H2O</td><td>Sigma</td><td>71507</td><td>Un componente del tampone fosfato</td></tr><tr><td>OsO4</td><td>TED PELLA</td><td>4008-160501</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia elettronica paraformaldeide</td><td>Scienza</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianuro di potassio</td><td>Sigma</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Cacodilato di sodio</td><td>Sigma</td><td>6131-99-3</td><td></td></tr><tr><td>Verniciatore sputter</td><td>Leica</td><td>ACE200</td><td></td></tr><tr><td>Tiocarboidrazide</td><td>Sigma</td><td>2231-57-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>TED PELLA</td><td>CA96049</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione di campioni retinici per microscopia elettronica volumetrica

Preparation of Retinal Samples for Volume Electron Microscopy

La Figura 1A mostra l'immagine dei terminali dei fotorecettori retinici preparati utilizzando il tradizionale metodo chimico a doppia fissazione e la Figura 1B mostra l'immagine dei terminali dei fotorecettori retinici preparati utilizzando il metodo OTO. Entrambi sono stati campionati mediante FIB-SEM. Si può vedere chiaramente che la struttura della membrana cellulare può essere mantenuta il più possibile utilizzando il metodo OTO e anche il contorno delle vescicole può essere visto chiaramente. Inoltre, anche il contrasto delle immagini ottenute utilizzando il metodo OTO è più chiaro.
La Figura 2 illustra il flusso di lavoro sperimentale impiegato per ricostruire le caratteristiche ultrastrutturali dei terminali dei fotorecettori. La ricostruzione si è concentrata su quattro tipi di terminali fotorecettoriali, tra cui i peduncoli del cono M, i peduncoli del cono S, le sferule dei bastoncelli 1 e i fiocchetti dei bastoncelli 2. L'enfasi principale è stata posta sui componenti essenziali, come i mitocondri, i nastri sinaptici e i pool di vescicole sinaptiche all'interno dei terminali dei fotorecettori.
La Figura 3 mostra i mitocondri ricostruiti e i nastri sinaptici nei terminali dei fotorecettori dei bastoncelli. In particolare, i nastri sinaptici delle sferule rod2 mostrano una caratteristica forma a ferro di cavallo, tipicamente caratterizzata da un singolo nastro per sferule. Inoltre, la Figura 2 evidenzia la presenza di due mitocondri nelle sferule dei bastoncelli, con una posizione coerente all'interno dello spazio centrale dei terminali, situati sopra i nastri sinaptici. Tutte le strutture sono state tracciate manualmente, pagina per pagina.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig01.jpg"> Figura 1: Esempi di immagini campionate utilizzando FIB-SEM per il metodo tradizionale di doppia fissazione chimica e il metodo OTO. (A) Metodo tradizionale di doppia fissazione chimica. (B) Metodo OTO. Barra di scala: 1000 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig02.jpg"> Figura 2: Flusso di lavoro di ricostruzione 3D per terminali fotorecettori utilizzando FIB-SEM. Dopo l'allineamento con il software di visualizzazione dei dati 3D, le immagini seriali sono state segmentate manualmente e renderizzate per ulteriori analisi. (A) Immagini seriali originali. (B) Immagini allineate. (C) Immagini segmentate. (D) Immagini ricostruite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66589/66589fig03.jpg"> Figura 3: Ricostruzione 3D. Le immagini rappresentative della ricostruzione 3D raffigurano i terminali dei fotorecettori in bianco, i mitocondri in arancione e i nastri sinaptici in blu. Barra della scala: 500 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66589/66589fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Preparazione di campioni retinici per microscopia elettronica volumetrica

Volume electron microscopy (Volume EM) has emerged as a powerful tool for visualizing the 3D structure of cells and tissues with nanometer-level ...

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Il protocollo qui descritto è per la valutazione strutturale di una preparazione retinica a montaggio intero. Ciò include le descrizioni della dissezione tissutale, il montaggio su un inserto di membrana in politetrafluoroetilene idrofilizzato (PTFE), il caricamento del bolo con marcatori fluorescenti e un confronto della fissazione con carbodiimmide e paraformaldeide per l'analisi immunoistochimica dei componenti cellulari e sinaptici.

Protocollo ottimizzato per la preparazione dell'intero montaggio retinico per l'imaging e l'immunoistochimica

Formazione immagine del tessuto retinico può fornire informazioni di cella singola che non possono essere raccolti dai metodi biochimici tradizionali. Questo protocollo descrive la preparazione delle fette della retina dallo zebrafish per imaging confocale. Fluorescenti geneticamente codificati sensori o indicatore coloranti permettono la visualizzazione di numerosi processi biologici in tipi distinti delle cellule retiniche.

Preparazione fette fresche della retina dallo Zebrafish adulto per Ex Vivo Imaging esperimenti

Dimostriamo di tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la visualizzazione di immunohistochemical di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.

Cryo-sezioni della retina, intero-monta e ipotonico Vasculature isolato preparazioni per la visualizzazione di Immunohistochemical dei Pericytes microvascolare

Qui, presentiamo un metodo per studiare la morfogenesi dei neuriti negli espianti retinici postnatali di topo mediante microscopia confocale time-lapse. Descriviamo un approccio per l'etichettatura sparsa e l'acquisizione di tipi di cellule retiniche e dei loro processi fini utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti che esprimono proteine fluorescenti mirate alla membrana in modo Cre-dipendente.

Imaging time-lapse dell'arborizzazione neuronale utilizzando l'etichettatura del virus adeno-associato sparso di popolazioni di cellule retiniche geneticamente mirate

Questo protocollo presenta due tecniche per isolare i compartimenti subcellulari dei fotorecettori murini a bastoncello per l'analisi delle proteine. Il primo metodo utilizza retina viva e carta da filtro di cellulosa per separare i segmenti esterni dell'asta, mentre il secondo impiega retina liofilizzata e nastro adesivo per rimuovere gli strati del segmento interno ed esterno dell'asta.

Due metodi di peeling per l'isolamento dei compartimenti cellulari fotorecettori nella retina del topo per l'analisi delle proteine

Descriviamo un metodo per separare in modo efficiente l'epitelio pigmentato retinico (RPE) dalla retina negli occhi umani e generare interi supporti piatti RPE / coroidi per analisi istologiche e morfometriche dell'RPE.

Generazione efficiente e coerente di epitelio/coroide pigmentato retinico Flatmounts da occhi umani per analisi istologiche

Questo lavoro presenta una preparazione alternativa della retina flatmount in cui la rimozione dei corpi cellulari dei fotorecettori consente una diffusione più rapida degli anticorpi e un migliore accesso con pipette patch ai neuroni retinici interni per esperimenti di immunoistochimica, ibridazione in situ ed elettrofisiologia.

Retina divisa come preparazione flatmount migliorata per lo studio dei neuroni dello strato nucleare interno nella retina dei vertebrati

Questo protocollo delinea le fasi dettagliate della microscopia immunoelettronica pre-incorporamento, con particolare attenzione all'esplorazione dei circuiti sinaptici e della localizzazione delle proteine nella retina.

Studio dei circuiti retinici e della localizzazione molecolare mediante microscopia immunoelettronica pre-incorporata

Questo protocollo fornisce una procedura di preparazione ottimizzata ed elaborata per campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione. È adatto per applicazioni che prevedono l'analisi delle sinapsi in organoidi retinici maturi.

Preparazione di campioni di organoidi retinici per la microscopia elettronica a trasmissione

I periciti nel sistema vascolare retinico sono stati esaminati mediante colorazione immunofluorescente con β del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine dopo iniezione retro-orbitale di lectina fluorescente di pomodoro. La retina marcata è stata ulteriormente trattata con il metodo di pulizia dei tessuti e montata per visualizzare le viste tridimensionali dei periciti che circondano il sistema vascolare retinico sotto un microscopio confocale.

Visualizzazione 3D dei periciti vascolari retinici nei topi mediante immunocolorazione 

Impara la preparazione di campioni retinali per microscopia elettronica volumetrica con FIB-SEM su tessuto di topo. Questo protocollo consente la ricostruzione 3D dei terminali dei fotorecettori con alta risoluzione nanometrica.

Preparazione di campioni retinici per microscopia elettronica volumetrica

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