Name: Sferoidi tridimensionali tridimensionali per cancro al pancreas desmoplastico in crescita da co-coltura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: Scopri come generare sferoidi desmoplastici tridimensionali per lo studio del cancro al pancreas mediante co-coltura di cellule PANC-1 e stellate pancreatiche umane. Questo modello riproduce fedelmente l'ambiente tumorale clinico.

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1. Coltura cellulare 2D
<ol><li>Coltiva le cellule PANC-1 nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in condizioni sterili. Crescere fino al 70%-80% di confluenza prima dei passaggi e non utilizzare oltre il 20° passaggio. Fare riferimento al processo descritto nel passaggio 4.2.1. NOTA: Come punto di riferimento, 1 x 106 cellule in 20 mL di terreno richiedono circa 2-3 giorni per raggiungere la confluenza del 70-80%.</li>
	<li>Coltiva cellule HPaSteC in terreni cellulari stellati integrati con FBS al 2%, PenStrep all'1% e SteCGS (SteCGS) all'1% utilizzando il kit fornito dal produttore in condizioni sterili. Coltivare secondo le istruzioni del produttore (con alcune modifiche) come mostrato nel passaggio 4.2.2 in un pallone rivestito di poli-L-lisina.<ol><li>Saltare la fase di neutralizzazione FBS durante la tripsinizzazione dal protocollo del produttore poiché viene utilizzata la soluzione di neutralizzazione della tripsina (TNS). Neutralizzare la sospensione cellulare con un volume complessivo di 10 mL di TNS come descritto al punto 4.2.2.2. NOTA: Come punto di riferimento, 0,5 x 106 cellule e 1 x 106 cellule in 20 mL di terreno necessitano rispettivamente di 3 giorni e 2 giorni per raggiungere una confluenza del 90%.</li>
		<li>Raccogli le cellule al 90% di confluenza. Non utilizzare le celle oltre il Passaggio 7.</li>
	</ol></li>
	<li>Mantenere le cellule a 37 °C, con il 5% di CO2, in incubatori sterili con umidità relativa al 90%-95%. Eseguire tutti gli studi di coltura cellulare in un matraccio T-75.</li>
</ol>2. Rivestimento in soluzione di poli(2-idrossietilmetacrilato (poli-HEMA) per piastra a 96 pozzetti
<ol><li>Preparare la soluzione di poli-HEMA a 5 mg/mL utilizzando etanolo al 95% lasciandola miscelare per una notte utilizzando un agitatore riscaldato a 37 °C. (ad esempio, 500 mL di soluzione richiedono 2,5 g di poli-HEMA)<ol><li>Contrassegnare la posizione del volume iniziale prima di aggiungere l'agitatore. Utilizzare etanolo al 95% per compensare eventuali perdite nella soluzione il giorno successivo.</li>
	</ol></li>
	<li>Filtrare la soluzione finale in una cappa sterile utilizzando un filtro da 0,22 μm e conservarla in frigorifero a 4 °C. NOTA: Il poli-HEMA viene utilizzato per aumentare l'idrofobicità di una superficie, che funge da deterrente per l'adesione delle cellule. Poiché questo studio richiede che le cellule non si attacchino ai pozzetti e crescano come un monostrato, il poli-HEMA viene utilizzato come deterrente aggiuntivo alla naturale caratteristica di basso attaccamento delle piastre, rendendole così piastre di attacco ultra-basse.</li>
	<li>Aggiungere 50 μl della soluzione fredda a ciascun pozzetto di una piastra rotonda per micropozzetti con fondo in polistirene a 96 pozzetti all'interno di una cappa di coltura cellulare per rivestire la piastra.</li>
	<li>Lasciare i pozzetti con il coperchio in forno ad aria calda a 37 °C per 3 giorni per assicurarsi che le piastre siano completamente asciutte.</li>
	<li>Sterilizzare le piastre con l'UV per 30 minuti nella cappa di coltura cellulare prima della semina cellulare. Conservare in una chiusura a zip ben chiusa per la conservazione a lungo termine e sterilizzare prima dell'uso.</li>
</ol>3. Pianificazione delle colture cellulari 2D
<ol><li>Cronometrare l'esperimento in modo che le celle PANC-1 siano disponibili al 70%-80% di confluenza lo stesso giorno in cui le cellule HPaSteC raggiungono il 90%. NOTA: Le fiale contenenti circa 1 milione di cellule di PANC-1 o HPaSteC, se sollevate da azoto liquido lo stesso giorno, con alcune variazioni, richiedono 8 giorni di coltura PANC-1 e 6-7 giorni di coltura HPaSteC per avere entrambe le linee cellulari pronte lo stesso giorno.</li>
</ol>4. 3D crescita culturale
<ol><li>Fare riferimento alla panoramica dell'intero processo nella Figura 1 prima di avviare il processo. ATTENZIONE: Sia PANC-1 che HPaSteC sono di origine biologica. Maneggiare PANC-1 (linea cellulare cancerosa) con cura.</li>
	<li>Tripsinizzazione e conteggio delle celle<ol><li>Trypsinze e contare le cellule PANC-1:<ol><li>Scartare il surnatante e lavare le cellule PANC-1 con 9 mL di HBSS (3 mL alla volta). Scartare i reagenti usati nella cappa in una soluzione di candeggina al 20-25% V/V per garantire la completa morte del materiale vivo/vitale.</li>
			<li>Tripsinizzare le cellule con 2 mL di tripsina. Dopo circa 10 minuti (potrebbe essere necessario più tempo), quando tutte le cellule sono staccate, neutralizzare la sospensione con 10 mL di DMEM + 10% FBS. Iniziare con 3 ml e proseguire con le fasi di lavaggio successive utilizzando 1 ml per lavaggio (7 lavaggi rimanenti) per garantire la massima raccolta di cellule tripsinizzate.</li>
			<li>Raccogliere ciascuna aliquota neutralizzata nella stessa provetta da 15 mL. Il volume finale nella provetta sarà vicino a 12 mL (~2 mL di tripsina che è stata neutralizzata con 10 mL di terreno).</li>
			<li>Centrifugare la sospensione cellulare neutralizzata a 700 x g per 2 min e 30 s. Scartare il surnatante e risospendere il pellet ottenuto in 1 mL di DMEM +10% FBS. Prendi un'aliquota da questo per il conteggio delle celle ed etichetta il valore ottenuto da questa sezione come "Conteggio A".</li>
		</ol></li>
		<li>Trypsinze e contare le cellule HPaSteC.<ol><li>Eliminare il surnatante e lavare le cellule HPaSteC con 9 mL di HBSS (3 mL alla volta).</li>
			<li>Tripsinizzare le cellule con 2 mL di tripsina. Dopo circa 10 minuti, quando tutte le cellule sono state staccate, neutralizzare la sospensione con 10 mL di soluzione di neutralizzazione della tripsina. Iniziare con 3 ml e proseguire con le fasi di lavaggio successive utilizzando 1 ml per lavaggio (7 lavaggi rimanenti) per garantire la massima raccolta di cellule tripsinizzate.</li>
			<li>Raccogliere ciascuna aliquota neutralizzata nella stessa provetta da 15 mL. Il volume finale nella provetta sarà vicino a 12 mL (~2 mL di tripsina che è stata neutralizzata con 10 mL di soluzione neutralizzante).</li>
			<li>Centrifugare la sospensione cellulare neutralizzata a 700 x g per 2 min e 30 s. Scartare il surnatante e risospendere il pellet ottenuto in 1 mL del terreno di coltura stellato integrato. Prendi un'aliquota da questa per il conteggio delle celle ed etichetta il valore ottenuto da questa sezione come "Conteggio B".</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Diluizione delle sospensioni cellulari iniziali<ol><li>Mettere in pausa questa fase, se necessario (non più di 0,5 ore) per un breve periodo dopo aver ottenuto entrambe le conte A e B o dopo aver tripsinizzato e neutralizzato sia PANC-1 che HPaSteC. Mantenere i terreni di coltura inutilizzati a 37 °C e le sospensioni cellulari a temperatura ambiente (RT; 25 ± 2 °C).</li>
		<li>Utilizzare il conteggio A e il conteggio B ottenuti in precedenza, per prelevare aliquote ed effettuare le rispettive diluizioni (in provette separate) in modo che il volume finale sia di 1 mL (diluente: DMEM + 10% FBS per entrambe le fiale) e il conteggio finale sia compreso tra 110.000 e 140.000 cellule per ciascun tipo di cellula. Una volta effettuata questa diluizione, verificare la conta cellulare per ciascuna diluizione per ottenere il conteggio C (PANC-1) e il conteggio D (HPaSteC).</li>
		<li>Metti in pausa questo passaggio se necessario (non più di 15-30 minuti) dopo aver ottenuto il conteggio C e il conteggio D. Non interrompere una volta effettuate le diluizioni finali al punto 4.3.3.2; Esperimento per evitare l'assestamento delle cellule. Mantenere i terreni di coltura inutilizzati a 37 °C e le sospensioni cellulari a RT (25 ± 2 °C).<ol><li>Mantenere il numero finale di cellule necessarie per pozzetto a HPaSteC: PANC-1: 60:120. Usa 110 pozzetti per il calcolo per tenere conto dell'eccesso. Calcolare con un valore base di 100 μL di sospensione cellulare per pozzetto (il volume totale della sospensione è 11 mL per 110 pozzetti con HPaSteC: PANC-1: 60:120). Preparare questa sospensione in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml per facilitare la miscelazione.</li>
			<li>Utilizzare il conteggio C e il conteggio D e aggiungere una quantità sufficiente di sospensione cellulare in una soluzione DMEM + FBS al 10% per ottenere HPaSteC: PANC-1: 60:120 in un volume finale di 11 mL (6.600 cellule HPaSteC e 13.200 cellule PANC-1 in 11 mL). Miscelare accuratamente la soluzione utilizzando una pipetta da 1 mL mescolando e pipettando su e giù. Evitare la formazione di schiuma.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Semina<ol><li>Utilizzare una pipetta da 200 μl o 100 μl per miscelare la sospensione finale (agitare muovendo il puntale della pipetta in combinazione con il pipettaggio su e giù) in ogni passaggio prima di aggiungere 100 μl di sospensione per pozzetto. Aggiungere delicatamente i 100 μl lungo l'angolo del pozzetto.<ol><li>Riutilizza la stessa punta per più pozzetti, a meno che non cada. Mescolare avanti e indietro e contare fino a 10 o 15 (non secondi) tra le aggiunte a ciascun pozzetto per la prima metà (all'incirca i primi 43 pozzetti) della piastra. Abbassare il numero di miscelazione a 5-10 tra ciascun pozzetto per la seconda metà (i restanti 43 pozzetti) poiché il volume di sospensione è inferiore e richiede una durata di miscelazione inferiore.</li>
			<li>Non utilizzare un pipettatore ripetuto poiché il rivestimento idrofobico in poli-HEMA causerà il rimbalzo della sospensione sulla piastra, con conseguente distribuzione non uniforme.</li>
		</ol></li>
		<li>Eliminare la sospensione in eccesso dopo che tutti i pozzetti sono stati riempiti.</li>
	</ol></li>
	<li>Centrifugazione<ol><li>Centrifugare la piastra finale contenente la sospensione cellulare per riunire tutte le cellule in un pellet. Avvolgere con cura la lastra con parafilm attorno al bordo della lastra per evitare contaminazioni durante questa fase. Dopo l'avvolgimento, centrifugare la piastra con un contrappeso a 1000 x g per 2 min.</li>
		<li>Rimettere la piastra nella cappa di coltura cellulare (utilizzare guanti spruzzati con etanolo per maneggiarla), rimuovere il parafilm e conservare le piastre nell'incubatore a 37 °C, con il 5% di CO2. Non spruzzare mai la piastra con una miscela di etanolo e acqua.</li>
	</ol></li>
	<li>Manutenzione della coltura<ol><li>Osserva le cellule che si uniscono per formare sferoidi al microscopio ottico con un ingrandimento di 4x-5x entro il giorno 3. Seguire il protocollo di mantenimento della coltura come descritto di seguito.<ol><li>Il giorno 3, misurare 5-6 mL di DMEM + 10% FBS e aggiungerne 50 μL a ciascun pozzetto lungo il lato del pozzetto.<ol><li>Non mescolare o agitare in alcun modo il supporto durante l'aggiunta, poiché ciò danneggerebbe lo sferoide o porterebbe alla rimozione accidentale dello sferoide. Il volume finale per pozzetto sarà di ~150 μL.</li>
			</ol></li>
			<li>Oltre il giorno 3, fare riferimento alla Figura 2 per familiarizzare con la struttura del pozzo e la posizione della riflessione della luce (tra la parte cilindrica e curva del pozzo) vista sul mezzo indicato come alone. Eseguire le operazioni vicino all'alone con cautela per assicurarsi che gli sferoidi rimangano integri.</li>
			<li>Il giorno 6, misurare 10-11 mL di DMEM + 10% FBS. Utilizzare una pipetta da 1 ml per estrarre il terreno alla rinfusa da più pozzetti estraendo il terreno fino all'alone. Eseguire questa operazione per l'intera lastra, seguita dalla sostituzione del supporto. Raccogli il surnatante alla rinfusa e scartalo, oppure scartalo man mano che viene estratto.</li>
			<li>Sostituire il terreno scartato con terreno nuovo aggiungendo 100 μL di terreno lungo il lato di ciascun pozzetto. Il volume finale nel pozzetto sarà vicino a 200 μL.<ol><li>Non tirare i supporti oltre l'alone, poiché aumenta il rischio di estrarre accidentalmente lo sferoide.</li>
			</ol></li>
			<li>Il giorno 10/11, misurare 10-11 mL di DMEM + 10% FBS. Utilizzare una pipetta da 1 ml per estrarre il terreno alla rinfusa da più pozzetti estraendo il terreno fino all'alone. Eseguire questa operazione per l'intera lastra, seguita dalla sostituzione del supporto. Raccogli il surnatante alla rinfusa e scartalo, oppure scartalo man mano che viene estratto.</li>
			<li>Sostituire il terreno scartato con terreno nuovo aggiungendo 100 μL di terreno lungo il lato di ciascun pozzetto. Il volume finale nel pozzetto sarà vicino a 200 μL.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Valutazione dell'ultimo giorno<ol><li>Eseguire il trattamento farmacologico sugli sferoidi il giorno 14. Visualizzare gli sferoidi prima dell'uso utilizzando un microscopio invertito a campo chiaro sotto un obiettivo 4x per determinare il volume iniziale dello sferoide. Calcola il volume (V) utilizzando la seguente formula: V = 0,5 × L × W2</li>
		<li>Segui l'equazione per calcolare i volumi degli sferoidi descritta sopra. Qui L è la lunghezza dell'asse maggiore e W è la larghezza (retta più lunga perpendicolare all'asse maggiore). Converti tutte le unità originali da micrometri a millimetri per ottenere un volume in millimetri cubi.</li>
		<li>Il volume iniziale in ciascun pozzetto il giorno 14 è compreso tra 150 e 200 μl a causa dell'evaporazione. Per i trattamenti farmacologici, rimuovere il terreno fino a raggiungere l'alone da ciascun pozzetto e sostituirlo con 100 μL di soluzione farmacologica a 2 volte l'intensità, insieme a una miscelazione delicata (mescolare delicatamente il terreno avanti e indietro contando fino a 2 tra un pozzetto e l'altro).<ol><li>Utilizzare soluzioni di forza 2x per consentire che la soluzione finale del farmaco sia a 1x ed evitare di rimuovere completamente i vecchi terreni dai pozzetti, altrimenti gli sferoidi potrebbero essere disturbati. Usa gli sferoidi entro 3 giorni da questo lasso di tempo.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Collezione di sferoidi<ol><li>Misurare i volumi degli sferoidi prima della raccolta come descritto al punto 4.7.2.</li>
		<li>Raccogli gli sferoidi il giorno 14 o 17, a seconda delle esigenze dell'esperimento, rimuovendo il terreno da ciascun pozzetto fino a raggiungere l'alone.</li>
		<li>Utilizzare una pipetta da 1 ml per rimuovere il terreno e raccogliere il surnatante in una provetta da centrifuga conica da 15 ml da più pozzetti.</li>
		<li>Una volta che tutti i pozzetti hanno il terreno a livello dell'alone, ridurre l'impostazione sulla pipetta da 1 ml a un valore compreso tra 200 e 300 μl.</li>
		<li>Allineare la piastra sullo sfondo della cappa o su uno sfondo scuro (ad esempio, un rack per provette) per vedere gli sferoidi depositati sul fondo.</li>
		<li>Inserire delicatamente la punta vicino allo sferoide (andare sotto l'alone) e pipettare una piccola quantità di terreno (ad esempio, una stima visiva di circa 50 μl) avanti e indietro per disturbare lo sferoide. Non mettere la punta direttamente sopra lo sferoide, poiché ciò può danneggiarne la struttura.<ol><li>Non estrarre tutto il supporto dal pozzetto in questo passaggio. Controllare saldamente il movimento del pollice sul pistone della pipetta.</li>
		</ol></li>
		<li>Sposta il supporto finché lo sferoide non rimane più al centro e può essere visto muoversi sullo sfondo. Estrarre una quantità sufficiente di terreno per aspirare lo sferoide e spostarlo nella posizione desiderata (ad esempio, raggrupparlo con altri sferoidi in un pozzetto che fa parte dello stesso set di trattamento).</li>
	</ol></li>
	<li>Disfarsi dei rifiuti<ol><li>Scartare tutti i campioni liquidi una volta neutralizzati con candeggina secondo i protocolli del Dipartimento per l'ambiente e la sicurezza sanitaria dei rispettivi laboratori. Autoclavare in autoclave ed eliminare tutte le pipette e i flaconi usati con rifiuti a rischio biologico.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del processo di crescita di sferoidi desmoplastici 3D per il cancro del pancreas (generato utilizzando BioRender). La figura fornisce una panoramica dei processi di base coinvolti; vale a dire, tripsinizzazione delle cellule, utilizzo della conta cellulare iniziale per produrre sospensioni cellulari diluite, preparazione di una co-coltura utilizzando le sospensioni cellulari diluite, aggiunta di sospensioni cellulari a ciascun pozzetto, incubazione delle colture, esecuzione del mantenimento dei terreni e formazione finale degli sferoidi come previsto il giorno 14. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig02.jpg"> Figura 2: Struttura del pozzo inferiore a U. L'immagine a destra è una forma esagerata per mostrare la parte "alone" del pozzo. La figura ha lo scopo di definire dove si trova la porzione "alone" del pozzo, poiché lavorare al di sopra dell'alone è fondamentale per far crescere gli sferoidi ed evitare perdite accidentali. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
5. Valutazione dei componenti della ECM e microscopia confocale
<ol><li>Utilizzare l'immunocolorazione per valutare la risposta della MEC alla terapia farmacologica secondo il protocollo descritto da Durymanov et al.38.<ol><li>Raggruppare gli sferoidi e lavare due volte con 100 μl di PBS. Incorporare in un mezzo di inclusione tissutale a temperatura di taglio ottimale (OCT), congelare e mantenere a -80 °C.</li>
		<li>Tagliare i blocchi tumorali congelati in sezioni da 10 μm, fissare le sezioni in una miscela di acetone-metanolo (1:1) per 15 minuti e lasciarle asciugare all'aria a RT.</li>
	</ol></li>
	<li>Per determinare i componenti della MEC, immunocolorare le criosezioni con anticorpi primari monoclonali anti-fibronectina di coniglio, anticorpi policlonali anti-collagene di tipo I di coniglio, anticorpi policlonali anti-laminina di coniglio e anticorpi policlonali anti-acido ialuronico di pecora.</li>
	<li>Usa come anticorpi secondari IgG anticoniglio capra marcato con Alexa Fluor 488 o anti-pecora asino coniugato con Alexa Fluor 568. NOTA: Gli anticorpi primari e secondari sono stati diluiti rispettivamente a 1:200 e 1:300.</li>
	<li>Acquisizione di immagini di tutte le sezioni sferoidi utilizzando un microscopio a scansione laser confocale dotato di obiettivo 20x/0,45.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Modello 3D-PDAC che cattura la desmoplasia per la valutazione terapeutica

<ol><li>Hingorani, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+and+stromal+co-evolution+and+complicity+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epithelial and stromal co-evolution and complicity in pancreatic cancer.</a> Nat Rev Cancer. 23 (2), 57-77 (2023).</li>
<li>Laklai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+tunes+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+tissue+tension+to+induce+matricellular+fibrosis+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Genotype tunes pancreatic ductal adenocarcinoma tissue tension to induce matricellular fibrosis and tumor progression.</a> Nat Med. 22 (5), 497-505 (2016).</li>
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<li>Durymanov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+inoculation+of+3D+pancreatic+cancer+spheroids+results+in+development+of+reproducible+stroma-rich+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous inoculation of 3D pancreatic cancer spheroids results in development of reproducible stroma-rich tumors.</a> Transl Oncol. 12 (1), 180-189 (2019).</li>
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<li>Alseud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+biological+activity+of+11-oxygenated+and+heterocyclic+estrone+analogs+in+pancreatic+cancer+monolayers+and+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and biological activity of 11-oxygenated and heterocyclic estrone analogs in pancreatic cancer monolayers and 3D spheroids.</a> Bioorg Med Chem. , (2024).</li>
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<li>Wishart, G., Gupta, P., Schettino, G., Nisbet, A., Velliou, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tissue+models+as+tools+for+radiotherapy+screening+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Radiol%22%5BJournal%5D)">3D tissue models as tools for radiotherapy screening for pancreatic cancer.</a> Br J Radiol. 94 (1120), 20201397(2021).</li>
<li>Peirsman, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MISpheroID%3A+a+knowledgebase+and+transparency+tool+for+minimum+information+in+spheroid+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">MISpheroID: a knowledgebase and transparency tool for minimum information in spheroid identity.</a> Nat Methods. 18 (11), 1294-1303 (2021).</li>
<li>Durymanov, M., Kroll, C., Permyakova, A., Reineke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endocytosis+in+nanoparticle+penetration+of+3D+pancreatic+cancer+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Role of endocytosis in nanoparticle penetration of 3D pancreatic cancer spheroids.</a> Mol Pharm. 16 (3), 1074-1082 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Axio Observer microscopio invertito</td><td>Carl Zeiss</td><td>0450-354</td><td></td></tr><tr><td>Cellometro Auto T4</td><td>Nexcelom Bioscience LLC</td><td>Auto-T4</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, polvere, alto glucosio</td><td>Gibco</td><td>12100046</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-sheep coniugato con Alexa Fluor 568</td><td>Abcam</td><td>ab175712</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>SH3091003HI</td><td></td></tr><tr><td>IgG anticoniglio di capra marcato con Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Soluzione salina bilanciata (HBSS)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14175145</td><td></td></tr><tr><td>Cellule Stellate Pancreatiche Umane (HPaSteC)</td><td>ScienCell</td><td>3830</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Nikon</td><td>Nikon Eclipse</td><td>Ts 100</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 96-Well Polystyrene Fondo Rotondo Piastre per Micropozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-331</td><td></td></tr><tr><td>Olympus Fluoview FV1200 Laser confocale</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>Prodotto</td></tr> <tr>fuori produzione<td>PANC-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-1469</td><td></td></tr><tr><td>Poly-HEMA</td><td>Sigma</td><td>P3932</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi policlonali anti-laminina di coniglio&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi policlonali anti-collagene di tipo I di coniglio&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpi policlonali anti-acido ialuronico di pecora</td><td>Abcam</td><td>ab53842</td><td></td></tr><tr><td>Kit completo di terreni cellulari stellati.</td><td>ScienCell</td><td>5301</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>153571</td><td>soluzione di tripsina preparata secondo il protocollo del produttore e utilizzata allo 0,25% p/v&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di neutralizzazione della tripsina (TNS)</td><td>ScienCell</td><td>103</td><td></td></tr></tbody></table>

sferoidi tridimensionali tridimensionali per cancro al pancreas desmoplastico in crescita da co-coltura

Growing Desmoplastic Three-Dimensional Pancreatic Cancer Spheroids from Co-Culture

Tre delle fasi più critiche coinvolte nella crescita degli sferoidi sono la conta cellulare iniziale, le fasi di miscelazione durante la semina degli sferoidi e l'esecuzione di modifiche tempestive ai terreni per consentire agli sferoidi di crescere (Figura 1). Inoltre, avere familiarità con la Figura 2 sui cambi dei terreni dopo il giorno 3 è fondamentale per consentire cambi di terreno efficaci a causa dell'aumento del volume dei terreni per pozzetto. Quando tutti questi passaggi vengono eseguiti secondo le indicazioni fornite, si scopre che gli sferoidi (Figura 3) crescono fino a un volume medio di 0,048 ± 0,012 mm3 (451 μm x 462,84 μm) (Figura 4). Sono stati riscontrati casi in cui le cellule possono crescere meglio, portando a volumi medi iniziali più grandi di 0,096 ± 0,014 mm3 (611 μm x 560 μm) il giorno 14. Una serie di ragioni può portare gli sferoidi ad avere volumi iniziali maggiori, come il mantenimento della temperatura e dell'umidità dell'incubatrice o l'uso di passaggi cellulari precedenti, che hanno una vitalità leggermente migliorata rispetto ai passaggi successivi.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig03.jpg"> Figura 3: Uno sferoide rappresentativo visto il giorno 14 (dimensioni: 451,59 μm x 462,84 μm). Barra della scala = 200 μm. Ogni sferoide viene misurato rispettivamente lungo l'asse più lungo e più corto e viene utilizzata l'equazione descritta nella sezione dei metodi per calcolare il volume. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig04.jpg"> Figura 4: Andamento della crescita degli sferoidi nell'arco di 17 giorni. Le tavole 1 e 2 sono repliche. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard. La cifra può essere utilizzata come stima approssimativa dei volumi di sferoidi che possono essere osservati nei giorni 6, 10, 14 e 17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tuttavia, nei casi in cui le cellule non vengono contate correttamente o la sospensione cellulare non viene miscelata accuratamente, o la coltura finale non viene mantenuta regolarmente, o si verifica una combinazione di questi errori, può portare allo sviluppo di sferoidi più piccoli o di sferoidi cresciuti in modo incompleto. Sferoidi con aspetti simili sono stati osservati anche quando gli studi di ottimizzazione iniziali hanno integrato i terreni solo nei pozzetti intorno alla periferia della piastra il giorno 3 invece che nell'intera piastra (Figura 5). In alternativa, nei casi in cui le cellule non sono ben miscelate o gli errori iniziali di conteggio/diluizione portano alla semina di più cellule per pozzetto rispetto a quanto raccomandato, si possono osservare più sferoidi per pozzetto. Un risultato simile è stato osservato quando le celle PANC-1:HPaSteC sono state utilizzate con un rapporto di 240:120 (Figura 6). Questo può anche essere visto occasionalmente quando gli sferoidi vengono cresciuti per direzione, ma tali sferoidi sono in numero inferiore (ad esempio, 4/96 pozzetti possono contenere due sferoidi per pozzetto invece di uno). Nei casi in cui si incontrano più sferoidi, evitare di utilizzare i pozzetti con più sferoidi o prendere nota delle variazioni di volume quando questi sferoidi vengono trattati. Anche i cambi di terreno impropri in cui la punta della pipetta scende al di sotto dell'alone (Figura 1) possono portare alla perdita accidentale degli sferoidi.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig05.jpg"> Figura 5: Un'immagine rappresentativa di uno sferoide mal cresciuto il giorno 14. Barra della scala = 200 μm. Qui, le cellule non si sono aggregate bene, quindi diventa difficile misurare la lunghezza e la larghezza dello sferoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig06.jpg"> Figura 6: Un'immagine rappresentativa di un pozzo contenente due sferoidi mal cresciuti come visto il giorno 14. Barra della scala = 200 μm. Qui, uno degli sferoidi ha una dimensione di 246,61 μm x 178,31 μm e l'altro 289,13 μm x 252,35 μm. Questo è un esempio in cui è probabile che ci sia un problema con le diluizioni iniziali o con la qualità delle cellule che sono state utilizzate per iniziare l'esperimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Gli sferoidi sviluppano anche una ECM con quattro dei componenti primari della ECM: collagene-I, laminina, acido ialuronico e fibronectina. Negli studi che il laboratorio ha pubblicato in precedenza, il vantaggio della co-coltura rispetto al solo PANC-1 è stato dimostrato in termini di sferoidi homo PANC-1 che mostrano collagene diffuso, assenza di fibronectina e minore deposizione di acido ialuronico.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66625/66625fig07.jpg"> Figura 7: Immagine rappresentativa dei quattro componenti primari della ECM osservati il giorno 17 in sferoidi non trattati: collagene I, laminina, acido ialuronico e fibronectina. Queste immagini sono ottenute dopo criosezioni immunocoloranti dello sferoide. La luminosità di queste immagini è stata aumentata in modo uniforme per evidenziare le differenze nell'aspetto. Le aree in cui il tessuto è danneggiato o mancante devono essere regolate durante l'esecuzione delle misurazioni dell'intensità. Barre di scala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66625/66625fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Sferoidi tridimensionali tridimensionali per cancro al pancreas desmoplastico in crescita da co-coltura

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the deadliest cancers with a 5-year survival rate of &#60;12%. The biggest barrier to therapy is the ...

growing-desmoplastic-three-dimensional-pancreatic-cancer-spheroids

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Ricerca sul cancro

Un semplice metodo è descritto per analizzare gli effetti di fibroblasti su tessuti associati cellule epiteliali. La combinazione di questo metodo e tridimensionale coltura tissutale può facilitare l'analisi di cellule dopo l'isolamento da 3D. La tecnica è applicabile a celle di varia potenziale maligno, consentendo studio sistematico di effetti di tumore-associato stroma sulle cellule tumorali.

Isolamento di cellule epiteliali mammarie da tridimensionale Mixed-cell Spheroid Co-cultura

Questo video spiega la biostampa magnetica 3D di cellule tumorali pancreatiche e fibroblasti co-coltivati. Le cellule tumorali del pancreas e le cellule dei fibroblasti pancreatici attivati vengono co-coltivate e magnetizzate utilizzando un assemblaggio di nanoparticelle biocompatibili, per generare sferoidi, sotto l'influenza delle forze magnetiche.

Co-colture di sferoidi 3D biostampate magneticamente: un metodo per la co-coltura di cellule cancerose e fibroblasti

Questo video mostra un metodo per stabilire una co-coltura tridimensionale di sferoidi tumorali e cellule T. Viene preparato un calco di agarosio con micropozzetti contenenti sferoidi tumorali, seguito dall'aggiunta di cellule T. Dopo l'incubazione, questa configurazione consente di studiare l'interazione delle cellule T con gli sferoidi tumorali in un ambiente tridimensionale controllato.

Un modello tridimensionale di co-coltura di cellule T infiltranti negli sferoidi tumorali

L'invasione dei tessuti normali circostanti è una caratteristica distintiva dei tumori maligni. Forniamo qui un semplice saggio semi-automatico su micropiastra dell'invasione in una biomatrice 3D naturale che è stata esemplificata con una serie di modelli di tumori umani avanzati.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Qui, un metodo è descritto per la preparazione di co-coltura 3-dimensionale della sferoide (3D) delle cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti, seguiti dalla misura delle funzioni metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Questo protocollo presenta un nuovo sistema di coltura robusto e riproducibile per generare e far crescere sferoidi tridimensionali dalle cellule adenocarcinoma del colon Caco2. I risultati forniscono la prima prova di concetto per l'appropriatezza di questo approccio allo studio della biologia delle cellule staminali tumorali, compresa la risposta alla chemioterapia.

Un modello tridimensionale di sferoidi per studiare le cellule staminali del cancro del colon

Mancano modelli completi in vitro che ricapitolino fedelmente la malattia umana pertinente. Il presente studio presenta la creazione e la coltura tridimensionale (3D) di sferoidi tumorali, uno strumento affidabile in vitro per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare umano.

Un modello sferoide tridimensionale per studiare l'interazione tumore-stromale nel carcinoma epatocellulare

Il presente protocollo descrive la generazione di modelli di coltura tumorale 3D da cellule tumorali primarie e la valutazione della loro sensibilità ai farmaci utilizzando saggi di vitalità cellulare ed esami microscopici.

Stabilire sferoidi 3-dimensionali da campioni tumorali derivati dal paziente e valutare la loro sensibilità ai farmaci

Questo studio presenta una metodologia economica ed efficiente per generare strutture cellulari 3D utilizzando un sistema basato su timbri per creare micropozzetti in stampi di agarosio. Il sistema promuove la formazione di sferoidi/organoidi uniformi, migliorando così le interazioni cellulari. Questo approccio riduce la variabilità sperimentale e supporta le applicazioni nei test sui farmaci e nell'ingegneria tissutale.

Generazione di sferoidi/organoidi tridimensionali da colture cellulari bidimensionali utilizzando un nuovo dispositivo di timbro

Scopri come generare sferoidi desmoplastici tridimensionali per lo studio del cancro al pancreas mediante co-coltura di cellule PANC-1 e stellate pancreatiche umane. Questo modello riproduce fedelmente l'ambiente tumorale clinico.

Sferoidi tridimensionali tridimensionali per cancro al pancreas desmoplastico in crescita da co-coltura

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