Name: Generazione e verifica funzionale di cellule T del recettore dellantigene chimerico sensibili allipossia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Scopri come generare cellule CAR-T sensibili all'ipossia mediante lentivirus e verificarne la citotossicità selettiva contro i tumori solidi. Questo protocollo migliora la sicurezza e l'efficacia dell'immunoterapia antitumorale.

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In questo studio, HER2-BBz-ODD, un CAR sensibile all'ipossia che ha come bersaglio HER2 (ID gene: 2064) è stato confrontato con la sua controparte regolare, HER2-BBz. Gli schemi dei due CAR sono illustrati nella Figura 1A, che mostra che HER2-BBz-ODD è derivato da HER2-BBz aggiungendo la sequenza ODD al C-terminale di CD3ξ. La costruzione di vettori lentivirali che esprimono i due CAR e la generazione del lentivirus corrispondente mediante trasfezione cellulare 293T è stata precedentemente descritta31.
1. Generazione di cellule CAR-T sensibili all'ipossia mediante infezione lentivirale
<ol><li>Scongelare rapidamente le cellule mononucleate del sangue periferico umano crioconservate (PBMC) a 37 °C in un bagno d'acqua. Trasferire le PBMC scongelate in una provetta da 15 mL contenente 9 mL di terreno di coltura linfocitaria privo di siero integrato con 400 UI di IL-2, 5 ng/mL di IL-7 e 10 ng/mL di IL-15 (terreno di crescita delle cellule T umane, di seguito denominato TGM ).</li>
	<li>Dopo aver prelevato un'aliquota per il conteggio delle cellule, centrifugare la provetta a 300 × g per 5 minuti. Risospendere le PBMC pellettate con TGM a una densità di 4 × 106 cellule/mL e trasferire la sospensione in una piastra a 6 pozzetti.</li>
	<li>Preparare immunosfere rivestite con anti-hCD3/hCD28.<ol><li>Trasferire 100 μL di microsfere magnetiche di topo IgG in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e lavarle 2 volte utilizzando un supporto magnetico con PBS.</li>
		<li>Risospendere le perle in 100 μL di PBS e aggiungere 0,2 μg di anticorpo CD3 umano di topo e 2 μg di anticorpo CD28 anti-umano di topo. Mescolare delicatamente il composto con una pipetta e agitare per una notte a 4 °C.</li>
		<li>Lavare le perle 2 volte utilizzando un supporto magnetico con PBS e risospenderle in 100 μL di PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Aggiungere immunosfere rivestite con anti-hCD3/hCD28 alla piastra al passaggio 1.2 con un rapporto perlina/cellula di 1:1. Porre la piastra in un'incubatrice umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C.</li>
	<li>Dopo 48 ore di incubazione, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL dopo aver mescolato delicatamente le cellule con una pipetta. Posizionare la provetta su un supporto magnetico per 3 minuti, quindi trasferire con cura il surnatante in una nuova provetta da 15 ml per rimuovere le immunosfere dalle PBMC.</li>
	<li>Prelevare un'aliquota per il conteggio delle cellule, quindi seminare le PBMC a 5 × 105 cellule/pozzetto in 300 μL di TGM in una piastra piana a 48 pozzetti. Aggiungere 200 μL di stock lentivirale nei pozzetti corrispondenti e aggiungere solfato di protamina a una concentrazione finale di 10 μg/mL.</li>
	<li>Centrifugare la piastra a 1.000 × g a 32 °C per 1,5 ore e rimuovere ed eliminare con cura 300 μl di surnatante da ciascun pozzetto utilizzando una pipetta. Quindi, aggiungere 1 mL di TGM fresco utilizzando una pipetta e posizionare la piastra in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 a 37 °C.</li>
	<li>Aggiungere TGM fresco per regolare la densità cellulare a 0,5-2 × 106 cellule/mL ogni 2-3 giorni. Iniziare trasferendo le cellule prima in una piastra a 12 pozzetti e poi in una piastra a 6 pozzetti. Continuare a coltivare le cellule fino a quando il numero totale raggiunge 6 × 106 in un volume di 4 ml. NOTA: Parallelamente, condurre la trasduzione CAR delle cellule T Jurkat seguendo le stesse procedure descritte sopra, tranne per il fatto che la TGM viene sostituita con RPMI1640 terreno contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS).</li>
</ol>2. Valutazione dell'espressione di CAR ossigeno-dipendente in cellule CAR-T mediante citometria a flusso
<ol><li>Piastra delle cellule T trasdotte da CAR dal passaggio 1.8 in due piastre da 12 pozzetti a una densità di 2,5 × 106 cellule/pozzetto in 2 mL di TGM. Posizionare una piastra direttamente in un incubatore umidificato con il 5% di CO2 a 37 °C (condizione normossica, poiché la condizione standard per la coltura di cellule ha il 21% di O2) e posizionare l'altra piastra in una camera mobile dell'incubatore CO2/O2/N2 con il livello di O2 preimpostato all'1% (condizione ipossica) e quindi mantenere la camera in un ambiente umidificato, Incubatore al 5% CO2/94% N2 a 37 °C.</li>
	<li>Ogni 24 ore, raccogliere 5 × 105 cellule dalle piastre in condizioni ipossiche o normossiche in provette da microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare le provette a 500 × g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di PBS mediante pipettaggio. Ripetere il lavaggio PBS ancora una volta.</li>
	<li>Risospendere le cellule pellettate in 50 μl di tampone FACS (PBS integrato con il 2% di FBS) in ciascuna provetta. Aggiungere 50 μl di diluizione 1:100 di anticorpo anti-Flag coniugato con PE (0,2 μg/mL) e miscelare accuratamente mediante pipettaggio. Incubare al buio a temperatura ambiente per 20 min.</li>
	<li>Al termine dell'incubazione, aggiungere 1 mL di tampone FACS a ciascuna provetta. Miscelare accuratamente pipettando, quindi centrifugare a 500 × g per 5 minuti.</li>
	<li>Rimuovere ed eliminare con cautela il surnatante utilizzando una pipetta e ripetere il passaggio 2.4 ancora una volta.</li>
	<li>Rimuovere con cautela ed eliminare il surnatante utilizzando una pipetta. Risospendere le cellule in 200 μl di tampone FACS, quindi trasferire la sospensione cellulare risultante in provette di flusso da 5 mL.</li>
	<li>Eseguire la citometria a flusso sulla sospensione cellulare nella fase 2.6 per determinare l'espressione di CAR di superficie. Includere le cellule T non trasfettate come controllo negativo.<ol><li>Utilizzare i gate FSC/SSC e FSC-A/FSC-H per lo screening di singole celle in tempo reale. Raccogli 1 × 104 eventi singoli dal vivo per ogni campione. Gate le cellule positive per EGFP (un marcatore costitutivo trasportato nel vettore lentivirale come indicatore di cellule T trasdotte con successo) e quindi, le cellule positive per la ficoeritrina (PE) (cellule che esprimono CAR) per misurare la positività all'EP e l'intensità mediana della fluorescenza (MFI).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi della dipendenza dall'ossigeno dell'espressione di CAR in cellule T Jurkat modificate con CAR mediante western blot
<ol><li>Piastre le cellule T Jurkat trasdotte con CAR dalla sezione 1 in due piastre da 48 pozzetti a una densità di 5 × 105 cellule per pozzetto (500 μL di volume di coltura) in RPMI1640 terreno con il 10% di FBS.</li>
	<li>Per una piastra, aggiungere CoCl2 ai pozzetti sperimentali fino a una concentrazione finale di 0 μM, 50 μM o 200 μM. Quindi, posizionare la piastra in un'incubatrice umidificata al 5% di CO2 a 37 °C (condizione normossica). Per l'altra piastra, non aggiungere CoCl2 e posizionarla in una camera mobile dell'incubatrice CO2/O2/N2 con il livello di O2 preimpostato all'1% (condizione ipossica) prima di trasferirla nella stessa incubatrice.</li>
	<li>Dopo 24 ore di incubazione, trasferire le sospensioni cellulari in provette da microcentrifuga da 1,5 mL. Centrifugare le provette a 500 × g per 5 min. Rimuovere completamente ed eliminare i surnatanti utilizzando prima una pipetta da 1 mL, poi una pipetta da 100 μL e risospendere i pellet cellulari in 50 μL di 1 tampone campione SDS-PAGE.</li>
	<li>Riscaldare i campioni in un bagno d'acqua bollente per 10 minuti. Posizionare immediatamente la provetta sul ghiaccio per 30 s, quindi centrifugare a 16.000 × g per 30 s.</li>
	<li>Caricare 30 μl dei campioni chiarificati in ciascuna fessura di un gel SDS PAGE a 10 pozzetti, al 10% con uno spessore di 1,5 mm. Far funzionare il gel a 80 V per 30 minuti, quindi aumentare la tensione a 100 V e far funzionare per 1,5 ore.</li>
	<li>Al termine dell'elettroforesi, trasferire le proteine dal gel a una membrana in PVDF utilizzando il metodo standard di trasferimento a umido, con la corrente e la durata impostate rispettivamente a 400 mA e 1 ora.</li>
	<li>Bloccare la membrana nel tampone bloccante (5% latte (p/v) in PBST (PBS+0,05% Tween-20)) per 1 ora a temperatura ambiente. Quindi, ritagliare il pezzo tra 30 kD e 40 kD per il rilevamento del controllo del carico GAPDH e il pezzo tra 50 kD e 70k D per il rilevamento delle molecole CAR.</li>
	<li>Incubare i pezzi da 30-40 kD e 50-70 kD con un anticorpo anti-GAPDH di topo (diluizione 1:2.000) e un anticorpo anti-Flag di topo (diluizione 1:2.000), rispettivamente, in 3 mL di tampone bloccante a temperatura ambiente per 2 ore o a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>Lavare le membrane con PBST a temperatura ambiente su una piattaforma a bilanciere per 3 x 5 min.</li>
	<li>Incubare le membrane con anticorpo anti-topo di capra coniugato con HRP (diluizione 1:5.000) in 3 mL di tampone bloccante a temperatura ambiente per 1 ora; quindi lavare la membrana con PBST per 5 x 10 min.</li>
	<li>Sviluppare le membrane incubandole con un substrato HRP, quindi visualizzare le bande proteiche rilevate utilizzando un analizzatore di immagini luminescenti.</li>
</ol>4. Valutazione in vitro della dipendenza dall'ossigeno della citotossicità mediata da cellule CAR-T sensibili all'ipossia
<ol><li>Il giorno 0, il seme 1 ×10 4 cellule bersaglio (cellule SKOV3-Luc) per pozzetto sperimentale in 200 μL di DMEM contenente il 10% di FBS in due piastre di coltura tissutale nere a fondo piatto a 96 pozzetti.</li>
	<li>Il giorno 1, rimuovere con cautela 100 μl di surnatante dalla parte superiore di ciascun pozzetto. Aggiungere cellule CAR-T o cellule T non trasdotte con rapporti effettore/bersaglio di 1:1, 2:1 e 4:1 in 100 μL di terreno DMEM contenente il 10% di FBS.</li>
	<li>Porre una piastra in un'atmosfera di 21% O2 e l'altra in un'atmosfera di 1% O2 utilizzando una camera di incubazione mobile di CO2/O2/N2 , come descritto al punto 2.1. NOTA: Se non è disponibile una camera di incubazione mobile per CO2/O2/N2 , è possibile utilizzare l'aggiunta di CoCl2 al terreno di coltura per simulare una condizione di ipossia.</li>
	<li>Il giorno 2, dopo 24 ore di co-coltura, trasferire con cura tutto il surnatante (circa 150-200 μl) in una nuova piastra a 96 pozzetti con fondo a U utilizzando una pipetta. Conservare a -20 °C per la successiva rilevazione delle citochine, seguendo le procedure descritte nel paragrafo 5.</li>
	<li>Aggiungere 60 μl di tampone di lisi passiva 1x a ciascun pozzetto sperimentale delle piastre nere a fondo piatto da 96 pozzetti del passaggio 4.4. Quindi, posizionare le piastre su uno shaker e agitare per 30 minuti per garantire un'efficiente lisi cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 60 μL di substrato di luciferasi di lucciola a ciascun pozzetto sperimentale e misurare immediatamente l'attività della luciferasi utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
	<li>Calcolare la citotossicità normalizzata (%) utilizzando l'equazione (1): Citotossicità normalizzata (%) = 100 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66697/66697eq01.jpg" style="margin: auto;"> ×100 (1)</li>
</ol>5. Rilevamento della secrezione di IL-2 e IFN-γ da parte delle cellule CAR-T sensibili all'ipossia
<ol><li>Il giorno 0, preparare una diluizione 1:250 dell'anticorpo di cattura IL-2 o IFN-γ nel tampone di rivestimento. Aggiungere 100 μl di anticorpo diluito a ciascun pozzetto di una piastra ELISA a 96 pozzetti e incubare la piastra a 4 °C per una notte. NOTA: Il tampone di rivestimento viene prodotto sciogliendo 7,13 g di NaHCO3 e 1,59 g di Na2CO3 in 1 L di acqua distillata e regolando il pH a 9,5.</li>
	<li>Il giorno 1, rimuovere l'anticorpo di cattura non adsorbito capovolgendo energicamente la piastra, quindi lavare i pozzetti 3 volte con 200 μl di tampone di lavaggio (PBS contenente lo 0,05% di Tween 20).</li>
	<li>Aggiungere 200 μl di Diluente per saggi (PBS contenente il 10% di FBS) a ciascun pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 1 ora.</li>
	<li>Scartare la soluzione capovolgendo energicamente la piastra; quindi, lavare i pozzetti 3 volte con 200 μL di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Scongelare i campioni/piastra surnatante congelati dal passaggio 4.4 a temperatura ambiente. Una volta completamente scongelati, diluire i campioni e gli standard con il diluente Assay. Aggiungere 100 μl di campioni o standard diluiti a ciascun pozzetto della piastra ELISA rivestita e incubare a temperatura ambiente per 2 ore. NOTA: Per la rilevazione di IL-2, si raccomanda una diluizione di 10 volte, mentre per la rilevazione di IFN-γ è preferibile una diluizione di 50 volte.</li>
	<li>Rimuovere i campioni e gli standard capovolgendo energicamente la piastra, quindi lavare i pozzetti 5 volte con 200 μL di tampone di lavaggio per pozzetto.</li>
	<li>Preparare una soluzione di rilevazione funzionante diluendo l'anticorpo di rilevazione IL-2 o l'anticorpo di rilevazione IFN-γ/streptavidina-HRP (SAv-HRP) in un rapporto di 1:250 nel diluente del saggio. Aggiungere 100 μl della soluzione di rivelazione di lavoro a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente.</li>
	<li>Scartare la soluzione e lavare i pozzetti 7 volte con 200 μL di tampone di lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere 100 μl di reagente del substrato a ciascun pozzetto e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti al buio.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di soluzione di arresto (1 M H2SO4) a ciascun pozzetto. Leggere immediatamente l'assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Validazione funzionale di cellule CAR-T sensibili all'ipossia per tumori selettivi

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<li>Chen, Y. -J., Abila, B., Mostafa Kamel, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T%3A+What+is+next%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">CAR-T: What is next.</a> Cancers. 15 (3), 663(2023).</li>
<li>Barsan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tisagenlecleucel+utilisation+and+outcomes+across+refractory%2C+first+relapse+and+multiply+relapsed+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+A+retrospective+analysis+of+real-world+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22eClinicalMedicine%22%5BJournal%5D)">Tisagenlecleucel utilisation and outcomes across refractory, first relapse and multiply relapsed B-cell acute lymphoblastic leukemia: A retrospective analysis of real-world patterns.</a> eClinicalMedicine. 65, 102268(2023).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga da 1,5 mL</td><td>QSP</td><td>509-GRD-Q</td><td>Supernatanti e cellule cellection Protocollo Fase 2,3,4</td></tr><tr><td>10% ExpressCast PAGE NCM</td><td>biotech</td><td>P2012</td><td>Immunoblotting Protocollo Fase 3</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>NCM biotech</td><td>20220812</td><td>Coltura cellulare Protocollo Fase 4</td></tr><tr><td>Pipetta da 10 mL</td><td>Yueyibio</td><td>YB-25H</td><td>Pipettaggio Protocollo Fase 1</td></tr><tr><td>10xTRIS-Glicina-SDS tampone per elettroforesi</td><td>Epizima</td><td>3673020</td><td>Immunoblotting Protocollo Fase 3</td></tr><tr><td>15 mL Provetta da centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>339650</td><td>Supernatanti e cellule cellection Protocollo Fase 1</td></tr><tr><td>25 cm2 EasYFlask</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>156367 Coltura cellulare Protocollo Fase 3,4</td></tr><tr><td>4x Proteina SDS PAGE Caricamento Tampone</td><td>Takara</td><td>9173</td><td>Protocollo Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale a fondo piatto a 6 pozzetti</td><td>Protocollo Thermo Scientific</td><td></td><td>140675 T Cells Fase 1</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale nere a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>655090</td><td>Saggio di citotossicità Protocollo Fase 4</td></tr><tr><td>Piastre ELISA a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3590</td><td>Protocollo ELISA Fase 5</td></tr><tr><td>Agitatore per piastre a 96 pozzetti</td><td>QILINBEIER</td><td>MH-2</td><td>Shake Protocollo Fase 4</td></tr><tr><td>Piastre per coltura tissutale con fondo a U a 96 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>268200</td><td>Protocollo cellection Fase 4,5</td></tr><tr><td>anticorpo anti-FLAG</td><td>Protocollo Sigma</td><td>F1804-50UG</td><td>Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>Carbinolo</td><td>Sinopharm</td><td>10010061</td><td>Protocollo Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>Incubatore ad anidride carbonica</td><td>Thermo Scientific</td><td>360</td><td>Protocollo Coltura cellulare Fase 1,2,3,4</td></tr><tr><td>Piastra per il conteggio delle cellule</td><td>Hausser scientific</td><td>1492</td><td>Conteggio delle cellule Protocollo Fase 1,3,4</td></tr><tr><td>Kit IgG per topo CELLection Thermo</td><td>Scientific</td><td>11531D</td><td>Biglie magnetiche per IgG per topo Protocollo Fase 1</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002432</td><td>Coltura cellulare Protocollo Fase 1,3,4</td></tr><tr><td>Sistema di imaging su gel a chemiluminescenza</td><td>BIO-RAD</td><td>12003154</td><td>Immunoblotting Protocollo Fase 3</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di cobalto (0,5 M)</td><td>bioleaper</td><td>BR4000203</td><td>Condizione ipossica Protocollo Fase 2,3,4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-103- Protocollo</td><td>Coltura cellulare CV Fase 4</td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>Protocollo Sartorius</td><td>PRACTUM612<-1CN</td><td>weighbr/> Fase 5</td></tr><tr><td>FBS</td><td>BI</td><td>04-001-1ACS</td><td>Protocollo Coltura cellulare Fase 3,4</td></tr><tr><td>Protocollo GAPDH mAb</td><td>ACclonal</td><td>AC002</td><td>Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>Apparecchio per elettroforesi su gel</td><td>BIO-RAD</td><td>1645070</td><td>Protocollo Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>Lettori di micropiastre GloMax</td><td>Misurazione dell'attività della luciferasi</td><td>Promega</td><td>GM3000</td> Protocollo Fase 4</tr><tr><td>IgG anti-topo di capra (H+L)</td><td>Yeasen</td><td></td><td>P1126151 Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>Centrifuga di microcongelamento ad alta velocità</td><td>eppendorf</td><td>5810&nbsp; Protocollo R</td><td>Cell Culture Fase 1</td></tr><tr><td>IFN umano-&gamma; ELISA Set</td><td>BD</td><td>555142</td><td>Protocollo ELISA Passaggio 5 Elementi: IFN umano ricombinante-&gamma; Standard liofilizzato, rilevamento anticorpo biotina anti-IFN umano-&gamma; , Cattura l'anticorpo purificato Anti-Human IFN-&gamma;, Reagente enzimatico Coniugato streptavidina-perossidasi di rafano (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>Umano IL-2 ELISA Set</td><td>BD</td><td>555190</td><td>Protocollo ELISA Passaggio 5 Articoli: Standard liofilizzato umano ricombinante, Anticorpo di rilevamento Biotina Anti-IL-2 umana, Anticorpo di cattura purificato Anti-IL-2, Reagente enzimatico Coniugato streptavidina-perossidasi di rafano (SAv-HRP)</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>R& Sistemi D</td> Coltura di cellule <td>T P40933</td><td>Protocollo Fase 1</td></tr><tr><td>IL-21</td><td>Novoprotein</td><td>GMP-CC45</td><td>Coltura di cellule T Protocollo Fase 1</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>R& Sistemi D</td><td>P13232</td><td>Coltura di cellule T Protocollo Fase 1</td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td>Coltura cellulare Protocollo Fase 1,3,4</td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>CAR-Jurkat construction Protocollo Fase 3</td></tr><tr><td>LSRFortessa</td><td>BD</td><td>LSRFortessa</td><td>Protocollo Citometria a flusso Fase 2</td></tr><tr><td>Sistema</td> <td>di analisi della luciferasiPromega</td><td>E1501</td><td>luciferase reporter assay Protocollo Fase 4 Articoli: Tampone di lisi passivo, substrato di luciferasi lucciola</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Protocollo BioTek</td><td>HTX</td><td>ELISA Fase 5</td></tr><tr><td>CO2/O2/N2 Camera dell'incubatore</td><td>China Innovation Instrument Co., Ltd.</td><td>Smartor118</td><td>Condizione ipossica Protocollo Passaggio 2, 3, 4</td></tr><tr><td>Tag anti-esadecima per mouse Istidina</td><td>Sigma</td><td>SAB2702218</td><td>Protocollo Immunoblotting Passaggio 3</td></tr><tr><td>Tampone di trasferimento rapido NcmBlot</td><td>NCM biotech</td><td>WB4600</td><td>Immunoblotting</td></tr><tr><td>NcmECL Ultra</td><td>NCM biotech</td><td>P10300</td><td>Protocollo Immunoblotting Passaggio 3 Articoli: Reagente NcmECL Ultra Luminol/Enhancer (A), Reagente NcmECL Ultra Stabilizzato Perossido (B)&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre piane a 48 pozzetti rivestite di NovoNectina</td> Costruzione di cellule CAR-T <td>Novoprotein</td><td>GMP-CH38</td><td>Protocollo Fase 1</td></tr><tr><td>Set di compresse OPD (o-fenilendiammina dicloridrato)</td><td>Sigma</td><td>P9187</td><td>Reagente substrato Protocollo Fase 5 Articoli: Compressa OPD (lamina d'argento), compressa di perossido di idrogeno urea (lamina d'oro)</td></tr><tr><td>PE-coniugato anti-DYKDDDDK</td><td>Biolegend</td><td>637310</td><td>Protocollo Citometria a flusso Fase 2</td></tr><tr><td>Protamina solfato</td><td>Sigma</td><td>P3369-1OG</td><td>Protocollo Lentivirus Infezione Fase 1</td></tr><tr><td>Marcatore proteico 10 Kda-250 KDa</td><td>Epizima</td><td>WJ102</td><td>Immunoblotting Protocollo Fase 3</td></tr><tr><td>&nbsp; Protocollo T 566685 Cellule T anti-umane CD3</td><td>BD</td><td></td> di <td>topo purificato Fase 1 Protocollo T ><555725</td></tr> di <tr><td>topo NA/LE purificato</td> Fase 1 Protocollo T CD28 <td>BD</td><td></td><td>Di Chirurgia Molecolare T Fase 1</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Protocollo Millipore</td><td>168627</td><td>Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>Protocollo RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CVRC</td><td>Coltura cellulare Fase 3</td></tr><tr><td>Latte scremato in polvere</td><td>Yeasen</td><td>S9129060</td><td>Protocollo Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>SKOV3-Luc</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Saggio di citotossicità Protocollo Fase 4</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>NCM biotech</td><td>C125C1</td><td>Coltura cellulare Protocollo Fase 4</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sinopharm</td><td>30189328</td><td>Protocollo Immunoblotting Fase 3</td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>keelrein</td><td>NB014467</td><td>Riscaldamento Protocollo Passaggio 1</td></tr><tr><td>X-VIVO 15&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td>Terreno di coltura di linfociti senza siero Protocollo Fase 1</td></tr></tbody></table>

generazione e verifica funzionale di cellule t del recettore dell'antigene chimerico sensibili all'ipossia

Generation and Functional Verification of Hypoxia-Sensitive Chimeric Antigen Receptor-T Cells

La fusione del dominio ODD di HIF-1α con la porzione CAR rappresenta una strategia primaria per generare un CAR sensibile all'ipossia. Il CAR bersaglio di HER2 sensibile all'ipossia analizzato in questo studio, denominato HER2-BBz-ODD, è stato costruito utilizzando questa strategia integrando la sequenza ODD nel suo HER2-BBz convenzionale (Figura 1A). In questo studio, abbiamo utilizzato la trasduzione lentivirale per esprimere HER2-BBz-ODD CAR o HER2-BBz CAR e successivamente abbiamo esaminato la loro sensibilità all'ossigeno in due tipi di cellule: PBMC umane e cellule T Jurkat.
Il primo esame è l'espressione di CAR in condizioni di ipossia rispetto a condizioni normossiche, che è stato condotto sia in cellule T derivate da PBMC trasdotte con CAR mediante citometria a flusso che in cellule T Jurkat trasdotte con CAR mediante western blotting. Nel contesto delle cellule T derivate da PBMC trasdotte con CAR, abbiamo osservato che HER2-BBz-ODD CAR aveva un'espressione significativamente più alta inferiore all'1% O2 rispetto al 21% O2 in termini sia di percentuale di cellule CAR-positive che di intensità mediana di fluorescenza (MFI) (Figura 1B). L'analisi di immunoblotting delle cellule T Jurkat trasdotte con CAR ha anche confermato l'induzione ipossia-dipendente di HER2-BBz-ODD.
Vale la pena notare che, in questo contesto, la condizione ipossica può essere convenientemente imitata aggiungendo CoCl2, un induttore chimico dell'ipossia, al terreno di coltura. Come illustrato nella Figura 1C, i risultati dell'immunoblotting hanno dimostrato che l'esposizione a 50 o 200 μM di CoCl2 ricapitola l'effetto dell'esposizione all'1% di O2, inducendo marcatamente l'espressione di HER2-BBz-ODD CAR ma non quella di HER2-BBz CAR. La caratterizzazione funzionale delle CAR sensibili all'ipossia è stata condotta con cellule CAR-T derivate da PBMC. Nello studio, come linea cellulare bersaglio è stata utilizzata una linea cellulare SKOV-3 che trasporta la luciferasi della lucciola. Questa configurazione ci ha permesso di misurare l'attività della luciferasi associata alle cellule bersaglio come proxy per valutare la citotossicità mediata da cellule CAR-T co-coltivate.
Come mostrato nella Figura 1D, le misurazioni hanno indicato che le cellule CAR-T HER2-BBz uccidono efficacemente le cellule bersaglio, indipendentemente dal fatto che l'atmosfera fosse normossica o ipossica. Al contrario, le cellule CAR-T HER2-BBz-ODD hanno mostrato una citotossicità significativamente più debole in condizioni normossiche per tutti e tre i rapporti E:T esaminati. Tuttavia, la loro citotossicità è risultata significativamente aumentata se esposti a condizioni di ipossia. Anche i livelli di surnatante di IL-2 e IFN-γ sono stati misurati mediante ELISA dopo aver co-coltivato cellule CAR-T con cellule bersaglio per 24 ore. Per entrambe le citochine, è stata osservata una secrezione più elevata inferiore all'1% di O2 rispetto al 21% di O2 per le cellule CAR-T HER2-BBz-ODD, il che è coerente con i dati di citotossicità. Al contrario, le cellule CAR-T HER2-BBz hanno mostrato una secrezione inferiore delle due citochine inferiore all'1% di O2 rispetto al 21% di O2, indicando un impatto avverso dell'ipossia sull'attività cellulare (Figura 1E). Nel loro insieme, questi risultati hanno convalidato in modo convincente la natura sensibile all'ipossia di HER2-BBz-ODD CAR.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66697/66697fig01.jpg"> Figura 1: Costruzione e caratterizzazione di cellule CAR-T sensibili all'ipossia. (A) Rappresentazione schematica dei disegni di un CAR sensibile all'ipossia, HER2-BBz-ODD, e della sua controparte convenzionale, HER2-BBz. Entrambe le CAR sono costituite da un peptide segnale CD8α N-terminale, un tag FLAG, un scFv umano mirato a HER2, una cerniera CD8 e un dominio transmembrana e una porzione intracellulare composta da un dominio costimolatorio da 4-1BB, un dominio di segnalazione CD3ξ, un IRES e un EGFP. HER2-BBz-ODD differisce da HER2-BBz per la fusione di un dominio ODD con il C-terminale del dominio di segnalazione CD3ξ, consentendo la sua espressione ipossico-dipendente promuovendo la sua degradazione ubiquitina-dipendente in condizioni normossiche. (B,C) Valutazioni dell'espressione ossigeno-dipendente di HER2-BBz-ODD CAR. (B) Una valutazione è stata eseguita con cellule CAR-T umane derivate da PBMC dopo aver coltivato meno dell'1% o del 21% di O2 per 24, 48 o 72 ore utilizzando la citometria a flusso. (C) L'altra valutazione è stata effettuata con le cellule T Jurkat trasdotte con CAR, in cui i lisati cellulari sono stati raccolti 24 ore dopo la coltura con meno del 21% di O2, 50 o 200 μM di CoCl2, o dell'1% di O2 e analizzati per l'espressione di CAR utilizzando il western blotting, con cellule trasdotte da CAR HER2-BBz incluse come controllo. (D,E) Citotossicità in vitro e secrezione di citochine di cellule CAR-T in diverse condizioni di ossigeno. (D) Le cellule CAR-T sono state co-coltivate con cellule SKOV3 che esprimono luciferasi di lucciola con rapporti E:T indicati inferiori all'1% o al 21% di O2. Dopo 24 ore di co-coltura, l'efficienza di uccisione delle cellule bersaglio è stata determinata misurando la variazione dell'attività della luciferasi della lucciola associata alla cellula rispetto a quella delle cellule T non trasdotte. (E) I surnatanti sono stati raccolti per la rilevazione di IL-2 secreti e IFN-γ. I risultati vengono visualizzati come media ± SEM (n = 3 donatori sani) (****p &lt; 0,0001). Abbreviazioni: scFv = variabile frammento a catena singola; CAR = recettore chimerico dell'antigene. I pannelli C e D sono adattati da Liao et al.31. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66697/66697fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Generazione e verifica funzionale di cellule T del recettore dell'antigene chimerico sensibili all'ipossia

Extensive studies have proven the promise of chimeric antigen receptor T (CAR-T) cell therapy in treating hematological malignancies. However, treating ...

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Generazione e verifica funzionale di cellule T del recettore dell'antigene chimerico sensibili all'ipossia

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