Name: Iniezione intracamerale nei ratti con basso rischio di effetti avversi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Impara la tecnica di iniezione intracamerale nei ratti utilizzando un'incisione corneale centrale a tunnel lungo. Questo metodo garantisce consegna precisa di composti nella camera anteriore con basso rischio di danni tissutali.

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Gli esperimenti nel protocollo sono stati approvati dal Comitato Nazionale per i Permessi - per la scienza animale e sono conformi alla Dichiarazione ARVO sull'uso degli animali nella ricerca oftalmica e visiva. Per il presente studio sono state utilizzate femmine di ratti Sprague-Dawley, di età compresa tra 8 e 10 settimane, che sono state esposte a cicli luce-buio di 12/12 ore. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).
1. Preparazione degli animali
<ol><li>Preparare una miscela anestetica di ketamina (80 mg/kg di peso corporeo in 0,8 ml) e xilazina (4 mg/kg di peso corporeo in 0,2 ml) e iniettarla per via intraperitoneale in una singola iniezione per anestetizzare i ratti.</li>
	<li>Iniettare l'analgesico buprenorfina (0,03 mg/kg) per via intraperitoneale in un'unica iniezione.</li>
	<li>Applicare l'anestetico oftalmico topico allo 0,4% di ossibuprocaina su entrambi gli occhi.</li>
</ol>2. Creazione di un tunnel corneale autosigillante
<ol><li>Stabilizzare l'occhio tenendo la sclera superiore sulla linea mediana verticale vicino alla giunzione corneosclerale con una pinza oftalmica chirurgica.</li>
	<li>Sotto un microscopio operatorio, posizionare una lama a spillo sterile da 0,8 mm e 31 G nella regione corneale paracentrale nella linea mediana verticale (sopra il centro della pupilla) in posizione piatta con un angolo il più vicino possibile all'orizzontale (Figura 2).</li>
	<li>In questa posizione, pungere la cornea per praticare un'incisione e creare un lungo tunnel (2-3 mm) fino a quando non penetra nella zona centrale della camera anteriore. Evitare di toccare l'obiettivo (Figura 2). NOTA: Un tunnel riuscito non indurrà la fuoriuscita dell'umore acqueo e l'abbassamento della camera anteriore.</li>
	<li>Applicare topicamente lo 0,3% di loxacina e lo 0,1% di desametasone sull'occhio iniettato.</li>
	<li>Esaminare al microscopio a fessura come segue.<ol><li>Osservare la profondità della camera anteriore dell'occhio iniettato rispetto all'occhio non iniettato. NOTA: La profondità dovrebbe essere simile.</li>
		<li>Osservare il cristallino dell'occhio iniettato rispetto all'occhio non iniettato. NOTA: L'obiettivo deve essere trasparente. L'opacità può riflettere il danno alla lente durante la procedura chirurgica.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Diagramma di chirurgia oculare che mostra l'incisione della cornea; lente etichettata, camera anteriore, lama medica." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Rappresentazione schematica della lama e dell'angolo e della posizione dell'incisione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
3. Opzione 1: iniezione intracamerale di blu di tripano per valutare il successo dell'iniezione nella camera anteriore
<ol><li>Caricare 5 μL di blu di tripano in una siringa Hamilton di vetro sterile da 10 μL con un ago smussato da 34 G. NOTA: L'iniezione di blu di tripano è descritta come un mezzo per valutare il successo dell'iniezione durante le fasi di calibrazione o configurazione del modello. Nelle impostazioni sperimentali, la siringa può essere caricata con una soluzione del composto scelto.</li>
	<li>Inserire l'ago della siringa caricato attraverso il tunnel creato nella sezione 2 nella camera anteriore.</li>
	<li>Iniettare e tenere l'ago in posizione dopo l'iniezione per 2-3 secondi fino a quando tutto il liquido non viene eliminato.</li>
	<li>Rimuovere l'ago estraendolo delicatamente e lentamente per evitare perdite dal tunnel corneale.</li>
	<li>Esaminare al microscopio a fessura. Valutare la profondità della camera anteriore per escludere l'abbassamento e verificare la presenza di blu di tripano nella camera anteriore.</li>
	<li>Ripetere l'esame della fessura dopo 24 ore, 48 ore e 72 ore.</li>
</ol>4. Opzione 2: iniezione intracamerale di Hoechst per valutare la biodisponibilità del materiale iniettato nello strato di cellule endoteliali
<ol><li>Caricare 5 μl di Hoechst in una siringa Hamilton sterile in vetro da 10 μl con un ago smussato da 34 g. NOTA: L'iniezione di Hoechst è descritta come un mezzo per valutare la biodisponibilità del materiale iniettato mediante assorbimento nello strato di cellule endoteliali ed è utile durante le fasi di calibrazione o configurazione del modello. Nelle impostazioni sperimentali, la siringa può essere caricata con una soluzione del composto scelto.</li>
	<li>Inserire l'ago della siringa caricato attraverso il tunnel creato nella sezione 2 nella camera anteriore.</li>
	<li>Iniettare e tenere l'ago in posizione dopo l'iniezione per 2-3 secondi fino a quando tutto il liquido non viene eliminato.</li>
	<li>Rimuovere l'ago estraendolo delicatamente e lentamente per evitare perdite dall'incisione del tunnel corneale.</li>
	<li>Circa 15-20 minuti dopo l'iniezione, sopprimere i ratti mediante iniezione intraperitoneale di 500 mg/kg di pentobarbitone sodico.</li>
	<li>Enucleare entrambi gli occhi e isolare le cornee. Raccogliere la cornea non iniettata come controllo.</li>
	<li>Colorare entrambe le cornee con lo 0,5% di rosso alizarina S secondo le istruzioni del produttore per identificare le cellule endoteliali.</li>
	<li>Esaminare al microscopio ottico per visualizzare la colorazione con rosso alizarina delle cellule endoteliali e al microscopio a fluorescenza per osservare la colorazione di Hoechst, rispetto alla cornea non iniettata come controllo.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Tecnica di iniezione intracamerale di ratto ottimizzata per ridurre il danno tissutale

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</ol>

La biodisponibilità dei composti somministrati per via topica sulla superficie dell'occhio è notevolmente limitata, in genere &lt;5%1. I composti somministrati sotto forma di collirio vengono eliminati principalmente attraverso il drenaggio, la lacrimazione indotta, il ricambio del liquido lacrimale e l'assorbimento congiuntivale. Inoltre, la permeazione dei composti attraverso la superficie oculare è fortemente limitata dalla barriera cornea-congiuntiva 1,2,3. La cornea è composta da tre strati principali: l'epitelio più esterno, lo stroma intermedio e l'endotelio più interno. L'epitelio corneale superficiale è interconnesso da giunzioni forti e strette e crea un'elevata resistenza paracellulare, che è la principale barriera alla permeabilità della sostanza. Strati multipli di epitelio limitano ulteriormente la permeazione di molecole idrofile e di grandi dimensioni attraverso gli spazi intercellulari dell'epitelio corneale. Succedendo all'epitelio, lo stroma è composto da fibre di collagene e contiene pori acquosi. A differenza dell'epitelio corneale, lo stroma consente il movimento dei farmaci idrofili; Tuttavia, è molto impermeabile ai composti lipofili 1,2,3. Insieme, l'epitelio corneale e gli strati stromali presentano importanti barriere tissutali che limitano l'assorbimento dei farmaci. L'endotelio corneale non è considerato in grado di limitare il trasporto del farmaco.
Un'alternativa alla via di consegna corneale è la via congiuntivale. La congiuntiva è uno strato multiepitelio che copre il lato interno delle palpebre e la parte anteriore della sclera. La congiuntiva è caratterizzata da un minor numero di giunzioni strette rispetto all'epitelio corneale, consentendo una migliore permeabilità dei farmaci idrofili. Tuttavia, la vascolarizzazione della congiuntiva provoca l'assorbimento sistemico di una grande frazione delle molecole somministrate, limitando ancora una volta notevolmente la biodisponibilità dei composti veicolati nella camera anteriore 1,2. Un modo efficiente per aggirare le barriere esterne di permeabilità oculare consiste nel somministrare il farmaco direttamente nella regione di interesse. Ad esempio, l'iniezione intravitreale è comune per la somministrazione nell'umor vitreo4. Allo stesso modo, l'iniezione intracamerale viene utilizzata per la consegna nella camera anteriore5. Stabilire una concentrazione efficiente nella camera anteriore è fondamentale per varie situazioni cliniche, come il trattamento dell'infezione mediante iniezione intracamerale di antibiotici e i trattamenti antinfiammatori postoperatori negli interventi di cataratta. Nonostante il vantaggio di una migliore biodisponibilità della sostanza garantito dall'iniezione intracamerale, ci sono importanti problemi di sicurezza che dovrebbero essere considerati. Ad esempio, l'iniezione intracamerale di farmaci può indurre un aumento della pressione intraoculare, la sindrome del segmento anteriore tossico e la sindrome tossica da distruzione delle cellule endoteliali 5,6. È quindi essenziale valutare attentamente negli studi preclinici l'efficacia e la sicurezza dei farmaci somministrati mediante iniezioni intracamerali per massimizzare l'efficienza del trattamento e ridurre al minimo i potenziali effetti avversi nei pazienti.
I modelli animali sperimentali sono indispensabili negli studi preclinici per studiare nuovi trattamenti. I piccoli roditori, come topi e ratti, sono gli animali da laboratorio più comunemente utilizzati per tali scopi. Questi animali mostrano numerose somiglianze con l'anatomia e la fisiologia umana, fornendo preziose intuizioni. Inoltre, il loro uso è economicamente vantaggioso a causa delle loro piccole dimensioni, facilità di manutenzione, gestazione rapida e capacità di produrre un gran numero di prole7.
Nonostante l'uso diffuso di piccoli roditori nei modelli di malattie oculari, le loro dimensioni oculari e l'anatomia uniche pongono sfide significative durante le manipolazioni sperimentali. Ad esempio, procedure come le iniezioni intracamerali, che sono relativamente semplici negli esseri umani, diventano tecnicamente impegnative nei topi e nei ratti. Le sfide derivano da fattori quali il piccolo volume di umore acqueo, la lente relativamente grande e inflessibile e il posizionamento e la curvatura ostruttivi della lente all'interno degli occhi dei roditori (Figura 1)8. Queste sfide aumentano il rischio di danni durante le iniezioni intracamerali nei roditori, portando a potenziali effetti avversi e introducendo variabilità sperimentale che può influire sulla validità delle conclusioni dello studio. Nella nostra ricerca, abbiamo sviluppato con successo una procedura per l'iniezione intracamerale sicura nei ratti. La tecnica prevede la creazione di un tunnel lungo, piatto e autosigillante nella cornea nella camera anteriore. Questo metodo non solo garantisce la precisione, ma migliora anche la riproducibilità sperimentale, affrontando i problemi associati alle tecniche di iniezione nei piccoli roditori.
<img alt="Diagramma anatomico dell'occhio di ratto vs occhio umano; Confronto iride, pupilla, cristallino, cornea, camera anteriore." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Rappresentazione schematica delle caratteristiche anatomiche del segmento anteriore degli occhi di ratto e umani. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Rosso di alizarina</td><td>Alpha Aesar</td><td>042040.5</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina&nbsp;</td><td>Richter pharma</td><td>102047</td><td></td></tr><tr><td>desametasone 0,1%</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>393102-0413</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton siringa in vetro 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Hamilton Co.</td><td></td><td></td>721711</tr><tr><td>Hoeschst</td><td>Merck</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Bremer pharma GMBH (medimarket)</td><td>17889</td><td></td></tr><tr><td>Ofloxacina 0,3% collirio</td><td>Allergan</td><td>E92170</td><td></td></tr><tr><td>Ossibuprocaina cloridrato 0,4%&nbsp;</td><td>Fisher Pharmaceutical</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital sodico 200 mg/mL</td><td>CTS</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fessura&nbsp;</td><td>Haag-streit bern</td><td>b-90019115</td><td></td></tr><tr><td>Sprague-Dawley Rats</td><td>Envigo</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lama a spillo 31 G 0,8 mm&nbsp;</td><td>Tecfen medical (skymed)</td><td>QKN2808</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>Zeiss</td><td>OPMI-6 CFC</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sartorius</td><td>03-102-1B</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Eurovet Animal Health&nbsp;</td><td></td><td></td>615648</tr></tbody></table>

iniezione intracamerale nei ratti con basso rischio di effetti avversi

Intracameral Injection in Rats with Low Risk of Adverse Effects

Ai ratti Sprague Dawley sono stati iniettati intracameralmente 5 μL di blu di tripano secondo il protocollo sopra descritto. L'esame con lampada a fessura subito dopo l'iniezione ha dimostrato che la camera era colorata con blu tripano, indicando che il materiale iniettato ha raggiunto la camera anteriore (Figura 3). Inoltre, la profondità della camera anteriore era intatta, suggerendo che l'iniezione non ha causato perdite di umore acqueo e superficialità della camera.
<img alt="Immagine al microscopio di un occhio di ratto per la ricerca oftalmologica, evidenziando l'analisi della struttura corneale." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Camera anteriore intatta dopo l'iniezione intracamerale. Il blu di tripano è stato iniettato nella camera anteriore del ratto. L'esame al microscopio a fessura dimostra la presenza di blu di tripano senza perdite o superficialità della camera anteriore. Barra della scala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Successivamente, è stato iniettato Hoechst, un colorante fluorescente permeabile alle cellule che lega il DNA e colora i nuclei cellulari, per valutare la biodisponibilità dei farmaci somministrati dalla via di iniezione intracamerale descritta. L'assorbimento di Hoechst da parte delle cellule endoteliali è stato valutato 15 minuti dopo l'iniezione isolando le cornee e osservando al microscopio a fluorescenza. Per identificare le cellule endoteliali, le cornee sono state colorate con Alizarin Red S, che colora i bordi intercellulari dello strato cellulare dell'endotelio.  Come controllo, abbiamo esaminato l'occhio non iniettato dallo stesso ratto. I nostri risultati dimostrano che lo strato di cellule endoteliali era intatto dopo l'iniezione, sostenendo che la procedura descritta non causa danni all'endotelio. Inoltre, le cellule endoteliali erano positive per la colorazione nucleare di Hoechst, dimostrando l'assorbimento dell'Hoechst iniettato dopo l'iniezione intracamerale (Figura 4).
<img alt="Microscopia cellulare colorata: Alizarina Rossa, Hoechst, fusione; processo di imaging; risultati della microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66662/66662fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Biodisponibilità del materiale iniettato per via intracamerale nello strato di cellule endoteliali. Hoechst è stato iniettato nella camera anteriore del ratto. La cornea è stata isolata 15 minuti dopo l'iniezione, colorata con Alizarin Red S per osservare le cellule endoteliali e sottoposta a imaging al microscopio fluorescente per osservare la colorazione di Hoechst. Le immagini sovrapposte mostrano la colorazione nucleare di Hoechst nelle cellule endoteliali corneali. Barre di scala = 50 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66662/66662fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Iniezione intracamerale nei ratti con basso rischio di effetti avversi

Intracameral injection is a standard administration routine in ophthalmology. The application of intracameral injection in rodents for research is ...

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