Name: Rilevamento dellinterazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-01T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Scopri un metodo semplificato per rilevare l'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale. Questo protocollo riduce la perdita di campione e migliora l'accuratezza dei dati senza attrezzature specializzate.

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Esprimiamo il nostro sincero apprezzamento per il sostegno finanziario ricevuto dal Progetto di Costruzione di Connotazione del 14° Piano Quinquennale dell'Università di Medicina Tibetana (2022ZYYGH12), dalle Materie Aperte 2022 del Laboratorio Chiave di Medicina Tibetana e Istruzione di Base del Ministero dell'Istruzione presso l'Università di Medicina Tibetana (ZYYJC-22-04), dal Programma Chiave di Ricerca e Sviluppo di Ningxia (2023BEG02012), e lo Xinglin Scholar Research Promotion Project dell'Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu (XKTD2022013).

La soluzione composta, la soluzione proteica e il colorante sono stati introdotti in una soluzione PBS. Successivamente, i campioni sono stati sottoposti a riscaldamento graduale utilizzando un bagno secco di riscaldamento digitale e la stabilità termica delle proteine è stata valutata misurando la variazione dell'intensità della fluorescenza all'interno del sistema complesso. I passaggi dettagliati sono descritti di seguito e la Figura 1 illustra una panoramica del protocollo.
1. Preparazione della soluzione
<ol><li>Preparare una soluzione di umbelliferone da 1 mM aggiungendo 0,1 mg di umbelliferone a 616,75 μL di soluzione di DMSO (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare una soluzione proteica CD40 da 200 μg/mL aggiungendo 0,1 mg di CD40 a 500 μL di soluzione di ddH2O (vedere la Tabella dei materiali).</li>
	<li>Preparare una soluzione di colorante arancione 500x aggiungendo 1 μl di colorante arancione 5000x a 9 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (vedere la tabella dei materiali). NOTA: Eseguire le operazioni di cui sopra sul ghiaccio e, poiché la pipetta ha un intervallo minimo di 0,1 μl, diluire inizialmente il colorante proteico arancione di un fattore 10 per facilitare l'uso successivo.</li>
</ol>2. Test delle prestazioni del colorante
<ol><li>Aggiungere il colorante arancione 500x a una soluzione PBS e diluirlo per ottenere il colorante: rapporti PBS di 1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:4000. NOTA: Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO non superi il 2% (v/v).</li>
	<li>Accendere il lettore di micropiastre fluorescenti e preriscaldarlo per 10 minuti.</li>
	<li>Aprire il computer e il software di acquisizione dati in sequenza (vedi Tabella dei materiali).</li>
	<li>Fare clic su Strumento, scegliere il modello di micropiastra a fluorescenza corrispondente e selezionare OK nel software di acquisizione dati. NOTA: Attendere che la micropiastra a fluorescenza finisca di preriscaldarsi e visualizzare la temperatura sul pannello prima di aprire il software di acquisizione dati per garantire una corretta connessione tra lo strumento e il software.</li>
	<li>Fare clic su Impostazioni di acquisizione e selezionare Fluorescenza nel software di acquisizione dati.</li>
	<li>Modificare il programma nell'interfaccia Lunghezze d'onda: Lm1 = 470 nm, 570 nm, quindi selezionare OK. NOTA: Il colorante arancione può essere eccitato con luce UV a 300 nm o luce visibile a 470 nm e l'emissione può essere misurata a 570 nm.</li>
	<li>Aggiungere diverse concentrazioni di colorante arancione (1:500, 1:1000, 1:2000 e 1:4000) e PBS a piastre a 96 pozzetti a 100 μL/pozzetto. NOTA: Sciogliere la soluzione in DMSO prima di aggiungerla al PBS e agitarla a 2000 x g accuratamente durante il processo di preparazione per garantire la completa dissoluzione a causa della tendenza del colorante a precipitare.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti nella fase di rilevamento dello strumento, fare clic sul pulsante Leggi nel software di acquisizione dati e misurare la fluorescenza di ciascuna concentrazione di colorante 13 volte a temperatura ambiente, con un intervallo di 2 minuti ogni volta.</li>
	<li>Fare clic sul pulsante Esporta dopo ogni determinazione, selezionare Esporta in XML XLS TXT, scegliere Tutte le lastre, quindi selezionare Piastra in formato di output e infine fare clic su OK per salvare i dati in una cartella in formato "XLS" per ulteriori analisi. NOTA: Questi passaggi aiutano a determinare l'impatto della misurazione continua sull'autofluorescenza del colorante arancione a temperatura ambiente e a identificare la concentrazione di colorazione ottimale.</li>
	<li>Accendere il bagno a secco con agitazione digitale, impostare la temperatura di riscaldamento a 35 °C e il tempo di riscaldamento a 2 min.</li>
	<li>Preparare il rapporto di diluizione ottimale del colorante in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e immergerlo nel bagno secco di agitazione riscaldante digitale per 2 minuti.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di PBS e la soluzione colorante, riscaldata a 35 °C, alla piastra a 96 pozzetti a un volume di 100 μl per pozzetto.</li>
	<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti nella fase di rilevamento dello strumento e fare clic sul pulsante Leggi nel software di acquisizione dati.</li>
	<li>Impostare la temperatura di riscaldamento a 40 °C e il tempo di riscaldamento a 2 min.</li>
	<li>Pipettare nuovamente la soluzione colorante nella piastra a 96 pozzetti nella provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e riscaldarla nello strumento per 2 minuti.</li>
	<li>Ripetere le operazioni dei passaggi 2.12-2.15 e 2.9 per testare l'assorbanza della soluzione colorante rispettivamente a 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C. NOTA: Questi passaggi aiutano a determinare la stabilità dell'autofluorescenza del colorante arancione in riscaldamento continuo in un gradiente da 35 °C a 95 °C. È fondamentale lavorare rapidamente per evitare rapidi cali di temperatura o l'aggiunta di un liquido sbagliato, che potrebbe portare a errori sperimentali.</li>
</ol>3. Rilevamento della temperatura di fusione (Tm) della proteina
<ol><li>Combinare la proteina CD40 e il colorante arancione con la soluzione PBS per ottenere concentrazioni finali rispettivamente di 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL e 1:500.</li>
	<li>Ripetere le operazioni descritte nei passaggi 2.2-2.6 e 2.10-2.16 per valutare l'assorbanza della soluzione proteica CD40 a temperature rispettivamente di 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.9 per salvare e analizzare i dati e successivamente calcolare il valore Tm utilizzando il software di analisi dei dati (vedere la tabella dei materiali).</li>
	<li>Aggiungere la proteina CD40, l'umbelliferone e il colorante arancione alla soluzione PBS per ottenere concentrazioni finali di 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μM e 1:500, rispettivamente. NOTA: Un vortice vigoroso durante la preparazione della soluzione è essenziale per garantire una distribuzione uniforme del colorante, della proteina CD40 e dell'umbelliferone nel PBS.</li>
	<li>Ripetere le operazioni dei passaggi 3.2-3.3 per misurare l'assorbanza della soluzione dei complessi CD40-umbelliferone a temperature di 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C e 95 °C, rispettivamente. NOTA: Questi passaggi sono stati condotti per determinare i valori di Tm della proteina CD40 e dei complessi CD40-umbelliferone, con l'obiettivo di identificare la concentrazione ottimale di legame della proteina CD40 con umbelliferone.</li>
</ol>

Rilevamento ad alta sensibilità del legame composto-proteina mediante fluorescenza

<ol><li>Cairang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+on+the+standardization+of+clinical+application+of+Tibetan+medicine+%26%2334%3Bfive+roots%26%2334%5BTitle%5D)+AND+%22Guid+J+Trad+Chin+Med+Pharm%22%5BJournal%5D)">Study on the standardization of clinical application of Tibetan medicine &#34;five roots&#34.</a> Guid J Trad Chin Med Pharm. 28 (11), 133136(2022).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Xigui+extract+on+immunosuppressive+mice+induced+by+cyclophosphamide%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Hosp+Pharm%22%5BJournal%5D)">Effects of Xigui extract on immunosuppressive mice induced by cyclophosphamide.</a> Chin J Hosp Pharm. 37 (03), 244-247 (2017).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Vicatia+thibertica+de+boiss+on+immunologic+and+hematopoietic+function+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dali+Univ%22%5BJournal%5D)">Effects of Vicatia thibertica de boiss on immunologic and hematopoietic function of mice.</a> J Dali Univ. 2 (02), 6-10 (2017).</li>
<li>Dong, S., Zhang, X., Hu, Y., Gong, X., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+constituents%2C+quality+control+and+pharmacology+research+progress+of+Xigui%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Ethnomed+Ethnopharm%22%5BJournal%5D)">Chemical constituents, quality control and pharmacology research progress of Xigui.</a> Chin J Ethnomed Ethnopharm. 27 (13), 40-42 (2018).</li>
<li>Lu, Z., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+flavone+extract+from+Shuiqin+%28Oenanthe+Javanica%29+on+immune+function+of+immunosuppression+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Trad+Med+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Effects of total flavone extract from Shuiqin (Oenanthe Javanica) on immune function of immunosuppression mice.</a> Chin J Trad Med Sci Technol. 23 (04), 423-425 (2016).</li>
<li>Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+agonist+antibodies+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">CD40 agonist antibodies in cancer immunotherapy.</a> Annu Rev Med. 71, 47-58 (2020).</li>
<li>Grewal, I. S., Flavell, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+and+CD154+in+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40 and CD154 in cell-mediated immunity.</a> Annu Rev Immunol. 16, 111-135 (1998).</li>
<li>Long, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN%CE%B3+and+CCL2+cooperate+to+redirect+tumor-infiltrating+monocytes+to+degrade+fibrosis+and+enhance+chemotherapy+efficacy+in+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">IFNγ and CCL2 cooperate to redirect tumor-infiltrating monocytes to degrade fibrosis and enhance chemotherapy efficacy in pancreatic carcinoma.</a> Cancer Discov. 6 (4), 400-413 (2016).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+regulatory+B+cells+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Res%22%5BJournal%5D)">The roles of regulatory B cells in cancer.</a> J Immunol Res. 2014, 215471(2014).</li>
<li>Eliopoulos, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+induces+apoptosis+in+carcinoma+cells+through+activation+of+cytotoxic+ligands+of+the+tumor+necrosis+factor+superfamily%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">CD40 induces apoptosis in carcinoma cells through activation of cytotoxic ligands of the tumor necrosis factor superfamily.</a> Mol Cell Biol. 20 (15), 5503-5515 (2000).</li>
<li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2 (9), 2212-2221 (2007).</li>
<li>Rosa, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meltdown%3A+A+Tool+to+help+in+the+interpretation+of+thermal+melt+curves+acquired+by+differential+scanning+fluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">Meltdown: A Tool to help in the interpretation of thermal melt curves acquired by differential scanning fluorimetry.</a> J Biomol Screen. 20 (7), 898-905 (2015).</li>
<li>Hellman, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+based+assessments+of+the+thermal+and+kinetic+stability+of+peptide-MHC+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry based assessments of the thermal and kinetic stability of peptide-MHC complexes.</a> J Immunol Methods. 432, 95-101 (2016).</li>
<li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6 (6), 429-440 (2001).</li>
<li>Gorny, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+nano-differential+scanning+fluorimetry+and+microscale+thermophoresis+to+investigate+VDAC1+interaction+with+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J+EnzymeInhib+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Combining nano-differential scanning fluorimetry and microscale thermophoresis to investigate VDAC1 interaction with small molecules.</a> J EnzymeInhib Med Chem. 38 (1), 2121821(2023).</li>
<li>Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+denaturation+methods+in+the+study+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Thermal denaturation methods in the study of protein folding.</a> Methods Enzymol. 259, 144-168 (1995).</li>
<li>Phiri, M. J., Mofokeng, J. P., Phiri, M. M., Mngomezulu, M., Tywabi-Ngeva, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical%2C+thermal+and+morphological+properties+of+polybutylene+succinate-waste+pineapple+leaf+fibres+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Heliyon%22%5BJournal%5D)">Chemical, thermal and morphological properties of polybutylene succinate-waste pineapple leaf fibres composites.</a> Heliyon. 9 (11), 21238(2023).</li>
<li>Zhou, C., Yu, M., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparation+of+three+measuring+methods+for+thermodynamic+stability+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Test+Technol+Instruments%22%5BJournal%5D)">Comparation of three measuring methods for thermodynamic stability of protein.</a> Anal Test Technol Instruments. 27 (04), 252-259 (2021).</li>
<li>Hou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside+intensifies+mitochondrial+function+of+CoCl2-damaged+HT22+cells+by+stimulating+PI3K-AKT-MAPK+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway.</a> Phytomedicine. 109, 154568(2023).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salidroside%2C+a+phenyl+ethanol+glycoside+from+Rhodiola+crenulata%2C+orchestrates+hypoxic+mitochondrial+dynamics+homeostasis+by+stimulating+Sirt1%2Fp53%2FDrp1+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ethnopharmacol%22%5BJournal%5D)">Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling.</a> J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).</li>
<li>Magnez, R., Bailly, C., Thuru, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+thermophoresis+as+a+tool+to+study+protein+interactions+and+their+implication+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Microscale thermophoresis as a tool to study protein interactions and their implication in human diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (14), 7672(2022).</li>
<li>Kamat, V., Rafique, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+binding+kinetic+assay+on+the+bio-layer+interferometry+%28BLI%29+biosensor+to+characterize+antibody-antigen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions.</a> Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).</li>
<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isothermal+titration+calorimetry%3A+experimental+design%2C+data+analysis%2C+and+probing+macromolecule%2Fligand+binding+and+kinetic+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li>
<li>Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atosiban+and+Rutin+exhibit+anti-mycobacterial+activity+-+An+integrated+computational+and+biophysical+insight+toward+drug+repurposing+strategy+against+Mycobacterium+tuberculosis+targeting+its+essential+enzyme+HemD%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Atosiban and Rutin exhibit anti-mycobacterial activity - An integrated computational and biophysical insight toward drug repurposing strategy against Mycobacterium tuberculosis targeting its essential enzyme HemD.</a> Int J Biol Macromol. 253, 127208(2023).</li>
<li>Grädler, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+and+structural+characterization+of+the+impacts+of+MET+phosphorylation+on+tepotinib+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Biophysical and structural characterization of the impacts of MET phosphorylation on tepotinib binding.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105328(2023).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+fluorimetry+and+its+application+in+the+study+of+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Life%22%5BJournal%5D)">Differential scanning fluorimetry and its application in the study of protein.</a> Chemistry of Life. 38 (03), 351-357 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il DSF, noto anche come saggio di spostamento termico o saggio di fluorescenza termica, è una tecnica impiegata per rilevare il processo di denaturazione termica delle proteine nei campioni monitorando le variazioni del segnale di fluorescenza del campione di prova o del colorante durante un lento aumento programmato della temperatura. Inizialmente istituito da Pantoliano14, il DSF funge da metodo ad alto rendimento. La procedura principale prevede l'aumento della temperatura su una piastra riscaldata controllata da computer, l'emissione di luce di eccitazione utilizzando una lampada ultravioletta a lunga lunghezza d'onda e l'acquisizione delle variazioni di intensità del segnale fluorescente derivanti dal legame di coloranti fluorescenti alle proteine attraverso una fotocamera di formazione di fase con dispositivo ad accoppiamento di carica.
Il valore Tm, un indicatore cruciale che caratterizza la struttura di livello superiore delle proteine, rappresenta la temperatura corrispondente alla metà della denaturazione del farmaco proteico durante un aumento di temperatura. Valori di Tm più elevati suggeriscono un maggiore fabbisogno di temperatura per la denaturazione delle proteine, indicando una struttura proteica più stabile. Il metodo attualmente riconosciuto per rilevare i valori di Tm è la calorimetria differenziale a scansione (DSC), che è stata avviata negli anni '6015. Il DSC misura la differenza di potenza erogata all'oggetto in prova e a un oggetto di riferimento in funzione della temperatura sotto controllo della temperatura programmato per ottenere la quantità di calore assorbito e scaricato. Si pone come il gold standard per l'analisi di stabilità termica16,17.
Il DSF ha guadagnato un uso diffuso grazie a tre vantaggi rispetto al DSC: (1) Minor consumo di campione: il DSC richiede in genere un volume di campione di 400 μL, mentre il DSF richiede solo 20-25 μL. (2) Intervallo di concentrazione più ampio: il DSC richiede generalmente concentrazioni proteiche di 0,2-2 mg/mL per ottenere un picco di denaturazione significativo, mentre il DSF può analizzare campioni nell'intervallo di 0,005-200 mg/mL. (3) Maggiore produttività dei campioni: DSC può analizzare un solo campione alla volta, mentre DSF può scansionare contemporaneamente fino a 96 o più campioni18. Grazie a questi vantaggi, il DSF è ampiamente utilizzato nello studio della stabilità delle proteine, della struttura e della conformazione delle proteine, delle interazioni proteina-ligando e degli effetti di stabilizzatori proteici, inibitori, cofattori e altro ancora.
Oltre alla DSF e alla DSC, esistono diverse altre tecniche di interazione molecolare. La risonanza plasmonica di superficie (SPR) è un fenomeno ottico che si verifica all'interfaccia di due mezzi e può essere indotta da fotoni o elettroni. Implica una riflessione totale quando la luce viene emessa da un mezzo otticamente denso in un mezzo otticamente scarso. L'angolo in cui si verifica la risonanza plasmonica di superficie è noto come angolo SPR. I biosensori SPR utilizzano le variazioni degli angoli SPR per monitorare le interazioni intermolecolari in tempo reale19,20. La termoforesi su microscala (MST) è una tecnica per analizzare le interazioni biomolecolari rilevando i cambiamenti nelle dimensioni, nella carica e nello strato di idratazione delle biomolecole causati dal legame. Registra i cambiamenti di fluorescenza nella regione irradiata da un laser a infrarossi all'interno del campione prima, durante e dopo l'accensione del laser, consentendo determinazioni relativamente rapide21. L'interferometria a biostrato (BLI) misura le reazioni della superficie del sensore tracciando le variazioni di spostamento nello spettro dell'interferometria. Negli esperimenti BLI, una molecola viene immobilizzata sulla superficie di un sensore sommergibile per rilevare un'altra molecola che può legarsi ad essa. L'interazione di legame induce lo spostamento dell'interferenza e il monitoraggio in tempo reale di questo cambiamento di spostamento produce la curva di legame22. La calorimetria a titolazione isotermica (ITC) quantifica le interazioni biomolecolari misurando direttamente il calore rilasciato o assorbito durante il legame biomolecolare. Fornisce informazioni termodinamiche complete sulle interazioni molecolari23. Rispetto a queste tecnologie di interazione molecolare, la DSF ha requisiti inferiori per strumenti, materiali di consumo e tecniche operative. Nella maggior parte dei laboratori è in grado di rilevare in modo efficiente le interazioni tra composti e proteine.
La procedura operativa della tecnologia DSF è relativamente semplice. Inizialmente, i campioni di sostanza bianca, i tamponi di reazione, i coloranti fluorescenti e i ligandi candidati vengono combinati in un sistema di reazione. Questo sistema viene quindi trasferito a uno strumento di PCR a fluorescenza in cui vengono impostate le condizioni di riscaldamento e rilevamento per la determinazione della fluorescenza24,25. Il colorante proteico più comunemente usato per la DSF è attualmente il colorante arancione e lo strumento di rilevamento è tipicamente uno strumento di PCR quantitativa a fluorescenza26. Tuttavia, poiché la lunghezza d'onda di eccitazione del colorante arancione è di 470 nm e la lunghezza d'onda di emissione è di 570 nm, non tutti gli strumenti di PCR quantitativa a fluorescenza sul mercato sono una corrispondenza perfetta. Pertanto, questo studio adotta un lettore di micropiastre fluorescenti come nuovo strumento di rilevamento per esplorare le interazioni proteina-ligando.
Questo approccio offre due vantaggi principali rispetto alla DSF utilizzando uno strumento di PCR quantitativa fluorescente. In primo luogo, la gamma di lunghezze d'onda del marcatore enzimatico fluorescente può essere personalizzata, rendendola più compatibile con la gamma di lunghezze d'onda del colorante e garantendo un rilevamento della fluorescenza più accurato. In secondo luogo, il programma di uno strumento di PCR quantitativa a fluorescenza non può essere interrotto una volta avviato, rendendo difficile la risoluzione di eventuali problemi durante il processo di riscaldamento. Al contrario, un lettore di micropiastre fluorescente consente l'eliminazione delle interferenze modificando iterativamente il rapporto del sistema e le condizioni di rilevamento durante tutto il processo di rilevamento. Tuttavia, l'uso di un lettore di micropiastre fluorescenti per DSF presenta anche alcuni svantaggi, in particolare la quantità relativamente grande di campione richiesta, che in genere varia da 50 a 200 μL, mentre la DSF tradizionale utilizza in genere 20-25 μL di campione.
In questo articolo, è stata condotta la validazione del DSF basato su un lettore di micropiastre fluorescenti per la rilevazione della Tm utilizzando la proteina CD40 e l'umbelliferone nell'intervallo di concentrazione di 5-20 μg/mL. I risultati hanno dimostrato l'elevata specificità e accuratezza del metodo, affermandone l'idoneità per il rilevamento della Tm. Il successivo confronto dei risultati del rilevamento di Tm a diverse concentrazioni di campione ha rivelato una tendenza decrescente nel valore di Tm della proteina CD40 all'aumentare della concentrazione, suggerendo un potenziale effetto della concentrazione sul rilevamento di Tm (Figura 3). Inoltre, lo studio ha rilevato un aumento del valore Tm della proteina CD40 dopo l'aggiunta di umbelliferone al sistema rispetto a prima dell'aggiunta. Ciò indica che umbelliferone possiede la capacità di legarsi alla proteina CD40, portando a un miglioramento della stabilità termica della proteina CD40 dopo la loro combinazione (Figura 3).
Le fasi critiche del protocollo sono state identificate come le fasi da 2.7 a 2.16, il cui completamento con successo influenza direttamente il successivo rilevamento della fluorescenza proteica. In sintesi, questo studio ha stabilito un nuovo metodo di rilevamento del DSF basato sui principi della tecnologia DSF, utilizzando la proteina CD40 e l'umbelliferone come esempio. Il metodo ha analizzato efficacemente la forza di legame tra proteine e ligandi utilizzando un lettore di micropiastre fluorescente. Inoltre, questa tecnica può essere estesa per l'analisi della stabilità delle proteine e la ricerca sulla struttura delle proteine, approfondendo l'applicazione della tecnologia DSF nello studio delle vie di segnalazione cellulare e nell'esplorazione della patogenesi della malattia.

La Vicatia thibetica H. Boissieu, pianta della famiglia delle ombrellifere, è comunemente usata nella medicina tibetana e rappresenta uno dei componenti essenziali dei cinque ingredienti di base (Polygonatum sibiricum Delar. ex Redoute, Asparagus cochinchinensis (Lour.) Merr, Vicatia thibetica H. Boissieu, Oxybaphus himalaicus Edgew., e Gymnadenia conopsea (L.) R. Br.) 1. Distribuita principalmente nel sud-ovest della Cina, come lo Yunnan nord-occidentale, il Sichuan occidentale, il Tibet e altre aree, la sua radice essiccata funge da sostituto locale dell'Angelica1. La radice, nota per la sua fragranza, è spesso utilizzata come condimento per lo stufato e le foglie, denominate sedano tibetano, contribuiscono a piatti deliziosi. Pertanto, la Vicatia thibetica ha un significato non solo come pianta medicinale unica, ma anche come fonte di cibo in Tibet.
Sia la ricerca nazionale che quella internazionale indicano che la Vicatia thibetica possiede proprietà ricostituenti del sangue e tonificanti del qi (potere o energia), benefiche per regolare le mestruazioni. Viene impiegato per affrontare i sintomi della dismenorrea mestruale irregolare causata da palpitazioni e carenza di sangue, esibendo effetti farmacologici come la regolazione antiossidante dell'immunità corporea2. L'estratto alcolico di Vicatia thibetica ha dimostrato la capacità di ripristinare la massa corporea e l'indice degli organi nei topi immunocompromessi indotta dalla ciclofosfamide. Inoltre, aumenta l'attività della superossido dismutasi nel siero e riduce il contenuto di malondialdeide, suggerendo un miglioramento della capacità antiossidante e un effetto equilibrante sulla perossidazione lipidica 2,3. Allo stesso tempo, aumenta il numero di cellule del sangue e l'emoglobina, che non solo riflette oggettivamente la funzione ematopoietica del corpo, ma svolge anche un ruolo cruciale nel sistema immunitario 2,3.
L'ombrellifero, caratterizzato da cristalli aciculari e sapore amaro, possiede un piccolo peso molecolare, è volatile e può essere distillato con vapore. Sublima facilmente, ha una bassa solubilità in acqua e un'elevata solubilità in materia organica. Essendo uno dei principali componenti chimici di Vicatia thibetica, umbelliferone mostra effetti immunomodulatori sull'immunità cellulare, sull'immunità umorale e sull'immunità non specifica in modelli murini di immunosoppressione indotta da idrocortisone 4,5.
La molecola di superficie cellulare CD40, un membro della superfamiglia dei recettori del fattore di necrosi tumorale, è ampiamente espressa nelle cellule immunitarie6. Il suo ligando omologo, CD154, noto anche come CD40L, è una proteina transmembrana di tipo II espressa dai linfociti T attivati. L'attivazione del CD40 ha la capacità di sovraregolare l'espressione di molecole co-stimolatorie sulla superficie delle cellule dendritiche (DC) e dei monociti. Questo processo promuove la funzione di presentazione dell'antigene delle molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) e attiva ulteriormente le cellule T CD8+7.
I macrofagi svolgono un ruolo cruciale nella formazione e nella regolazione del microambiente tumorale e l'attivazione di CD40 può migliorare il rimodellamento del microambiente tumorale da parte dei macrofagi8. L'attivazione del segnale CD40 influenza in modo significativo la proliferazione e l'attivazione delle cellule B. Le cellule B, quando attivate dal CD40, possono funzionare come efficaci cellule presentanti l'antigene. Presentano antigeni, generano attività delle cellule T effettrici e quindi contribuiscono agli effetti antitumorali9. Inoltre, l'attivazione del CD40 nelle cellule tumorali può indurre l'apoptosi e inibire la crescita tumorale10. Il CD40 trasduce principalmente i segnali controllando l'attività delle protein chinasi tirosina non recettoriali, tra cui Lyn, Fyn, Syk e altre. Inoltre, ha la capacità di stimolare le proteine Bcl-xL, Cdk4 e Cdk6, attivare i fattori di trascrizione Rel/NF-kB e fosforilare CG-2 e PI3K10.
Il metodo della fluorescenza a scansione differenziale (DSF) è ampiamente impiegato per valutare l'impatto di varie condizioni ambientali, come la composizione del tampone, la temperatura e i ligandi di piccole molecole, sulla stabilità termica delle strutture proteiche. Il colorante comunemente usato per il DSF è un colorante arancione, sensibile all'ambiente e idrofobo. In condizioni normali, la struttura proteica è ripiegata, nascondendo internamente il suo segmento idrofobico. All'aumentare della temperatura, la regione idrofobica della proteina diventa più esposta, provocando una graduale rottura della struttura proteica naturale. Il colorante si lega selettivamente a questa porzione proteica esposta, amplificandone la fluorescenza. I valori di Tm vengono quindi calcolati monitorando le variazioni nel rilevamento del segnale di fluorescenza11. In una certa misura, le variazioni dei valori di Tm possono misurare i cambiamenti nella stabilità delle proteine dovuti a mutazioni, cambiamenti nei tamponi o legame con i ligandi. Inoltre, può indicare alterazioni strutturali durante il processo di ripiegamento delle proteine12. Questo approccio offre dati precisi, un ampio intervallo di temperatura, un'elevata sensibilità e una perdita minima di campioni proteici13.
In questo studio, la determinazione della fluorescenza è stata condotta utilizzando un lettore di micropiastre fluorescenti invece di un apparecchio di reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR) a fluorescenza. Questa modifica consente la rilevazione del DSF nei laboratori privi di uno strumento di PCR quantitativa fluorescente, rendendo il metodo meno complesso e riducendo i passaggi necessari per la configurazione dello strumento, semplificando così il processo sperimentale. Tuttavia, ci sono alcuni svantaggi in questo approccio. Mentre la complessità è ridotta, la procedura diventa più macchinosa. È necessario il rilevamento manuale della fluorescenza a diverse temperature e non è possibile ottenere una raccolta automatica e continua della fluorescenza dal sistema. Pertanto, questo studio ha utilizzato la tecnica DSF per esplorare l'interazione tra la proteina CD40 e l'umbelliferone, fornendo nuove intuizioni sui meccanismi molecolari della medicina tibetana.

<table><tbody><tr><td>Proteina CD40</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-P75408</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Boster Biological Technology Co., Ltd</td><td>PYG0040</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre multifunzione FlexStation 3</td><td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td><td>Software FlexStation 3</td><td></td></tr><tr><td>OriginPro 8</td><td>OriginLab Corporation</td><td>v8.0724 (B724)</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato ( 1x)</td><td>Gibco</td><td>8120485</td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro 7.1</td><td>Shanghai Meigu Molecular Instruments Co., LTD</td><td>SoftMax Pro 7.1</td><td></td></tr><tr><td>SSYPRO colorante arancione</td><td>Sigma</td><td>S5942</td><td></td></tr><tr><td>Umbelliferone</td><td>Shanghai Yuanye Biotechnology Co.</td><td>B21854</td><td></td></tr></tbody></table>

rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone cd40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

Detection of CD40 Protein-Umbelliferone Interaction via Differential Scanning Fluorescence

Lo studio delle interazioni tra diverse molecole è un aspetto cruciale per comprendere la patogenesi della malattia e lo screening dei bersagli farmacologici. L'umbelliferone, un ingrediente attivo della medicina tibetana Vicatia thibetica, mostra un effetto immunomodulatore con un meccanismo sconosciuto. La proteina CD40 è un bersaglio chiave nella risposta immunitaria. Pertanto, questo studio utilizza il principio della tecnologia di fluorescenza a scansione differenziale per analizzare le interazioni tra la proteina CD40 e l'umbelliferone utilizzando marcatori enzimatici fluorescenti. Inizialmente, la stabilità del colorante fluorescente arancione proteico è stata verificata sperimentalmente ed è stato determinato il rapporto di diluizione ottimale di 1:500. Successivamente, è stato osservato che il valore di fusione della temperatura (Tm) della proteina CD40 tendeva a diminuire con l'aumentare della concentrazione. È interessante notare che l'interazione tra la proteina CD40 e l'umbelliferone migliora la stabilità termica della proteina CD40. Questo studio rappresenta il primo tentativo di rilevare il potenziale di legame di composti e proteine di piccole molecole utilizzando micropiastre a fluorescenza e coloranti fluorescenti. La tecnica è caratterizzata da un'elevata sensibilità e accuratezza, promettenti progressi nei campi della stabilità delle proteine, della struttura delle proteine e delle interazioni proteina-ligando, facilitando così ulteriori ricerche ed esplorazioni.

Il colorante arancione ha costantemente mostrato un'eccitazione stabile della fluorescenza a Ex = 470 nm e Em = 570 nm, sia a temperatura ambiente che a temperature elevate. È stato determinato un rapporto di diluizione ottimale di 1:500 (Figura 2A, B). Il rilevamento del valore di Tm si è rivelato difficile quando la concentrazione della proteina CD40 era inferiore a 15 μg/mL (Figura 3A, B). Tuttavia, a una concentrazione di 15 μg/mL, era rilevabile un valore di Tm stabile di 51,82 °C, che è diminuito a 45,79 °C con un aumento della concentrazione della proteina CD40 (Figura 3C, D).

Come illustrato nella Figura 3, è evidente che il legame della proteina CD40 con umbelliferone influenza il valore Tm della proteina CD40. In particolare, i valori di Tm della proteina CD40 a concentrazioni di 15 μg/mL e 20 μg/mL, così come di 10 μM di umbelliferone, sono aumentati rispettivamente a 62,08 °C e 65,27 °C.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig1.jpg"> Figura 1: Panoramica del protocollo. Diagramma di flusso del processo di registrazione della capacità di legame della proteina CD40 all'umbelliferone basato sul principio DSF utilizzando un lettore di micropiastre fluorescente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig2.jpg"> Figura 2: Screening dei rapporti di diluizione del colorante arancione e prove di stabilità. (A) Stabilità alla fluorescenza di coloranti con diversi rapporti di diluizione a temperatura ambiente. (B) Stabilità alla fluorescenza di coloranti con un rapporto di diluizione di 1:500 a 35-95 °C. Le barre di errore indicano la media ± SEM, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66610/66610fig3.jpg"> Figura 3: Grafici dei risultati dell'utilizzo di un lettore di micropiastre fluorescenti per registrare la capacità di legame della proteina CD40 all'umbelliferone secondo il principio DSF. (A-D) Profili Tm di 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL CD40 Protein e CD40 + 10 μM umbelliferone, rispettivamente. Le barre di errore indicano la media ± SEM, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66610/66610fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un metodo unico per rilevare il legame tra composti e molecole proteiche, offrendo i vantaggi di una perdita minima di campioni proteici e di un'elevata precisione dei dati.

Rilevamento dell'interazione proteina-umbelliferone CD40 tramite fluorescenza a scansione differenziale

The investigation of interactions between different molecules is a crucial aspect of understanding disease pathogenesis and screening for drug targets. ...

Il nostro protocollo offre un vantaggio significativo consentendo l'uso senza attrezzature specializzate. A differenza dei tradizionali metodi di PCR quantitativa a fluorescenza, semplifica il processo sperimentale, richiedendo meno passaggi e riducendo la complessità complessiva, rendendolo più sicuro e facile da condurre. Questo esperimento richiede che l'operatore abbia molta familiarità con la procedura sperimentale e il lettore di micropiastre fluorescenti, e che non sprechi troppo tempo durante il riscaldamento della soluzione e la rivelazione della fluorescenza.Ci concentreremo sul meccanismo molecolare attraverso il quale umbelliferone si lega alla proteina CD14 per produrre effetti immunitari.

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