Name: Un modello di ratto di occlusione/riperfusione dellarteria cerebrale media senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Scopri un modello di ictus ischemico nel ratto che preserva l'integrità anatomica dei vasi cerebrali mediante tecniche microchirurgiche e filamento intraluminale. Questo metodo riduce la mortalità al 16,7% e permette analisi quantitative dell'infarto con ImageJ.

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Questo lavoro è stato supportato dal progetto di intelligence estera della provincia di Hebei nel 2023. Ringraziamo Lisa Kreiner, PhD, di Liwen Bianji, (Edanz) (www.liwenbianji.cn), per aver curato il testo inglese di una bozza di questo manoscritto.

La procedura sperimentale ha ricevuto l'approvazione dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Yantai (Numero di Approvazione: YTDX20230410) e ha aderito alle Linee Guida del National Institutes of Health per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio. Per questo studio sono stati utilizzati ratti maschi di Sprague-Dawley di peso compreso tra 300 e 350 g. Un elenco completo degli animali, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate è fornito nella Tabella dei materiali.
1. Preparazione degli animali
<ol>
	<li>Alloggiare gli animali in un ambiente che mantenga un ciclo luce/buio di 12 ore, temperatura e umidità controllate. Assicurati che abbiano accesso illimitato a cibo e acqua.</li>
</ol>
2. Anestesia
<ol>
	<li>Anestetizzare i ratti mediante iniezione intraperitoneale con una miscela contenente ketamina (80 mg/kg) e xilazina (20 mg/kg). 
	NOTA: Inclinare la testa e il corpo dei ratti verso il basso. Il sito di iniezione si trova nel quadrante inferiore destro dell'addome dell'animale. Tirare indietro lo stantuffo prima dell'iniezione. Il volume medio di iniezione è di 0,4 mL.</li>
	<li>Confermare l'induzione dell'anestesia valutando il riflesso di ritiro della zampa posteriore e il riflesso di ammiccamento. Se non si raggiunge un'adeguata profondità di anestesia, integrare con isoflurano durante la procedura chirurgica.</li>
</ol>
3. Procedura di modellazione ischemica
<ol>
	<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici utilizzando un'autoclave. Disinfettare i tavoli operatori e le relative apparecchiature con etanolo al 70%.</li>
	<li>Preparare il sito chirurgico radendo il pelo attorno al sito di incisione previsto. Disinfettare la pelle nel sito chirurgico tre volte con betadina ed etanolo al 70%.</li>
	<li>Praticare un'incisione sulla linea mediana sul lato ventrale, lunga circa 1,5 cm, e aprire la fascia superficiale.</li>
	<li>Eseguire una dissezione acuta e smussata per esporre l'arteria carotide esterna (ECA), l'arteria carotide interna (ICA) e l'arteria carotide comune (CCA) secondo il metodo precedentemente descritto7.</li>
	<li>Posizionare tre suture di seta 4-0 attorno al CCA e un'altra sutura di seta attraverso l'ECA vicino alla biforcazione ICA. Fare un nodo scorsoio sganciabile sul CCA prossimale. Stringere la sutura sul CCA distale usando un emostatico per bloccare il flusso sanguigno. Legare liberamente un altro nodo scorsoio attorno al CCA durante la sutura per assicurarsi che il vaso non sia occluso. 
	NOTA: Assicurarsi che il nodo scorsoio non sia eccessivamente stretto, ma solo sufficiente a bloccare il flusso sanguigno, poiché dovrà essere rilasciato durante la sutura vascolare.</li>
	<li>Praticare un'incisione di 0,5 mm tra la sutura di seta prossimale e la sutura centrale sul CCA usando le forbici. 
	NOTA: Assicurarsi che l'incisione consenta al filamento (punta rivestita di silicone) di entrare nel CCA.</li>
	<li>Introdurre un filamento 4-0 lungo 3 cm (punta rivestita di silicone) nel CCA. Stringere le suture di seta attorno al CCA per fissare il filamento intraluminale e prevenire il sanguinamento; quindi, rimuovere la sutura dal CCA distale.</li>
	<li>Continuare a inserire il filamento nel lume dell'MCA, controllando le suture attorno all'ECA per assicurarsi che il filamento non entri nell'ECA. La lunghezza di inserimento è tipicamente compresa tra 18 mm e 20 mm.</li>
	<li>Avvia un timer e registra l'ora in cui inizia l'occlusione. Sutura l'incisione del collo con suture di seta 3-0 e posiziona con cura l'animale in una gabbia di recupero. Somministrare 0,5 mL di soluzione fisiologica normale per via intraperitoneale.</li>
</ol>
4. Sutura microchirurgica del CCA
<ol>
	<li>Anestetizzare nuovamente il ratto 1,5 ore dopo l'ischemia. Disinfettare il sito dell'incisione tre volte con etanolo al 70% e riaprire l'incisione.</li>
	<li>Ritirare delicatamente il filamento occludente fino a quando la punta bianca è chiaramente visibile vicino all'incisione CCA. Posizionare un micro morsetto orizzontalmente vicino al nodo di sutura intraluminale fissato vicino alla biforcazione CCA. 
	NOTA: Evitare di bloccare la punta del filamento bianco per evitare il distacco del silicone e la conseguente trombosi.</li>
	<li>Rilasciare il nodo di sutura intraluminale fissato e rimuovere completamente il filamento.</li>
	<li>Posizionare un altro micro morsetto vicino al lato dell'estremità del cuore del nodo CCA prossimale. Successivamente, rimuovere il nodo di sutura attorno al CCA. prossimale
	NOTA: Il corretto posizionamento dei morsetti è fondamentale per sollevare i vasi fissi nelle fasi successive per facilitare la sutura microvascolare. Posizionare i morsetti orizzontalmente sui muscoli circostanti per evitare lo scivolamento.</li>
	<li>Sciacquare il sito dell'incisione con soluzione fisiologica normale e asciugare l'area con un batuffolo di cotone sterile per rimuovere il sangue e ottenere un campo chirurgico chiaro.</li>
	<li>Al microscopio (ingrandimento 4x), suturare l'incisione CCA utilizzando suture microchirurgiche 11-0 in uno schema interrotto, che in genere richiede due punti di sutura a seconda delle dimensioni dell'incisione.</li>
	<li>Dopo la sutura, rimuovere i micro morsetti da entrambe le estremità del CCA per ripristinare il flusso sanguigno.</li>
	<li>Applicare pressione con un batuffolo di cotone sterile sul sito di sutura CCA per 30 s. Osservare il CCA per 2 minuti per assicurarsi che non si verifichi sanguinamento. Sutura l'incisione del collo del ratto e metti l'animale in una scatola di cura a 35 °C per il recupero dell'anestesia prima di rimetterlo nella gabbia. 
	NOTA: Somministrare per via intraperitoneale con meloxicam alla dose di 2 mg/kg per l'analgesia post-operatoria.</li>
</ol>
5. Colorazione con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC)
<ol>
	<li>Tre giorni dopo l'ischemia-riperfusione, sopprimere gli animali in anestesia profonda con isoflurano al 4% e lussazione cervicale.</li>
	<li>Rimuovete i cervelli e tagliateli in sezioni coronali spesse 2 mm usando una lama di bisturi8.</li>
	<li>Incubare le sezioni cerebrali con TTC al 2% per 20 minuti a 37 °C.</li>
	<li>Sciacquare due volte le sezioni cerebrali con formalina al 10%, quindi fissarle con formalina al 10% per 30 minuti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cattura fotografie digitali di fette consecutive e misura quantitativamente le aree di infarto utilizzando il software Image J.</li>
</ol>
6. Test di funzionalità neurologica
NOTA: La funzione neurologica è stata valutata utilizzando il test di Garcia, a seguito di un precedente rapporto9.
<ol>
	<li>Valutare l'attività spontanea, la simmetria nel movimento di tutti e quattro gli arti, l'allungamento della zampa anteriore, l'arrampicata, la propriocezione del corpo e la risposta al tocco delle vibrisse. Assegna punteggi in base ai criteri del test di Garcia, con un punteggio massimo di 18 punti che indica una normale funzione neurologica.</li>
</ol>
7. Analisi statistica
<ol>
	<li>Utilizza GraphPad Prism per condurre analisi statistiche utilizzando il t-test di Student. Esprimere i dati come media ± deviazione standard. Considera le differenze tra le medie statisticamente significative se P < 0,05.</li>
</ol>

Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats with Preserved Vascular Anatomy

<ol><li>Tu, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((China+stroke+surveillance+report+2021%5BTitle%5D)+AND+%22Mil+Med+Res%22%5BJournal%5D)">China stroke surveillance report 2021.</a> Mil Med Res. 10 (1), 33(2023).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oxidative+stress+and+inflammation+to+prevent+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Front+in+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting oxidative stress and inflammation to prevent ischemia-reperfusion injury.</a> Front in Mol Neurosci. 13, 28(2020).</li>
<li>Ringelstein, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+and+extent+of+hemispheric+brain+infarctions+and+clinical+outcome+in+early+and+delayed+middle+cerebral+artery+recanalization%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Type and extent of hemispheric brain infarctions and clinical outcome in early and delayed middle cerebral artery recanalization.</a> Neurology. 42 (2), 289-298 (1992).</li>
<li>Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+studies+of+ischemic+brain+edema%3A+A+new+experimental+model+of+cerebral+embolism+in+rats+in+which+recirculation+can+be+introduced+in+the+ischemic+area%5BTitle%5D)+AND+%22Jap+J+Stroke%22%5BJournal%5D)">Experimental studies of ischemic brain edema: A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.</a> Jap J Stroke. 8, 1-8 (1986).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Trueman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+re-examination+of+the+intraluminal+filament+MCAO+model%3A+Impact+of+external+carotid+artery+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Stroke+Res%22%5BJournal%5D)">A critical re-examination of the intraluminal filament MCAO model: Impact of external carotid artery transection.</a> Transl Stroke Res. 2 (4), 651-661 (2011).</li>
<li>Ansari, S., Azari, H., McConnell, D. J., Afzal, A., Mocco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+%28MCAO%29+model+for+ischemic+stroke+with+laser+Doppler+flowmetry+guidance+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intraluminal middle cerebral artery occlusion (MCAO) model for ischemic stroke with laser Doppler flowmetry guidance in mice.</a> J Vis Exp. (51), e2879(2011).</li>
<li>Yu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icaritin+inhibits+neuroinflammation+in+a+rat+cerebral+ischemia+model+by+regulating+microglial+polarization+through+the+GPER-ERK-NF-%CE%BAB+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Icaritin inhibits neuroinflammation in a rat cerebral ischemia model by regulating microglial polarization through the GPER-ERK-NF-κB signaling pathway.</a> Mol Med. 28 (1), 142(2022).</li>
<li>Garcia, J. H., Wagner, S., Liu, K. F., Hu, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+Deficit+and+extent+of+neuronal+necrosis+attributable+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Neurological Deficit and extent of neuronal necrosis attributable to middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 26 (4), 627-634 (1995).</li>
<li>Bracko, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Nitropropionic+acid-induced+ischemia+tolerance+in+the+rat+brain+is+mediated+by+reduced+metabolic+activity+and+cerebral+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">3-Nitropropionic acid-induced ischemia tolerance in the rat brain is mediated by reduced metabolic activity and cerebral blood flow.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 34 (9), 1522-1530 (2014).</li>
<li>Goldmacher, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+transplanted+bone+marrow+stem+cells+and+their+effects+in+the+rat+MCAO+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tracking transplanted bone marrow stem cells and their effects in the rat MCAO stroke model.</a> PLoS One. 8 (3), e60049(2013).</li>
<li>Lee, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+potential+of+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">The therapeutic potential of human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells in Alzheimer's disease.</a> Neurosci Lett. 481 (1), 30-35 (2010).</li>
<li>Connolly, E. S., Winfree, C. J., Solomon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+and+strain-related+variables+significantly+affect+outcome+in+a+murine+model+of+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Procedural and strain-related variables significantly affect outcome in a murine model of focal cerebral ischemia.</a> Neurosurgery. 38 (3), 523-531 (1996).</li>
<li>Barone, F. C., Knudsen, D. J., Nelson, A. H., Feuerstein, G. Z., Willette, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+strain+differences+in+susceptibility+to+cerebral+ischemia+are+related+to+cerebral+vascular+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Mouse strain differences in susceptibility to cerebral ischemia are related to cerebral vascular anatomy.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 13 (4), 683-692 (1993).</li>
<li>Dittmar, M., Spruss, T., Schuierer, G., Horn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2003).</li>
<li>Virtanen, T., Jolkkonen, J., Sivenius, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((External+carotid+artery+territory+ischemia+impairs+outcome+in+the+endovascular+filament+model+of+middle+cerebral+artery+occlusion+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">External carotid artery territory ischemia impairs outcome in the endovascular filament model of middle cerebral artery occlusion in rats.</a> Stroke. 34 (9), 2252-2257 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun potenziale conflitto di interessi da rivelare.

MCAo è un metodo ampiamente utilizzato per creare modelli animali di ictus, replicando efficacemente il processo di ictus osservato nei pazienti ripristinando il flusso sanguigno dopo l'ischemia 10,11,12. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello di ictus ischemico che consente la riperfusione dal CCA senza causare danni all'ECA. Dopo l'induzione dell'ischemia, viene eseguita la riparazione microchirurgica del CCA. Sebbene non sia stata condotta la misurazione diretta del flusso sanguigno del CCA, gli sperimentatori hanno osservato pulsazioni vascolari nel CCA prima di procedere con la riperfusione. Questa tecnica preserva l'integrità anatomica dei vasi del collo mentre assomiglia molto al processo di ictus nei pazienti. Inoltre, le valutazioni della funzione neurologica e dell'area di ischemia cerebrale hanno confermato la validità dell'ictus indotto da questo approccio chirurgico.
I modelli di ictus ischemico descritti in precedenza possono essere influenzati da vari fattori. Nel metodo di Koizumi et al.4, la riperfusione sanguigna si basa fortemente sul circolo di Willis a causa della legatura del CCA. Tuttavia, le variazioni della vascolarizzazione cerebrale possono influenzare il volume finale dell'infarto cerebrale, aumentando potenzialmente il tasso di mortalità del modello di ictus a causa della bassa perfusione sanguigna 13,14. Inoltre, l'ischemia dell'ECA può compromettere la funzione dei muscoli facciali e dei nervi, influenzando la valutazione di varie funzioni neurologiche15,16.
Il metodo attuale affronta queste sfide attraverso tre passaggi chiave: (1) Mantenere l'incisione CCA il più piccola possibile, solo quanto basta per l'inserimento del filamento, riducendo il tempo e i danni associati alla sutura vascolare. (2) Posizionare i morsetti microvascolari il più vicino possibile alla biforcazione del CCA durante il bloccaggio del CCA distale per evitare il bloccaggio della punta del filamento bianco, che potrebbe portare al distacco del silicone e alla trombosi. (3) Osservare il CCA per la ripresa della pulsazione e la mancanza di sanguinamento sostanziale prima di suturare l'incisione del collo della linea mediana dopo la riparazione vascolare.
Il metodo attuale presenta diverse limitazioni. In primo luogo, esiste la possibilità di formare emboli nel sito di sutura, che potrebbero portare a un'ulteriore ischemia cerebrale se si staccano. Questo rischio dovrebbe essere attentamente considerato e gestito in esperimenti futuri. In secondo luogo, lo studio non ha monitorato il peso corporeo dei ratti, il che rende difficile determinare se il metodo ha influenzato l'assunzione di cibo. L'assunzione di cibo è un indicatore diretto dei vantaggi del metodo e la sua valutazione potrebbe fornire informazioni preziose. Infine, il metodo attuale richiede competenze tecniche nelle operazioni microchirurgiche, che possono limitarne l'uso diffuso senza un'adeguata formazione e competenza.
In sintesi, sebbene il metodo di modellazione MCAo offra un'elevata rilevanza fisiologica e integrità strutturale, presenta limitazioni che devono essere affrontate per una sperimentazione più robusta. Preservare l'integrità anatomica dei vasi del collo e simulare da vicino i processi di ictus nei pazienti sono punti di forza significativi del metodo. Questo approccio contribuirà senza dubbio in modo significativo alla ricerca sull'ictus ischemico, migliorando l'affidabilità e l'accuratezza dei modelli sperimentali. In definitiva, questo può portare a un minor numero di gruppi sperimentali necessari per testare gli effetti terapeutici, con conseguenti risultati sperimentali più affidabili.

L'ictus, la principale causa di morte e disfunzione neurologica a lungo termine negli adulti di tutto il mondo, comprende vari tipi, con l'ictus ischemico che rappresenta circa l'81,9% dei casi, mentre l'emorragia cerebrale e l'emorragia subaracnoidea rappresentano rispettivamente il 14,9% e il 3,11. L'ictus ischemico spesso deriva da aterosclerosi o occlusione dell'arteria cerebrale media (MCA), con conseguente riduzione del flusso sanguigno cerebrale locale e conseguente danno cerebrale. Questa riduzione dell'apporto di nutrienti alle cellule ischemiche innesca l'esaurimento dell'energia, causando la perdita di integrità della membrana, il rigonfiamento cellulare e l'eventuale lisi. Inoltre, fattori come l'aumento del calcio intracellulare, il rilascio eccitatorio di aminoacidi, l'aumento della produzione di radicali liberi e l'attivazione delle cellule infiammatorie contribuiscono al danno del tessuto cerebrale post-ictus2.
Gli obiettivi del trattamento per l'ictus ischemico sono molteplici: ridurre il danno neurologico in corso e ridurre la mortalità e la disabilità a lungo termine; prevenire le complicanze derivanti dall'immobilità e dalla disfunzione neurologica; e ridurre al minimo il rischio di recidiva dell'ictus. Data la complessità della fisiopatologia dell'ictus ischemico, un robusto modello di ictus è essenziale per la ricerca e lo sviluppo di trattamenti mirati all'ictus ischemico.
Attualmente, l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) è un modello animale comune di ictus ischemico3. La MCAo viene tipicamente eseguita inserendo un monofilamento con punta in silicone o smussato con fiamma attraverso i vasi cervicali fino a raggiungere l'origine dell'arteria cerebrale media (MCA). Nel 1986, Koizumi e colleghi hanno sviluppato una tecnica che prevede l'inserimento di un monofilamento con punta in silicone attraverso un'incisione nell'arteria carotide comune (CCA), permettendogli di raggiungere l'ingresso dell'MCA e bloccarne il flusso sanguigno4. Nel 1989, il gruppo di Longa riportò un altro metodo MCAo che prevedeva l'introduzione di un monofilamento attraverso un'incisione nell'arteria carotide esterna (ECA). Il monofilamento attraversa quindi la biforcazione dell'arteria carotide interna (ICA) e dell'ECA prima di raggiungere il punto di partenza dell'MCA5.
I limiti dei due metodi esistenti per indurre MCAo sono evidenti. Il metodo di Koizumi richiede il blocco permanente del CCA omolaterale, portando a una ridotta perfusione MCA poiché la riperfusione si basa esclusivamente sul cerchio di Willis4. Al contrario, il metodo di Longa prevede il taglio dell'ECA, con conseguente danno al sistema ECA e conseguente compromissione della funzione dei muscoli facciali5. Questo danno può influire sull'assunzione di cibo e acqua, oltre a causare disfunzioni sensoriali del viso, influenzando la riabilitazione e la valutazione della funzione neurologica post-ictus ischemico6.
L'attuale protocollo cerca di affrontare queste limitazioni sviluppando un nuovo metodo per indurre un modello di ictus ischemico senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali. Questo nuovo approccio utilizza tecniche microchirurgiche per riparare il CCA, evitando così gli inconvenienti associati ai metodi precedenti.

<table><tbody><tr><td>10% formalina</td><td>Beijing Labgic Technology Co., Ltd.</td><td>BL913A</td><td></td></tr><tr><td>11-0 suture microchirurgiche</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3/8 1&volte; </td><td></td>5</tr><tr><td>2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC)</td> <td>SIGMA</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>3-0 sutura di seta</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>3-0</td><td></td></tr><tr><td>4% isoflurano&nbsp; &nbsp;</td><td>Fornitore verificato - Tianjin Ringpu Bio-Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>20221102</tr><tr><td>6-0 sutura di seta</td><td>Ningbo Medical Suture Needle Co., Ltd.</td><td>6-0</td><td></td></tr><tr><td>70% etanolo</td><td>Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd.</td><td></td><td></td>20230408</tr><tr><td>Filamento</td><td>Xinong Technologies Co., Ltd.</td><td>2838-A5</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp; &nbsp;</td><td>Fornitore verificato - Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td>230613BL</td><td></td></tr><tr><td>Maschio Sprague Dawley ratti</td><td>Jinan Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd.</td><td>SCXK (Lu) 20190003</td><td></td></tr><tr><td>Microclip</td><td>Shanghai Jinzhong Medical Device Factory</td><td>W40150</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>ZEISS</td><td>S100 OPMI pico</td><td></td></tr><tr><td>Scatola infermieristica</td><td>Beijing Fuyi Electrical Appliance Co., Ltd.</td><td>FYL-YS-100L</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>SIGMA</td><td>PHR3263</td><td></td></tr></tbody></table>

un modello di ratto di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali

A Rat Model of Middle Cerebral Artery Occlusion/Reperfusion Without Damaging the Anatomical Structure of Cerebral Vessels

L'ictus ischemico rappresenta la causa principale di disabilità e mortalità a lungo termine tra gli adulti in tutto il mondo. I modelli animali di ictus ischemico hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione dei suoi meccanismi patologici e allo sviluppo di potenziali trattamenti. Attualmente, ci sono due metodi comuni che coinvolgono tecniche di filamento (sutura endovascolare) per indurre modelli animali di ischemia cerebrale. Tuttavia, questi metodi hanno limitazioni intrinseche, come la riduzione della perfusione sanguigna al cervello, il danno al sistema dell'arteria carotide esterna, la ridotta assunzione di cibo e/o acqua e la disfunzione sensoriale del viso. Questo articolo introduce un nuovo metodo per indurre un modello di ictus ischemico di ratto senza compromettere l'anatomia vascolare cerebrale. In questo studio, l'arteria carotide comune (CCA) dei ratti Sprague-Dawley è stata esposta ed è stata praticata un'incisione. Un filamento è stato quindi inserito attraverso l'incisione nell'arteria carotide interna per occludere l'arteria cerebrale media. Dopo 1,5 ore di ischemia indotta, il filamento occludente è stato completamente rimosso sia dall'arteria carotide interna che dal CCA. L'incisione nel CCA è stata successivamente suturata utilizzando suture microchirurgiche 11-0 al microscopio (ingrandimento 4x). Attraverso l'utilizzo di tecniche microchirurgiche per riparare il CCA, questo studio ha sviluppato con successo un metodo unico per indurre un modello di ictus ischemico nei ratti, preservando l'integrità anatomica dei vasi sanguigni cerebrali.

Il processo di microsutura 
Il filamento è stato ritirato vicino all'incisione della carotide comune fino a quando la punta bianca del filamento è diventata visibile (Figura 1A). Successivamente, sono state posizionate pinze microchirurgiche sulla carotide comune (Figura 1B). Al microscopio con un ingrandimento di 4x, l'incisione della carotide comune è stata suturata utilizzando punti di sutura microchirurgici in modo interrotto (Figura 1C). In seguito, le micro pinze sono state rimosse dalla carotide comune, ripristinando la struttura anatomica e il flusso sanguigno (Figura 1D).
Colorazione con TTC e tasso di mortalità 
Un totale di 12 ratti maschi adulti è stato suddiviso casualmente in due gruppi: sham e modello (n = 6 per ciascun gruppo). Sfortunatamente, un animale nel gruppo sham è morto a causa di un sovradosaggio di anestetico e un animale nel gruppo modello è deceduto entro 24 ore. Gli infarti risultanti dall'ischemia cerebrale sono stati osservati sia nello striato che nella corteccia (Figura 2A). A 3 giorni dall'ictus ischemico, la percentuale totale di infarto è stata misurata pari al 29,3% ± 1,6% dell'emisfero (Figura 2B), con un tasso di mortalità del 16,7% dopo l'intervento chirurgico.
Valutazione della funzione neurologica 
A 1 e 3 giorni dopo l'ictus ischemico, i punteggi dei gruppi modello sono diminuiti significativamente rispetto a quelli dei gruppi sham (17,8 ± 0,4 vs. 8,2 ± 1,5, Figura 3A; 17,6 ± 0,9 vs. 9,6 ± 1,3, Figura 3B, rispettivamente).
<img alt="Diagramma della tecnica di sutura chirurgica; pinzetta che trattiene il tessuto; passaggi: inserimento dell'ago, annodatura." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Il processo di microsutura. (A) Il filamento viene estratto dalla CCA. Le frecce blu indicano le pinze microvascolari. (B) La freccia nera indica l'incisione dopo la completa rimozione del filamento. Le frecce blu indicano le pinze microvascolari. (C) Sotto un microscopio (ingrandito 4x), l'incisione della CCA viene suturata utilizzando suture microchirurgiche 11-0 in un modello interrotto. Le frecce blu indicano le pinze microvascolari. La freccia nera indica l'incisione suturata. (D) Le pinze microscopiche vengono rimosse e il flusso sanguigno della CCA viene ripristinato. La freccia nera indica il sito suturato della CCA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig01large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Sezioni di tessuto cerebrale ischemico, grafico a barre, confronto della percentuale di area ischemica, risultati dell'esperimento." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Risultati della colorazione con TTC del modello di ischemia. (A) Immagini rappresentative di sezioni cerebrali colorate con cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) dopo ischemia cerebrale. Nei tessuti vitali, il TTC viene ridotto enzimaticamente dalle deidrogenasi in 1,3,5-trifenilformazano, che ha un colore rosso. I tessuti nelle aree necrotiche rimangono bianchi a causa dell'assenza di tale attività enzimatica. (B) Percentuale di area ischemica nei ratti a 3 giorni dall'ischemia cerebrale. Rispetto al gruppo Sham, **P &lt; 0,01. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. Ogni gruppo comprendeva cinque ratti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig02large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Grafico a barre che confronta i punteggi di Garcia tra Sham e Modello, che mostra una differenza significativa (**)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66635/66635fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Valutazione della funzione neurologica. (A) Punteggi di Garcia a 1 giorno dall'ischemia cerebrale. (B) Punteggi di Garcia a 3 giorni dall'ischemia cerebrale. Rispetto al gruppo Sham, **P &lt; 0,01. I dati sono espressi come media ± deviazione standard. Ogni gruppo comprendeva cinque ratti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66635/66635fig03large.jpg" target="_blank">Cliccare qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

Il protocollo attuale descrive un modello di ratto di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media che preserva la struttura anatomica dei vasi cerebrali senza causare danni.

Un modello di ratto di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali

Ischemic stroke stands as the primary cause of long-term disability and mortality among adults worldwide. Animal models of ischemic stroke have ...

Questo studio sviluppa un modello di ratto per l'occlusione o la riperfusione dell'arteria cerebrale media che mantiene l'integrazione dei vasi cerebrali. Si concentra sull'introduzione di un nuovo metodo per indurre un modello di ictus ischemico di ratto senza compromettere l'anatomia vascolare cerebrale. Il progetto utilizza tecniche microchirurgiche e l'ischemia indotta da filamenti.Introduce un metodo per indurre l'ischemia senza danneggiare l'arteria carotide comune o il sistema carotideo esterno. Contrariamente alle tecniche che possono compromettere in modo permanente il flusso sanguigno o danneggiare l'anatomia vascolare cerebrale, questo protocollo mantiene l'integrità anatomica di diversi vasi. Fornisce un approccio più accurato e meno dannoso allo studio dell'ictus ischemico.Per iniziare, posizionare il ratto anestetizzato su una piattaforma operativa. Dopo aver rasato il pelo intorno alla gola e alla zona del collo sinistro, disinfettare il sito chirurgico tre volte con Betadine ed etanolo al 70%. Praticare un'incisione della linea mediana lunga 1,5 centimetri sul lato ventrale del collo e aprire la fascia superficiale.Eseguire la dissezione contundente per esporre l'arteria carotide esterna, l'arteria carotide interna e l'arteria carotide comune. Posizionare tre suture di seta 4-0 attorno all'arteria carotide comune e un'altra sutura di seta attraverso l'arteria carotide esterna vicino alla biforcazione dell'arteria carotide interna. Fare un nodo scorsoio sganciabile sull'arteria carotide comune prossimale.Stringere la sutura sull'arteria carotide comune distale usando un emostatico per bloccare il flusso sanguigno. Legare liberamente un altro nodo scorsoio attorno all'arteria carotide comune durante la sutura per assicurarsi che il vaso non sia occluso. Ora, usando le forbici, fai un'incisione di 0,5 millimetri tra la sutura di seta prossimale e la sutura centrale sull'arteria carotide comune.Introdurre un filamento 4-0 lungo tre centimetri nell'arteria carotide comune. Stringere le suture di seta attorno all'arteria carotide comune per fissare il filamento intraluminale e prevenire il sanguinamento. Quindi rimuovere la sutura dall'arteria carotide comune distale.Continuare a inserire il filamento nel lume dell'arteria cerebrale media controllando le suture attorno all'arteria carotide esterna. Avvia un timer e registra l'ora in cui inizia l'occlusione. Sutura l'incisione del collo con suture di seta 3-0.Posizionare con cura l'animale in una gabbia di recupero. Dopo la modellazione ischemica, riaprire l'incisione del collo dal ratto anestetizzato. Al microscopio da dissezione, ritirare delicatamente il filamento occludente posizionando il micromorsetto orizzontalmente vicino al nodo di sutura intraluminale.Continuare a ritirarsi fino a quando la punta bianca è chiaramente visibile vicino all'incisione dell'arteria carotide comune. Quindi rimuovere completamente il filamento e rilasciare il nodo di sutura intraluminale fissato. Posizionare un altro micro morsetto vicino al lato dell'estremità del cuore del nodo prossimale dell'arteria carotide comune.Successivamente, rimuovere il nodo di sutura attorno all'arteria carotide comune prossimale. Sciacquare il sito dell'incisione con soluzione fisiologica. Asciugare l'area con un batuffolo di cotone sterile per rimuovere il sangue e ottenere un campo chirurgico chiaro.Ora con ingrandimento 4x, sutura l'incisione dell'arteria carotide comune utilizzando suture microchirurgiche 11-0 in uno schema interrotto. Dopo la sutura, rimuovere i micro morsetti da entrambe le estremità dell'arteria carotide comune per ripristinare il flusso sanguigno. Applicare pressione con un batuffolo di cotone sterile sul sito di sutura dell'arteria carotide comune per 30 secondi.Osservare l'arteria carotide comune per due minuti per assicurarsi che non si verifichi sanguinamento. Sutura l'incisione del collo e posiziona il ratto in una scatola di cura a 35 gradi Celsius per il recupero dell'anestesia. Tre giorni dopo la riperfusione dell'ischemia, rimuovere il cervello dal ratto soppresso.Congela il cervello a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. Dopo il congelamento, usa un bisturi per tagliare il cervello in sezioni coronali spesse due millimetri. Incubare le sezioni cerebrali con il 2% di TTC per 20 minuti a 37 gradi Celsius.Dopo l'incubazione, trasferire le sezioni cerebrali in una piccola capsula di Petri e scartare il 2% di TTC. Quindi fissare le sezioni cerebrali con il 10% di formalina per 30 minuti a temperatura ambiente. Scartare la formalina e sciacquare le sezioni cerebrali con PBS.Cattura fotografie digitali di fette consecutive. Utilizzando il software ImageJ, è possibile misurare quantitativamente le aree di infarto. Dopo la colorazione TTC, gli infarti derivanti dall'ischemia cerebrale sono stati osservati sia nello striato che nella corteccia.A tre giorni dall'ictus ischemico, la percentuale totale di infarto è stata misurata a circa il 30% dell'emisfero con un tasso di mortalità del 16,7% dopo l'intervento chirurgico.

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Induzione chirurgica del danno ischemico cerebrale nel ratto è un modello ampiamente utilizzato per la ricerca ictus. Qui mostriamo l'induzione di ischemia cerebrale focale da occlusione dell'arteria cerebrale media. Visualizzazione delle infarto risultante dalla colorazione istologica e la risonanza magnetica è anche mostrato.

Modello di ischemia cerebrale focale da occlusione endovascolare Sutura della arteria cerebrale media nel ratto

Dimostriamo nel video un metodo per produrre una occlusione dell'arteria cerebrale media in topi adulti utilizzando un monofilamento intraluminale. Mostriamo anche come valutare il grado di infarto cerebrale da 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione.

Modello murino di Mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale

Questo video mostra la procedura di esecuzione dell'occlusione permanente dell'arteria cerebrale media distale, o MCAO, con l'arteria carotide comune, o legatura CCA, nei ratti anziani per modellare l'ictus ischemico. Questo blocca il flusso sanguigno al cervello, portando alla morte neuronale e generando un modello per studiare i meccanismi dell'ictus e i potenziali trattamenti.

Indurre l'ischemia attraverso l'occlusione dell'arteria carotide media e comune in un modello di ratto

Fonte: Larpthaveesarp, A., et. al. Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media di ictus neonatale nei ratti P10. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'istituzione del modello di occlusione dell'arteria cerebrale media in un cucciolo di ratto. L'arteria carotide interna (ICA) è esposta e una legatura è fissata per limitare il flusso di sangue. Un occlude viene inserito attraverso l'ICA per raggiungere l'arteria cerebrale media. Il cucciolo viene quindi lasciato riprendersi...

Generazione di un'occlusione dell'arteria cerebrale media in un cucciolo di ratto per indurre l'ischemia cerebrale locale

Descriviamo un metodo altamente riproducibile per l'occlusione permanente di un roditore grande vaso sanguigno cerebrale. Questa tecnica può essere realizzato con pochissima danni periferici, minima perdita di sangue, un elevato tasso di sopravvivenza a lungo termine, e volume dell'infarto coerente commisurato alla popolazione clinica umana.

Cerebrale permanente occlusione di vasi<em&gt; Via</em&gt; Doppio Legatura e resezione

L'ictus neonatale è una causa significativa di lesione cerebrale precoce che richiede un modello traslazionale con modelli di lesione focale coerenti e un'elevata riproducibilità per consentire lo studio. Questo studio descrive la procedura chirurgica dettagliata per la creazione di una lesione da ischemia-riperfusione focale unilaterale non emorragica nei roditori equivalenti a termine.

Transient Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale Modello di Stroke neonatale nei ratti P10

L'occlusione di filamento intraluminal dell'arteria cerebrale centrale è il modello più utilizzato in vivo di colpo sperimentale nei roditori. Approccio chirurgico alternativo per consentire la riparazione dell'arteria carotica comune avviene qui, che permette la riperfusione dell'arteria carotica comune e un completo riperfusione nel territorio dell'arteria cerebrale media.

Occlusione dell'arteria cerebrale centrale consentendo di riperfusione tramite riparazione dell'arteria carotica comune nei topi

Un modello murino di ischemia-riperfusione cerebrale è istituito per studiare la patofisiologia del colpo. Abbiamo distalmente legare l'arteria cerebrale centrale di destra e l'arteria carotica comune di destra e ripristinare il flusso sanguigno dopo 10 o 40 min di ischemia.

Occlusione del vaso due Mouse modello di Ischemia-riperfusione cerebrale

Questo protocollo descrive il processo di preparazione alla riperfusione dell'occlusione dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide comune.

Una preparazione del modello modificata per la riperfusione dell'occlusione dell'arteria cerebrale media

L'obiettivo di questo studio era stabilire un metodo riproducibile per eseguire una craniectomia seguita da un'occlusione permanente e selettiva dell'arteria cerebrale media nei ratti, da applicare in studi sperimentali sui deficit di memoria motoria e spaziale.

Occlusione selettiva e permanente dell'arteria cerebrale media nei ratti: un approccio sperimentale per studiare i deficit di memoria motoria e spaziale

Scopri un modello di ictus ischemico nel ratto che preserva l'integrità anatomica dei vasi cerebrali mediante tecniche microchirurgiche e filamento intraluminale. Questo metodo riduce la mortalità al 16,7% e permette analisi quantitative dell'infarto con ImageJ.

Un modello di ratto di occlusione/riperfusione dellarteria cerebrale media senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali (Video) | JoVE Journal

Un modello di ratto di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali

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