Name: Costruzione di reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole di dimensioni nanometriche e micrometriche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Scopri come costruire reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole nanometriche e micrometriche mediante ricostituzione di proteine di membrana e incapsulamento di enzimi. Questo protocollo avanza la biologia sintetica verso sistemi autoreplicanti.

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Gli autori ringraziano Aditya Iyer per la clonazione del gene pBAD-PercevalHR e Gea Schuurman-Wolters per aver contribuito alla produzione e alla purificazione delle proteine. La ricerca è stata finanziata dal programma di gravitazione NWO "Building a Synthetic Cell" (BaSyC).

Protocollo di incapsulamento delle vescicole lipidiche per reti proteiche complesse

<ol><li>Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+bottom-up+assembly+of+molecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems.</a> Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).</li>
<li>Ivanov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+synthesis+of+artificial+cells%3A+recent+highlights+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges.</a> Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).</li>
<li>Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industrial+biomanufacturing%3A+The+future+of+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Industrial biomanufacturing: The future of chemical production.</a> Science. 355 (6320), (2017).</li>
<li>Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+synthetic+biology+platform+for+emerging+industrial+biomanufacturing%3A+Bottom-up+pathway+design%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Syst+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design.</a> Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-target+and+glucose-responsive+polymersomes+toward+mimicking+endogenous+insulin+secretion+with+improved+hepatic+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).</li>
<li>Kanter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+scFv+fusion+proteins%3A+an+efficient+approach+for+personalized+lymphoma+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines.</a> Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).</li>
<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology and personalized medicine.</a> Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).</li>
<li>Schwille, P., Frohn, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+protein+functions+and+what+they+may+teach+us%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hidden protein functions and what they may teach us.</a> Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).</li>
<li>Sachsenmeier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+5.0-The+relevance+and+implications+of+bionics+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology.</a> Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).</li>
<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
<li>Sikkema, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+by+ionic+strength+and+safety+check+by+cyclic-di-AMP+in+the+ABC+transporter+OpuA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA.</a> Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).</li>
<li>Foucaud, C., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+transport+system+of+Streptococcus+thermophilus.+Functional+reconstitution+of+the+protein+and+characterization+of+the+kinetic+mechanism+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport.</a> J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).</li>
<li>Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+solubilization+and+lipid+reconstitution+of+Na%2CK-ATPase%3A+enzyme+kinetic+and+biophysical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization.</a> Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).</li>
<li>Simidjiev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+large%2C+ordered+lamellae+from+non-bilayer+lipids+and+integral+membrane+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).</li>
<li>Harris, N. J., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+stability+of+membrane+transport+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Folding and stability of membrane transport proteins in vitro.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).</li>
<li>Jackson, M. L., Litman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-egg+phosphatidylcholine+reconstitution+by+an+octyl+glucoside+dilution+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Szoka, F., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+preparation+of+liposomes+with+large+internal+aqueous+space+and+high+capture+by+reverse-phase+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.</a> Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).</li>
<li>Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1">https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1</a> (2023).</li>
<li>Lee, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+artificial+organelles+sustain+and+control+ATP-dependent+reactions+in+a+protocellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system.</a> Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%A9l%C3%A9ard%2C+P+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Elsevier. 161-176 (2009).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+transmembrane+protein%2C+the+voltage-gated+ion+channel%2C+KvAP%2C+into+giant+unilamellar+vesicles+for+microscopy+and+patch+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies.</a> J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).</li>
<li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li>
<li>Pols, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+metabolic+network+for+physicochemical+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis.</a> Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).</li>
<li>Bailoni, E., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+recycling+fuels+sustainable+glycerol+3-phosphate+formation+in+synthetic+cells+fed+by+dynamic+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis.</a> ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).</li>
<li>Van Der Heide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+osmotic+signal+and+osmosensing+mechanism+of+an+ABC+transport+system+for+glycine+betaine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine.</a> EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).</li>
<li>Van'T Klooster, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipid+requirements+of+the+lysine+transporter+Lyp1+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae.</a> J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).</li>
<li>Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic-based+approach+to+formulate+size-tuneable+large+unilamellar+cationic+liposomes%3A+Formulation%2C+cellular+uptake+and+biodistribution+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+bottom-up+assembly+of+mechanically+stabilized+synthetic+cells+by+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics.</a> Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).</li>
<li>Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology+of+the+pathway+for+ATP+production+by+arginine+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown.</a> FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).</li>
<li>Yandrapalli, N., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+capacity+microfluidic+trapping+of+giant+vesicles+for+high-throughput+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies.</a> Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).</li>
<li>Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459">http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459</a> (2019).</li>
<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
<li>Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trapping+of+giant+unilamellar+vesicles+to+study+transport+through+a+membrane+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).</li>
<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
<li>Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).</li>
<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere alcun interesse finanziario concorrente.

Presentiamo un protocollo per la sintesi di proteine (di membrana) contenenti vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche (proteoLUVs), e la conversione di proteoLUV in vescicole giganti-unilamellari (proteoGUVs). Il protocollo dovrebbe essere applicabile per la ricostituzione di altre proteine di membrana 13,19,30,40 e l'incapsulamento di reti metaboliche diverse dalle vie di degradazione della L-arginina e di sintesi del glicerolo 3-fosfato qui presentate.
La ricostituzione delle proteine di membrana nei liposomi generalmente produce un orientamento casuale delle proteine all'interno della membrana lipidica. Per ArcD e Glpt, l'orientamento non ha importanza, perché le proteine operano in modo bidirezionale e i soluti si muovono a seconda del segno del potenziale elettrochimico totale. Per le proteine che funzionano in una direzione, metà delle molecole non sarà disponibile per l'attività quando il loro orientamento è 50/50.
L'estrusione delle vescicole attraverso un filtro in policarbonato restringe la distribuzione dimensionale e le vescicole diventano più omogenee quanto più piccola è la dimensione dei pori dei filtri. Tuttavia, le vescicole più piccole hanno il prezzo di avere un volume minore e quindi un numero molto piccolo di proteine (enzimi, proteine di membrana) per vescicola. Per minimizzare la frazione di LUV che hanno uno o più componenti mancanti, la concentrazione delle proteine può essere regolata come mostrato nella Figura 3A, B, ma con vescicole molto piccole gli effetti stocastici sono inevitabili.
Il metodo di rigonfiamento assistito da gel si basa sulla deposizione di vescicole sonicate (SUV) su una superficie di agarosio essiccata. Durante il processo di essiccazione, si forma un gradiente di concentrazione di vescicole e la concentrazione lipidica è la più alta alla periferia del punto. Ciò è dovuto a un fenomeno noto come effetto macchia di caffè41,42. Di conseguenza, solo una piccola regione all'interno della macchia contiene una concentrazione di lipidi adatta alla formazione di GUV. Le macchie lipidiche circolari e concentrate in modo irregolare provocano ampie aree inutilizzate che non sono disponibili per la fusione delle vescicole; quindi, l'efficienza della formazione di GUV diventa bassa in questo approccio. Per aumentare la resa dei GUV, si dovrebbe mirare a una deposizione lipidica uniforme, che può essere ottenuta mediante spin coating42 o sfruttando l'effetto della macchia di caffè41.
Ulteriori note sul protocollo:
Si deve fare attenzione che diverse proteine di membrana (>10) siano ricostituite in media per vescicola per evitare effetti stocastici. Pertanto, evitare rapporti lipidi/proteine superiori a 400:1 p/p. Si assume un orientamento casuale per la maggior parte delle proteine.
Idealmente, il volume delle proteine totali di membrana è il più piccolo possibile e comunque non supera il 10-20% del volume del liposoma. L'aggiunta di volumi maggiori introdurrà più detersivo e la maggior parte dei liposomi preformati può lisi, il che può avere un effetto negativo sull'efficienza della ricostituzione.
Il pre-bilanciamento dell'estrusore con la soluzione appropriata è importante per evitare la diluizione dei componenti durante l'incapsulamento. Idealmente, la soluzione di preequilibrio dovrebbe contenere anche gli enzimi solubili, ma l'inclusione di enzimi può essere troppo costosa a causa del volume relativamente grande necessario per il pre-equilibrio dell'estrusore. Pertanto, in genere omettiamo questi componenti e accettiamo una diluizione del 5% degli enzimi.
Gli ionofori devono essere aggiunti alle miscele contenenti proteoliposomi perché le molecole sono altamente idrofobiche e possono adsorbirsi sulle superfici se non sono presenti vescicole. Bisogna fare attenzione che il volume di solvente aggiunto sia basso (<1% del volume totale di reazione). I controlli vengono effettuati per verificare che i solventi non influenzino le reti metaboliche nelle vescicole. Concentrazioni di ionofori di circa 1 μM sono generalmente sicure per concentrazioni lipidiche totali di ~3 mg/mL.
Bisogna fare attenzione ad asciugare accuratamente le goccioline. Se le goccioline non sono sufficientemente asciutte, la formazione di GUV è meno efficiente in quanto i lipidi formeranno aggregati lipidici e gli MLV possono formarsi quando viene aggiunta la soluzione di rigonfiamento.
Il glucosio viene utilizzato per far corrispondere l'osmolarità del mezzo esterno a quello interno; quest'ultimo contiene saccarosio al posto del glucosio per aumentare la densità delle vescicole e facilitare così la sedimentazione delle GUV. Inoltre, il glucosio nell'ambiente esterno aumenta il contrasto di fase, rendendo la vescicola più facilmente visibile.
Gli effetti stocastici sono molto meno un problema con i GUV; Ma qui, il rapporto superficie-volume può diventare inaccettabilmente basso in modo tale che il numero di proteine di membrana (ad esempio, trasportatori) diventa limitante per la rete metabolica interna. Il metodo descritto in questo protocollo non consente un controllo preciso sulle dimensioni dei proteoGUV, ma la maggior parte rientra nell'intervallo di dimensioni di 5-50 μm.
In conclusione, il lavoro qui presentato fornisce una panoramica completa della ricostituzione delle proteine di membrana e dell'incapsulamento enzimatico in vescicole lipidiche di varie dimensioni. Dimostriamo la costruzione di vescicole funzionali per la sintesi di ATP e di elementi costitutivi da semplici precursori come aminoacidi e glicerolo. La ricostituzione delle proteine di membrana nei GUV rimane impegnativa, ma i protocolli qui presentati aprono la strada a ulteriori sviluppi nella ricerca bottom-up sulla biologia sintetica.

Il campo della biologia sintetica bottom-up si concentra sulla costruzione di cellule (minime) 1,2 e bioreattori metabolici per scopi biotecnologici 3,4 o biomedici 5,6,7,8. La costruzione di cellule sintetiche fornisce una piattaforma unica che consente ai ricercatori di studiare le proteine (di membrana) in condizioni ben definite che imitano quelle degli ambienti nativi, consentendo la scoperta di proprietà emergenti e funzioni biochimiche nascoste delle proteine e delle reti di reazione9. Come passo intermedio verso una cellula sintetica funzionante in modo autonomo, vengono sviluppati moduli che catturano le caratteristiche essenziali delle cellule viventi come la conservazione dell'energia metabolica, la sintesi di proteine e lipidi e l'omeostasi. Tali moduli non solo migliorano la nostra comprensione della vita, ma hanno anche potenziali applicazioni nei campi della medicina8 e della biotecnologia10.
Le proteine transmembrana sono al centro di praticamente qualsiasi rete metabolica in quanto trasportano molecole dentro o fuori dalla cellula, segnalano e rispondono alla qualità dell'ambiente e svolgono numerosi ruoli biosintetici. Pertanto, l'ingegnerizzazione di moduli metabolici in cellule sintetiche richiede nella maggior parte dei casi la ricostituzione di proteine di membrana integrali e/o periferiche in un doppio strato di membrana composto da lipidi specifici e ad alta integrità (bassa permeabilità). La gestione di queste proteine di membrana è impegnativa e richiede conoscenze specifiche e capacità sperimentali.
Sono stati sviluppati diversi metodi per ricostituire le proteine di membrana all'interno delle vescicole fosfolipidiche, il più delle volte con lo scopo di studiare la funzione11,12, la regolazione13, le proprietà cinetiche14,15, la dipendenza dai lipidi15,16 e/o la stabilità17 di una specifica proteina. Questi metodi comportano la rapida diluizione delle proteine solubilizzate con detergente in mezzi acquosi in presenza di lipidi18, la rimozione dei detergenti mediante incubazione di proteine solubilizzate con detergente con vescicole lipidiche destabilizzate con detergente e l'assorbimento del detergente o dei detergenti su perle di polistirene19, o la rimozione dei detergenti mediante dialisi o cromatografia ad esclusione dimensionale20. I solventi organici sono stati utilizzati per formare vescicole lipidiche, ad esempio, attraverso la formazione di interfasi olio-acqua21, ma la maggior parte delle proteine integrali di membrana sono inattivate quando esposte a tali solventi.
Nel nostro laboratorio, ricostituiamo per lo più le proteine di membrana con il metodo dell'assorbimento dei detergenti per formare grandi vescicole unilamellari (LUV)19. Questo metodo consente la co-ricostituzione di più proteine di membrana e l'incapsulamento nel lume della vescicola di enzimi, metaboliti e sonde22,23. I LUV contenenti proteine di membrana possono essere convertiti in vescicole unilamellari giganti (GUV) con/senza incapsulamento di componenti idrosolubili, utilizzando l'elettroformazione24 o il rigonfiamento assistito da gel25 e condizioni specifiche per preservare l'integrità delle proteine di membrana26.
Questo articolo presenta un protocollo per la ricostituzione nei LUV di una rete metabolica fuori equilibrio che rigenera l'ATP attraverso la scomposizione della L-arginina in L-ornitina27. La formazione di ATP è accoppiata alla produzione di glicerolo-3-fosfato (G3P), un importante elemento costitutivo per la sintesi dei fosfolipidi22,28. La via metabolica è costituita da due proteine integrali di membrana, un'arginina/ornitina (ArcD) e un antiporter G3P/Pi (GlpT). Inoltre, sono necessari tre enzimi solubili (ArcA, ArcB, ArcC) per il riciclaggio dell'ATP e il GlpK viene utilizzato per convertire il glicerolo in glicerolo-3-fosfato, utilizzando l'ATP dalla scomposizione della L-arginina, vedere la Figura 1 per una panoramica schematica del percorso. Questo protocollo rappresenta un buon punto di partenza per la futura costruzione di reti di reazione ancora più complesse, per la sintesi di lipidi o proteine o per la divisione delle cellule. La composizione lipidica delle vescicole supporta l'attività di un'ampia varietà di proteine integrali di membrana ed è stata ottimizzata per il trasporto di diverse molecole dentro o fuori le vescicole 27,29,30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> Figura 1: Panoramica della via per la produzione di ATP e la sintesi e l'escrezione del glicerolo-3-fosfato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In breve, le proteine di membrana purificate (solubilizzate in dodecil-β-D-maltoside, DDM) vengono aggiunte alle vescicole lipidiche preformate che sono state destabilizzate con Triton X-100, che consente l'inserimento delle proteine nella membrana. Le molecole detergenti vengono successivamente (lentamente) rimosse mediante l'aggiunta di perle di polistirene attivate, con conseguente formazione di proteoliposomi ben sigillati. I componenti solubili possono quindi essere aggiunti alle vescicole e incapsulati tramite cicli di congelamento-scongelamento, che intrappolano le molecole nel processo di fusione della membrana. Le vescicole ottenute sono altamente eterogenee e molte sono multilamellari. Vengono quindi estrusi attraverso un filtro in policarbonato con una dimensione dei pori di 400, 200 o 100 nm, che produce vescicole di dimensioni più uniformi; Più piccola è la dimensione dei pori, più omogenee e unilamellari sono le vescicole ma al prezzo di un volume interno inferiore. Le proteine non incorporate e le piccole molecole vengono rimosse dalla soluzione esterna mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. I proteoLUV possono essere convertiti in vescicole di dimensioni micrometriche mediante rigonfiamento assistito da gel, e questi proteoGUV vengono quindi raccolti e intrappolati in un chip microfluidico per la caratterizzazione e la manipolazione microscopica. La Figura 2 mostra una panoramica schematica dell'intero protocollo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> Figura 2: Panoramica del protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l'incapsulamento degli enzimi e dei componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche (LUV) e micrometriche (GUV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I protocolli di ricostituzione e incapsulamento funzionano bene e la funzionalità delle proteine viene mantenuta, ma i proteoLUV e i proteoGUV sono di dimensioni eterogenee. Gli approcci microfluidici31,32 consentono la formazione di vescicole di dimensioni micrometriche di dimensioni più omogenee, ma la ricostituzione funzionale delle proteine di membrana non è generalmente possibile perché il solvente residuo nel doppio strato inattiva le proteine. Le dimensioni dei proteoLUV variano da 100 a 400 nm e, a basse concentrazioni di enzimi, l'incapsulamento può portare a vescicole con vie metaboliche incomplete (effetti stocastici; vedi Figura 3). I LUV sono ideali per la costruzione di specifici moduli metabolici, come mostrato qui per la produzione di ATP e di elementi costitutivi come il G3P. Tali proteoLUV possono potenzialmente essere incapsulati in GUV e fungere da compartimenti simili a organelli per le vescicole dell'ospite.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> Figura 3: Numero di molecole per vescicola con un diametro di 100, 200 o 400 nm. (A) Quando le proteine incapsulate (enzimi, sonde) sono nell'intervallo 1-10 μM. (B) La ricostituzione viene eseguita a 1-1.000, da 1 a 10.000 e da 1 a 100.000 proteine di membrana per lipide (mol/mol). Partiamo dal presupposto che le molecole siano incapsulate alle concentrazioni indicate e incorporate nella membrana a questi rapporti proteina-lipide. Per alcuni enzimi, abbiamo visto che si legano alle membrane, che possono aumentare la loro concentrazione apparente nelle vescicole. Abbreviazione: LPR = Rapporto lipidico-proteico <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cut-off Amicon</td> Unità filtranti <td>centrifughe Sigma</td><td>Aldrich Milipore Amicon Ultra&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio</td><td>per</td> <td>medio-D</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Saccarosio</td><td>per</td> <td>medio-DDM</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Glicone</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>Etere dietilico</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855-100ml</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Estrusore</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimetro</td><td>Jasco</td><td>Spettrofluorimetro FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>Colonna a flusso gravitazionale</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton siringa 100 &; L</td><td>Hamilton</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton siringa 1000 & micro; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>Dispenser LCP portatile</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>Sonicatore portatile</td><td>Hielscher Tecnologia ad ultrasuoni</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga a provetta Falcon grande</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornitina</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM Microscopio confocale a scansione laser</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Chip microfluidico</td><td>fatto in casa&nbsp;</td>DOI <td>basato su PDMS</td><td>: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro</td><td>Nanodrop Isogen Life Science</td><td>Spettrofotometro ND-1000 NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>Aghi per GUVs</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 G x 3/4'' 0,4 x 20 mm</td></tr><tr><td>Aghi per microfluidica</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2'' 1,2 x 40 mm</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>Nigericin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore</td> <td>di osmolalitàGonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 osmometro per punto di congelamento di base</td> Plasmacleaner Plasma Etch PE-Avenger Filtro in policarbonato Cytiva Whatman Nuclepor Track-Etch Membrane Prodotto: 10417104 0,4 &;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> m</td></tr><tr><td>Provetta per ultracentrifuga in policarbonato</td><td>Beckman Coulter</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>Pyranine</td><td>Acros Organics</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta al quarzo (nero)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Resina Sephadex G-75</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & Materiali INC</td><td>Sonics vibra cell</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S plus 0,2</td><td>0,2 &micro; m</td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>Eppendorf</td><td>centrifuga 5418</td><td></td></tr><tr><td>Distanziatore in teflon</td><td>fatto in casa&nbsp;</td><td>A base di teflon</td><td>45 x 26 x 1,5 o 45 x 26 x 3 o 20 x 20 x 3 mm</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optima Max-E</td><td></td></tr><tr><td>Lampada UV</td><td>Spectroline</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS Spectrometer</td><td>Jasco</td><td>V730</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza a campo largo</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Caseina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

costruzione di reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole di dimensioni nanometriche e micrometriche

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

Presentiamo un metodo per incorporare nelle vescicole reti proteiche complesse, che coinvolgono proteine di membrana integrali, enzimi e sensori basati sulla fluorescenza, utilizzando componenti purificati. Questo metodo è rilevante per la progettazione e la costruzione di bioreattori e lo studio di complesse reti di reazioni metaboliche fuori equilibrio. Iniziamo ricostituendo (multiple) proteine di membrana in grandi vescicole unilamellari (LUV) secondo un protocollo precedentemente sviluppato. Quindi incapsulamo una miscela di enzimi purificati, metaboliti e sensori basati sulla fluorescenza (proteine fluorescenti o coloranti) tramite liofilizzazione-scongelamento-estrusione e rimuoviamo i componenti non incorporati mediante centrifugazione e/o cromatografia ad esclusione dimensionale. Le prestazioni delle reti metaboliche vengono misurate in tempo reale monitorando il rapporto ATP/ADP, la concentrazione di metaboliti, il pH interno o altri parametri mediante lettura a fluorescenza. Le nostre vescicole contenenti proteine di membrana con diametro di 100-400 nm possono essere convertite in vescicole unilamellari giganti (GUV), utilizzando le procedure esistenti ma ottimizzate. L'approccio consente l'inclusione di componenti solubili (enzimi, metaboliti, sensori) in vescicole di dimensioni micrometriche, aumentando così il volume dei bioreattori di ordini di grandezza. La rete metabolica contenente i GUV è intrappolata in dispositivi microfluidici per l'analisi mediante microscopia ottica.

La ricostituzione delle proteine solubilizzate di membrana nei liposomi richiede la destabilizzazione delle vescicole preformate. L'aggiunta di basse quantità di Triton X-100 si traduce inizialmente in un aumento dell'assorbanza a 540 nm (A540) a causa di un aumento della dispersione della luce dovuta al rigonfiamento delle vescicole (Figura 4). Il valore massimo di A540 è il punto in cui i liposomi sono saturi di detergente (Rsat), dopodiché qualsiasi ulteriore aggiunta di Triton X-100 comporterà una parziale solubilizzazione delle vescicole. A Rsol, i liposomi sono completamente solubilizzati (Figura 4). Per la ricostituzione delle proteine di membrana, in genere si utilizzano vescicole destabilizzate al 60% oltre Rsat (indicato da freccia).
La proteina di membrana ricostituita ArcD viene utilizzata per trasportare la L-arginina all'interno e la L-ornitina fuori dalle vescicole e viene utilizzata insieme agli enzimi incapsulati ArcA, ArcB e ArcC per riciclare l'ATP dall'ADP e dal fosfato inorganico. GlpT è un antiporter del glicerolo 3-fosfato/fosfato che, insieme al GlpK, è necessario per la sintesi (e l'escrezione) del glicerolo-3-fosfato dal glicerolo più l'ATP prodotto dalla degradazione della L-arginina. L'aggiunta di 5 mM di L-arginina a t = 0 ai proteoliposomi determina un forte aumento del rapporto tra la fluorescenza PercevalHR a 500 e l'eccitazione39 a 430 nm, che riflette il rapporto ATP/ADP all'interno delle vescicole (Figura 5). Dopo l'aggiunta di glicerolo, l'ATP viene utilizzato per la sintesi del glicerolo 3-fosfato, che si traduce in un abbassamento del rapporto ATP/ADP28. La degradazione della L-arginina porta anche a variazioni del pH, che possono essere quantificate utilizzando la piranina o la pHluorin27.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> Figura 5: Riciclo dell'ATP da parte della via di degradazione della L-arginina. I LUV a 2,7 mg di lipidi/mL vengono posti in una cuvetta e viene registrato il rapporto di fluorescenza a 500 nm e 430 nm. 5 mM di L-arginina vengono aggiunti a t = 0. Il rapporto F500/F430 è una misura del rapporto ATP/ADP all'interno delle vescicole. Abbreviazione: LUV = grandi vescicole unilamellari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I LUV produttori di ATP possono anche essere utilizzati per formare GUV. La reidratazione dei proteo-LUV essiccati su un gel di agarosio LGT provoca la formazione di vescicole di dimensioni micrometriche (Figura 6). La formazione di proteo-GUV all'interno delle macchie LUV essiccate dipende fortemente dalla concentrazione locale di lipidi e dal grado di disidratazione. Alcune aree hanno grandi chiazze di GUV, mentre in altri punti della stessa gocciolina non si possono formare GUV o pochi. La formazione di GUV attraverso il rigonfiamento assistito da agarosio LGT si traduce in una gamma di dimensioni GUV, tipicamente da pochi micrometri a più di 50 μm.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> Figura 6: Immagini DIC di proteoGUV formati da rigonfiamento assistito da gel. Barra della scala = 25 μm. Abbreviazioni: DIC = contrasto interferenziale differenziale; GUVs = vescicole unilamellari giganti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I GUV vengono raccolti e intrappolati in un dispositivo microfluidico basato su PDMS passivato a β-caseina (Figura 7). Il dispositivo è progettato in modo tale che molte vescicole possano essere intrappolate e analizzate all'interno di un singolo esperimento e il dispositivo viene utilizzato per controllare l'ambiente esterno (portata, composizione del tampone, ecc.) 34. Anche quando la resa dei proteo-GUV è bassa, il flusso costante di GUV attraverso il chip microfluidico consente la raccolta di molte vescicole. Una volta intrappolato un numero sufficiente di GUV, il sistema viene lavato con un tampone osmoticamente bilanciato per rimuovere componenti esterni come proteine solubili, piccole molecole e sonde fluorescenti. Il tampone di lavaggio viene quindi sostituito da una soluzione di substrato di uguale osmolalità contenente 50 mM KPi (pH 7,0), quantità variabili di glucosio (per regolare l'osmolalità) e substrati come 10 mM di L-arginina. Viene eseguito un esperimento di serie temporali su diverse trappole del chip microfluidico e le immagini vengono scattate ogni 90 s (eccitazione di 405 nm e 488 nm quando si utilizza PercevalHR). Inoltre, viene scattata un'immagine in campo chiaro in ogni punto temporale. Il rapporto tra le intensità di emissione dopo l'eccitazione a 488 e 405 nm è una misura del rapporto ADP/ATP nelle vescicole.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> Figura 7: Intrappolamento delle vescicole con il chip microfluidico. (A) Intrappolamento delle vescicole, accompagnato dalla capacità di controllare l'ambiente esterno e la velocità di flusso. (B) ProteoGUV intrappolati in un dispositivo microfluidico ed eccitati con un laser a 405 nm (verde) e un laser a 488 nm (rosso). L'emissione per entrambi i canali è misurata a &gt;500 nm. L'immagine in campo chiaro consente la visualizzazione delle vescicole senza fluorescenza. Barra della scala = 25 μm. Abbreviazione: GUVs = vescicole giganti-unilamellari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo un protocollo per la ricostituzione delle proteine di membrana e l'incapsulamento di enzimi e altri componenti idrosolubili in vescicole lipidiche di dimensioni sub-micrometriche e micrometriche.

Costruzione di reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole di dimensioni nanometriche e micrometriche

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

Nei Paesi Bassi, il consorzio BaSyC mira a costruire cellule sintetiche a partire da componenti molecolari. Il consorzio BaSyC è composto da gruppi di ricerca che spaziano dalla biologia molecolare alla chimica, alla fisica e alle scienze computazionali. L'obiettivo di questo consorzio è quello di creare un sistema autoreplicante in grado di crescere autonomamente per trasmettere informazioni e per dividere.E attualmente ci concentriamo sulla costruzione di reti molecolari che sono integrate verso sistemi molecolari più complessi. I recenti sviluppi nella biologia sintetica includono l'ingegnerizzazione di moduli per funzioni cellulari, integrandoli in reti complesse per applicazioni in diagnostica, terapia, immunologia sintetica e materiali adattivi. Questo progresso si estende a gruppi in Europa, America e Asia, portando avanti approcci sia dall'alto verso il basso che dal basso verso l'alto alla costruzione di cellule sintetiche.Le attuali tecnologie nel nostro campo includono l'ingegneria e i metodi evolutivi per costruire e ottimizzare le reti metaboliche. Utilizziamo l'intelligenza artificiale per la selezione molecolare e tecniche biochimiche e biofisiche avanzate per l'isolamento dei componenti e la formazione di reti. Impieghiamo anche la ricostituzione della membrana, l'incapsulamento fisico e la visualizzazione tramite spettroscopia fluorescente e microscopia.Con l'integrazione dei moduli, il numero di proteine di membrana e di enzimi aumenta enormemente, il che pone dei limiti alle nostre tecnologie di ricostituzione e incapsulamento. L'incapsulamento stocastico diventa un problema con le vescicole di dimensioni inferiori al micron e l'efficienza della formazione di vescicole di dimensioni micrometriche diminuisce quando più proteine di membrana vengono ricostituite nella membrana lipidica. A Groningen, abbiamo sviluppato reti metaboliche per la produzione di ATP e il mantenimento di uno stato di squilibrio attraverso l'alimentazione del substrato e l'esportazione del prodotto.Inoltre, abbiamo collegato il riciclaggio dell'ATP alla sintesi e all'escrezione dei precursori lipidici, consentendo alle vescicole secondarie di produrre lipidi, il che rappresenta un progresso significativo nel nostro campo.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

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Qui descriviamo semplici metodi per la preparazione di vescicole, l'incapsulamento di trascrizione e traduzione macchinari, e il monitoraggio della produzione di proteine. La risultante sistemi cell-free possono essere utilizzati come punto di partenza da cui costruire imita cellulari sempre più complessi.

L&#39;incapsulamento di trascrizione privo di cellule e macchinari traduzione in vescicole per la costruzione di Mimics cellulari

Il protocollo presentato descrive l'analisi del trasporto mediato da proteine di membrana a livello di singolo trasportatore utilizzando doppi strati lipidici privi di solventi che attraversano i pori. Ciò si ottiene grazie alla creazione di chip array di nanopori prodotti in serie, combinati con l'acquisizione e l'analisi dei dati altamente parallele, consentendo la futura creazione di screening degli effettori delle proteine di membrana.

Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Molte proteine svolgono la loro funzione quando sono attaccate alle superfici della membrana. Il legame di proteine estrinseche sulle membrane dei nanodischi può essere indirettamente ripreso mediante microscopia elettronica a trasmissione. Mostriamo che il caratteristico impilamento (rouleau) dei nanodischi indotto dal fosfotungstato di sodio con colorazione negativa è impedito dal legame della proteina estrinseca.

Metodo per visualizzare e analizzare membrana proteine ​​interagenti con microscopia elettronica a trasmissione

Molte proteine nella cellula senso e inducono la curvatura della membrana. Descriviamo un metodo per tirare nanotubi di membrana da vescicole lipidiche per studiare l'interazione delle proteine o qualsiasi molecola di curvatura-attivo con membrane curvo in vitro.

Tirando nanotubi di membrana da vescicole unilamellari gigante

Solido-supportato, privo di proteine, doppia membrane di doppio strato del fosfolipide (DLBM) possono essere trasformate in reti di nanotube del lipido complessa e dinamica e possono servire come modelli 2D ascendente del reticolo endoplasmico.

Formazione spontanea e riorganizzazione delle reti di Nanotube del lipido artificiale come un modello Bottom-Up per il reticolo endoplasmico

Questo protocollo descrive un processo per fabbricare reti di nanotubi lipidici utilizzando la motilità della kinesina planante in combinazione con vescicole lipidiche unilamellari giganti.

Fabbricazione di reti di nanotubi lipidici multicomponenti utilizzando il test di motilità di Kinesin gliding

All'interfaccia di solventi organici e acquosi, proteine arofhiliche elastine su misura si assemblano in complesse strutture supramolecolari come vescicoli, fibre e coacervate innescate da parametri ambientali. I protocolli di assemblaggio descritti producono compartimenti basati su membrana proteica (PMBC) con proprietà regolabili, consentendo l'incapsulamento di vari carichi.

Diretto Assemblea di proteine Elastin-like in strutture supramolecolari definite e Incapsulamento di carico In Vitro

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

Il presente protocollo descrive l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), una tecnica microfluidica per generare liposomi biocompatibili. OLA produce liposomi monodispersi di dimensioni micron con un incapsulamento efficiente, consentendo una sperimentazione immediata su chip. Si prevede che questo protocollo sia particolarmente adatto per la biologia sintetica e la ricerca sulle cellule sintetiche.

Assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo su chip per la bioingegneria

Questo articolo introduce una semplice ricostituzione one-pot di reti citoscheletriche all'interno di vescicole giganti separate in fase. Il metodo può essere generalizzato e applicato all'incapsulamento o al confinamento di un'ampia gamma di biomolecole.

In vitro Ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV)

Scopri come costruire reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole nanometriche e micrometriche mediante ricostituzione di proteine di membrana e incapsulamento di enzimi. Questo protocollo avanza la biologia sintetica verso sistemi autoreplicanti.

Costruzione di reti metaboliche fuori equilibrio in vescicole di dimensioni nanometriche e micrometriche

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