Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico
26 aprile 2024
Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.
Il nostro laboratorio è interessato a capire come le proteine del citoscheletro assemblano strutture dinamiche per regolare funzioni come il partizionamento del DNA e la divisione cellulare nei batteri. Siamo anche interessati a scoprire composti che prendono di mira queste proteine del citoscheletro per sviluppare nuovi antibiotici. Il nostro protocollo è un test basato su cellule in cui la proteina del citoscheletro batterico polimerizza in un ambiente molecolarmente affollato nel lievito eucariotico, Schizosaccharomyces pombe.
Con questo approccio, contemporaneamente, possiamo identificare molecole che influenzano direttamente le proteine del citoscheletro batterico, la polimerizzazione e sono potenzialmente tossiche. Utilizzando questa piattaforma di lievito di fissione, abbiamo in programma di esaminare librerie di composti macrociclici, mirando specificamente a FtsZ di batteri patogeni come Helicobacter pylori e Pseudomonas aeruginosa. Abbiamo anche in programma di espandere gli schermi per colpire proteine simili all'actina da Clostridium perfringens coinvolte nella segregazione plasmidica.
Panoramica
Questo studio utilizza il lievito da scissione come ospite eterologo per esaminare la polimerizzazione delle proteine citoscheletriche batteriche FtsZ e MreB, fuse con GFP per la visualizzazione. L'obiettivo è identificare composti che influenzino la loro polimerizzazione mediante microscopia a fluorescenza.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia del citoscheletro
- Scoperta di antibiotici
- Tecniche di imaging cellulare
Sfondo
- Le proteine del citoscheletro batterico regolano funzioni cellulari vitali come la divisione e il frazionamento del DNA.
- L'identificazione di composti che influenzano queste proteine potrebbe portare allo sviluppo di nuovi antibiotici.
- Questo studio utilizza l'organismo modello Schizosaccharomyces pombe per creare un ambiente favorevole alla polimerizzazione proteica.
Metodi Utilizzati
- Saggio basato su cellule di lievito fissionale
- Utilizzo di cellule di Schizosaccharomyces pombe
- Microscopia a fluorescenza per l'acquisizione di immagini
Risultati principali
- I proteine FtsZ-GFP e MreB-GFP sono state visualizzate con successo nel lievito fissionante.
- Il PC190723 ha migliorato in modo significativo la polimerizzazione di FtsZ-GFP, mentre l'A22 non ha avuto alcun effetto.
- MreB-GFP ha formato array lineari nel lievito, indicando l'incorporazione riuscita di proteine citoscheletriche batteriche.
Conclusioni
- Lo studio chiarisce la dinamica della polimerizzazione delle proteine del citoscheletro batterico in un sistema eucariotico.
- I risultati potrebbero contribuire allo sviluppo di composti mirati al citoscheletro batterico per strategie antibiotiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La ricerca e sviluppo (R&D) antibatterica nella fase di scoperta affronta difficoltà nella validazione degli obiettivi e nella riduzione precoce dei rischi associati agli inibitori delle proteine del citoscheletro. La piattaforma basata sul lievito della fissione consente la visualizzazione diretta della polimerizzazione delle proteine citoscheletriche batteriche e il triage rapido di composti per efficacia e tossicità nei confronti delle cellule eucariotiche. Questo approccio favorisce una maggiore affidabilità predittiva nel passaggio da "hit" a "lead" e semplifica le decisioni di avanzamento del portafoglio per nuovi candidati antibatterici.
Applicazioni Strategiche nella Biotecnologia Farmaceutica R&D
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Permette l'analisi funzionale di FtsZ e MreB come bersagli antibatterici in un contesto eucariotico.
- Supporta la riduzione del rischio biologico distinguendo modulatori diretti del citoscheletro da agenti tossici fuori bersaglio.
- Facilita il triage rapido di librerie di composti per l'interazione con il bersaglio e la selettività.
- Migliora la previsione dell'affidabilità per avanzare i composti attivi verso flussi di lavoro di validazione successivi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Fornisce un formato di saggio scalabile basato sulla microscopia, compatibile con lo screening in piastre a 96 pozzetti.
- Offre letture quantitative e visive dello stato di polimerizzazione per un'identificazione affidabile dei risultati positivi.
- Consente la standardizzazione e la riproducibilità tra diversi screening di composti e bersagli proteici.
- Riduce l'intensità di risorse rispetto ai saggi biochimici multi-step o puramente biochimici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la fase iniziale di screening agli obiettivi traslazionali riducendo al minimo il rischio di tossicità nei confronti delle cellule eucariotiche.
- Permette una continuità dallo stadio di scoperta fino alla validazione preclinica per gli antibatterici che agiscono sul citoscheletro.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica per la priorizzazione dei composti di riferimento basata sull'interazione diretta con il bersaglio.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa piattaforma si integra nella fase iniziale della scoperta e nella transizione da hit a lead, collegando la validazione del bersaglio, lo screening e la selezione del candidato preclinico per programmi antibatterici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo alla funzione e alla farmacabilità delle proteine del citoscheletro in un ospite eucariotico.
- Screening: Fornisce output di imaging riproducibili e quantitativi per il triage dei composti e la standardizzazione dei saggi.
- Analisi: Permette il confronto diretto dei fenotipi di polimerizzazione e degli effetti dei composti in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Riduce al minimo la progressione di composti con tossicità verso eucarioti, favorendo la continuità traslazionale.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile ad ulteriori bersagli citoscheletrici batterici e ospiti di espressione per un'ampia applicazione su portafoglio.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio antibatterico.
- Valore operativo: Ottimizza i flussi di lavoro di screening mediante saggi di imaging scalabili e standardizzati.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e un avanzamento capitalisticamente efficiente dei composti antibatterici promettenti.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce una priorizzazione adeguata al rischio e riduce l'abbandono in fasi avanzate a causa di tossicità fuori bersaglio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in genetica dei lieviti, microscopia a fluorescenza e analisi delle immagini.
- Necessita dell'accesso a sistemi automatizzati per la manipolazione di piastre a 96 pozzetti e a infrastrutture per l'imaging ad alto contenuto.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le condizioni del saggio e i parametri di acquisizione delle immagini.
- Adattabile ad altre proteine citoscheletriche batteriche che polimerizzano in ospiti eucariotici.
- Limitato a bersagli e composti compatibili con l'espressione nei lieviti e con letture basate sull'imaging.
