Name: Diagnostica point-of-care basata su CRISPR con reagenti premiscelati e liofilizzati (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-16T12:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Impara a sviluppare test diagnostici point-of-care con reagenti liofilizzati premiscelati per l'amplificazione isotermica e il rilevamento CRISPR. Questo metodo riduce i rischi di contaminazione e migliora la sensibilità nella diagnosi delle malattie infettive.

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<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo di diagnostica molecolare ottimizzato basato su CRISPR per l'uso point-of-care

<ol><li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+detection+with+CRISPR-Cas13a%2FC2c2%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2.</a> Science. 356 (6336), 438-442 (2017).</li>
<li>Kaminski, M. M., Abudayyeh, O. O., Gootenberg, J. S., Zhang, F., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics.</a> Nat Biomed Eng. 5 (7), 643-656 (2021).</li>
<li>Makarova, K. S., Koonin, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annotation+and+classification+of+CRISPR-Cas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Annotation and classification of CRISPR-Cas systems.</a> Methods Mol Biol. (1311), 47-75 (2015).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12a+target+binding+unleashes+indiscriminate+single-stranded+DNase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity.</a> Science. 360 (6387), 436-439 (2018).</li>
<li>Arizti-Sanz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+Cas13-based+assays+for+the+fast+identification+of+SARS-CoV-2+and+its+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Simplified Cas13-based assays for the fast identification of SARS-CoV-2 and its variants.</a> Nat Biomed Eng. 6 (8), 932-943 (2022).</li>
<li>Broughton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas12-based+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2.</a> Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplexed+Cas13-based+assay+with+point-of-care+attributes+for+simultaneous+COVID-19+diagnosis+and+variant+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+J%22%5BJournal%5D)">A multiplexed Cas13-based assay with point-of-care attributes for simultaneous COVID-19 diagnosis and variant surveillance.</a> CRISPR J. 6 (2), 99-115 (2023).</li>
<li>Patchsung, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+validation+of+a+Cas13-based+assay+for+the+detection+of+SARS-CoV-2+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Clinical validation of a Cas13-based assay for the detection of SARS-CoV-2 RNA.</a> Nat Biomed Eng. 4 (12), 1140-1149 (2020).</li>
<li>Gootenberg, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+and+portable+nucleic+acid+detection+platform+with+Cas13%2C+Cas12a%2C+and+Csm6%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6.</a> Science. 360 (6387), 439-444 (2018).</li>
<li>Lee, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+CRISPR-based+diagnostic+for+field-applicable+detection+of+Plasmodium+species+in+symptomatic+and+asymptomatic+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive CRISPR-based diagnostic for field-applicable detection of Plasmodium species in symptomatic and asymptomatic malaria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (41), 25722-25731 (2020).</li>
<li>Myhrvold, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-deployable+viral+diagnostics+using+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13.</a> Science. 360 (6387), 444-448 (2018).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+detection+with+CRISPR%2FCas+system+from+applications+to+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Analyt+Chem%22%5BJournal%5D)">Versatile detection with CRISPR/Cas system from applications to challenges.</a> Trends Analyt Chem. 135, 116150(2021).</li>
<li>Yao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13a-based+detection+for+bovine+viral+diarrhea+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Vet+Sci%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13a-based detection for bovine viral diarrhea virus.</a> Front Vet Sci. 8, 603919(2021).</li>
<li>Kellner, M. J., Koob, J. G., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHERLOCK%3A+nucleic+acid+detection+with+CRISPR+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">SHERLOCK: nucleic acid detection with CRISPR nucleases.</a> Nat Protoc. 14 (10), 2986-3012 (2019).</li>
<li>Selvam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RT-LAMP+CRISPR-Cas12%2F13-based+SARS-CoV-2+detection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">RT-LAMP CRISPR-Cas12/13-based SARS-CoV-2 detection methods.</a> Diagnostics (Basel). 11 (9), 1646(2021).</li>
<li>Carter, C., Akrami, K., Hall, D., Smith, D., Aronoff-Spencer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+visually+readable+loop-mediated+isothermal+reverse+transcriptase+nucleic+acid+amplification+test+for+detection+Ebola+Zaire+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Lyophilized visually readable loop-mediated isothermal reverse transcriptase nucleic acid amplification test for detection Ebola Zaire RNA.</a> J Virol Methods. 244, 32-38 (2017).</li>
<li>Bhardwaj, P., Kant, R., Behera, S. P., Dwivedi, G. R., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+diagnostic+with+CRISPR%2FCas%3A+Beyond+nucleic+acid+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Next-generation diagnostic with CRISPR/Cas: Beyond nucleic acid detection.</a> Int J Mol Sci. 23 (11), 6052(2022).</li>
<li>Twistamp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Twistamp%C2%AE+assay+design+manual%22">Twistamp® assay design manual</a>. , (2023).</li>
<li>Qian, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+isothermal+amplification+assay+for+viral+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">An enhanced isothermal amplification assay for viral detection.</a> Nat Commun. 11 (1), 5920(2020).</li>
<li>Ghouneimy, A., Mahas, A., Marsic, T., Aman, R., Mahfouz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+diagnostics%3A+Challenges+and+toward+point-of-care+applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACSSynth+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based diagnostics: Challenges and toward point-of-care applications.</a> ACSSynth Biol. 12 (1), 1-16 (2023).</li>
<li>Jones, K. L., Drane, D., Gowans, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+DNA-free+RNA+for+use+in+vaccine+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of DNA-free RNA for use in vaccine studies.</a> Biotechniques. 43 (5), 675-681 (2007).</li>
<li>Fang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+strand-displacement+DNA+amplification+by+a+contactless+electrochemical+microsystem+using+interdigitated+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of strand-displacement DNA amplification by a contactless electrochemical microsystem using interdigitated electrodes.</a> Lab Chip. 12 (17), 3190-3196 (2012).</li>
<li>Mok, E., Wee, E., Wang, Y., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+evaluation+of+molecular+enhancers+of+the+isothermal+exponential+amplification+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Comprehensive evaluation of molecular enhancers of the isothermal exponential amplification reaction.</a> Sci Rep. 6 (1), 37837(2016).</li>
<li>Wan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+test+kit+for+visual+loop-mediated+isothermal+amplification+of+Salmonella+in+spiked+ready-to-eat+fruits+and+vegetables%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of a test kit for visual loop-mediated isothermal amplification of Salmonella in spiked ready-to-eat fruits and vegetables.</a> J Microbiol Methods. 169, 105830(2020).</li>
<li>Curti, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+lyophilized+CRISPR-Cas12+assay+for+a+ensitive%2C+specific%2C+and+rapid+detection+of+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a lyophilized CRISPR-Cas12 assay for a ensitive, specific, and rapid detection of SARS-CoV-2.</a> Viruses. 13 (3), 420(2021).</li>
<li>Joung, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+with+SHERLOCK+one-pot+testing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK one-pot testing.</a> N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).</li>
</ol>

La diagnostica basata su CRISPR per il rilevamento di biomarcatori di acidi nucleici è stata segnalata per la prima volta nel 2017 1,2,3,4 e da allora è stata dimostrata come diagnostica di nuova generazione con test approvati dalla Food and Drug Administration (FDA), in particolare per il rilevamento dell'RNA del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) della sindrome respiratoria acuta grave, in più paesi 5,6,7,8 . Oltre alla malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), le tecnologie si sono dimostrate efficaci per rilevare diversi virus e batteri 9,10,11,12,13, mutazioni e delezioni di malattie genetiche e possono essere ingegnerizzate per rilevare biomarcatori proteici e piccole molecole 2,12. La diagnostica basata su CRISPR spesso combina metodi di amplificazione isotermica, come l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) o l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP)14,15, con il rilevamento basato su CRISPR utilizzando enzimi associati a CRISPR (Cas) guidati da RNA con attività endonucleasica "collaterale" dopo il riconoscimento del bersaglio3. Il duplice uso dell'amplificazione isotermica e della rilevazione basata su CRISPR conferisce diversi attributi desiderabili alle tecnologie, in particolare un'elevata accuratezza diagnostica che si avvicina a quella della reazione a catena della polimerasi (PCR) gold standard e la capacità di multiplexare e rilevare piccole differenze di sequenza, inclusi i polimorfismi a singolo nucleotide 1,9.
Le versioni più accurate della diagnostica basata su CRISPR, tuttavia, contengono più componenti e passaggi e possono essere complicate da eseguire con non esperti o presso il punto di cura (POC). Per affrontare la sfida di estendere l'uso di una diagnostica altamente accurata basata su CRISPR alle impostazioni POC, abbiamo sviluppato protocolli per preparare l'amplificazione isotermica premiscelata, liofilizzata, basata sulla ricombinasi e reazioni di rilevamento basate su CRISPR, che sono facili da usare e memorizzare7. Questi protocolli dovrebbero integrare gli eccellenti protocolli esistenti sulla diagnostica basata su CRISPR14, che contengono informazioni aggiuntive sulla produzione di componenti biochimici necessari per la diagnostica basata su CRISPR7, linee guida di progettazione1 e formulazioni che utilizzano tecniche di amplificazione isoterma alternative 2,14,15,16 ed enzimi Cas 12. In definitiva, speriamo che la diagnostica basata su CRISPR possa aiutare a realizzare un rilevamento nucleico rapido, economico e sensibile in ambienti in cui sono richieste analisi portatili e prive di strumenti 1,9,17.
Nei nostri protocolli utilizziamo principalmente la combinazione di rilevamento basato su RPA e Cas13. L'RPA funziona a temperature prossime a quelle ambiente (37-42 °C) e, pertanto, ha bassi requisiti energetici e di apparecchiature. Altre reazioni di amplificazione isoterma richiedono temperature più elevate (LAMP, 60-65 °C; amplificazione a spostamento di filamento (SDA), 60 °C; reazione di amplificazione esponenziale (EXPAR), 55 °C; e amplificazione eliodipendente (HDA), 65 °C)2. Anche il design dei primer RPA non è complesso, a differenza dei primer LAMP, e può essere esteso all'amplificazione multiplexata 7,9,14. Anche se il multiplexing oltre due bersagli con RPA è difficile nella pratica, esistono linee guida chiare su come progettare primer RPA multiplex per ridurre al minimo l'interferenza18.
Sebbene la contaminazione da carryover rimanga un grosso problema nel flusso di lavoro in due fasi, gli ampliconi generati di RPA sono di piccole dimensioni e hanno meno probabilità di causare contaminazione da carryover rispetto ai grandi ampliconi concatemerici di LAMP14. I primer RPA possono essere progettati secondo le linee guida standard14: sono generalmente lunghi 25-35 nucleotidi con temperature di fusione comprese tra 54 e 67 °C. La dimensione dell'amplicone dovrebbe essere inferiore a 200 coppie di basi. L'enzima trascrittasi inversa (RT) può essere aggiunto all'RPA per consentire l'amplificazione dall'RNA, e nella trascrizione inversa-RPA (RT-RPA), un altro enzima Ribonucleasi H (RNasi H) viene tipicamente aggiunto in piccole quantità per aiutare a risolvere l'ibrido RNA: DNA risultante e promuovere la reazione di amplificazione 5,19. Per consentire la trascrizione di T7 per il rilevamento basato su Cas13, il promotore della RNA polimerasi T7 può essere posizionato all'estremità 5' del primer RPA in avanti.
Dopo che gli ampliconi sono stati generati dall'RPA, possono essere rilevati con gli enzimi Cas programmati con crRNA. Tra i vari enzimi Cas che possono essere utilizzati per la rilevazione di ampliconi, preferiamo le varianti Cas13 che hanno come bersaglio l'RNA a causa della loro elevata attività di clivaggio1 e delle preferenze di clivaggio polinucleotidico ben caratterizzate 7,9, quest'ultima delle quali può essere utilizzata per la rilevazione multiplexata. La sequenza di crRNA per Cas13 è progettata per essere complementare (complemento inverso) al sito bersaglio nell'RNA prodotto con sequenze spaziatrici e ripetizioni dirette (DR). La sequenza di crRNA e i primer RPA non devono sovrapporsi, per evitare il rilevamento indesiderato basato su Cas di prodotti di amplificazione fuori bersaglio, che aumenta il fondo e i falsi positivi14.
Il rilevamento basato su Cas-based si basa su diverse modalità di rilevamento per monitorare la scissione delle molecole di acido nucleico reporter (RNA reporter per reazioni basate su Cas13)1,2,14. Diverse modalità di rilevamento includono colorimetria, letture elettrochimiche, fluorescenza, letture di sequenziamento e strisce a flusso laterale2. Ci concentriamo sulla lettura della fluorescenza data una varietà di fluorofori e reporter come la cianina 5 (Cy5), la rodamina X (ROX) e la carbossifluoresceina (FAM), che possono essere efficacemente eccitati utilizzando una singola sorgente di luce LED blu e la loro fluorescenza analizzata da un lettore di micropiastre o da un termociclatore in tempo reale 7,14. Inoltre, la lettura della fluorescenza è facile da configurare e consente un monitoraggio continuo, che consente la quantificazione in tempo reale. La preamplificazione RPA multiplexata e la rilevazione multiplexata basata su Cas13 utilizzando enzimi Cas possono essere combinate con letture di fluorescenza multicolore per la rilevazione simultanea di più bersagli genetici 2,7.
Nei nostri protocolli, prima amplifichiamo isotermicamente l'RNA con RT-RPA aggiungendo il campione di RNA alla forma liofilizzata del reagente RT-RPA (Figura 1). Durante la RT-RPA, il promotore T7 viene aggiunto all'amplicone di DNA a doppio filamento generato. Successivamente, i prodotti RPA vengono trasferiti alla rilevazione liofilizzata basata su Cas13, che contiene anche RNA polimerasi T7. Questa reazione di rilevamento convertirà gli ampliconi del DNA in RNA (tramite la RNA polimerasi T7), che può essere facilmente rilevata con Cas13 programmato con crRNA. Cas13 attivato dal bersaglio scinde le molecole reporter per produrre un segnale di fluorescenza rilevabile 2,7,14. Sebbene i protocolli qui riportati riguardino la rilevazione da parte di Leptotrichia wadei (LwaCas13a), possono essere estesi alla rilevazione simultanea e multiplexata di un massimo di quattro bersagli utilizzando gli enzimi ortogonali Cas13 e Cas12 7,9. Le reazioni di rilevamento basate su RPA e Cas possono anche essere combinate in un'unica provetta, anche se con una perdita di sensibilità14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig01v2.jpg"> Figura 1: Flusso di lavoro di rilevamento basato su CRISPR. Il flusso di lavoro illustra il rilevamento di due geni bersaglio. In primo luogo, le regioni di interesse all'interno del bersaglio del DNA vengono amplificate isotermicamente con RPA; la reazione può essere eseguita con la trascrizione inversa (RT-RPA) quando si rilevano bersagli di RNA. Successivamente, la trascrizione T7 converte gli ampliconi del dsDNA in RNA, che a loro volta sono riconosciuti dai complessi Cas13-crRNA in grado di suscitare l'attività collaterale della RNasi al momento del legame con il bersaglio. La scissione dei reporter di fluorescenza temprati produce segnali di fluorescenza che possono essere monitorati utilizzando un lettore di micropiastre, visualizzati da un transilluminatore a LED o utilizzati con un termociclatore in tempo reale. Abbreviazioni: CRISPR = Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats; RT = trascrizione inversa; RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; Cas = proteina associata a CRISPR; LED = diodo a emissione luminosa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Le caratteristiche principali dei protocolli qui presentati sono le formulazioni di premiscelazione per la liofilizzazione. La premiscelazione semplifica l'uso della reazione e migliora la riproducibilità, ma molti componenti all'interno della rilevazione basata su RPA e Cas, in particolare la trascrizione inversa e alcuni cofattori labili come l'ATP, non sono stabili in soluzione. Pertanto, formuliamo le soluzioni premiscelate in modo tale che possano essere liofilizzate per lo stoccaggio a lungo termine e per un facile trasporto e distribuzione 1,9,20. I reagenti premiscelati e liofilizzati contribuiscono anche a migliorare la sensibilità di rilevamento, poiché è possibile aggiungere un volume di campione più elevato (e quindi un maggiore input di DNA/RNA) per ricostituire la reazione10. Nelle nostre formulazioni, utilizziamo principalmente il trealosio21 come crioprotettore nelle reazioni di rilevamento basate su RPA liofilizzato e Cas7. Oltre alla conservazione del reagente, il trealosio promuove anche le reazioni aumentando la stabilizzazione enzimatica 16,22,23,24 e diminuendo le temperature di fusione del dsDNA 23. L'esplorazione di altri stabilizzanti 5,7,21,25,26 oltre al trealosio può produrre formulazioni ancora più ottimali per diversi scenari di utilizzo.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiale</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di betaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Acqua trattata con DEPC</td><td>Invitrogen</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Merck</td><td>3870-25GM</td><td></td></tr><tr><td>EpiScript trascrittasi inversa</td><td>Lucigen</td><td>ERT12925K</td><td></td></tr><tr><td>Gly-Gly-Gly& nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-50239-1G</td><td></td></tr><tr><td>LwaCas13a</td><td>Produzione interna</td><td></td><td>Nome ceppo: Leptotrichia wadei, Abbreviazione: Lwa, Nome della proteina: LwaCas13a</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di magnesio, 1M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>NxGenT7 RNA polimerasi</td><td>Lucigen</td><td>30223-2</td><td></td></tr><tr><td>Poli(glicole etilenico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81300-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acetato di potassio, 5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>95843-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di riobnucleotide Miscela</td><td>NEB</td><td>N0466L</td><td></td></tr><tr><td>RNasi H</td><td>NEB</td><td>M0297L</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>TCI</td><td>TCI-S0111-500G</td><td></td></tr><tr><td>Trealosio Diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SIA-90210-50G</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Trizma cloridrato, 1M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TwistAmp Kit di base</td><td>TwistDx</td><td>TABAS03KIT</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BluPAD Transilluminatore a luce blu/bianca Dual LED</td><td>Bio-Helix</td><td>BP001CU</td><td></td></tr><tr><td>Dry Bath Dual Block</td><td>ELITE</td><td>4-2-EL-02-220</td><td>Modello: EL-02</td></tr><tr><td>Micropiastra a fluorescenza lettore</td><td>Tecan</td><td>30050303</td><td>Modello: Infinite 200 Pro</td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>LABCONCO</td><td>794001030</td><td>FreeZone Triad Liofilizzatore da banco</td></tr><tr>Micropiastra <td>Greiner</td><td>a 384 pozzetti</td><td>GDE0784076</td><td>F-Bottom, piccolo volume, Hibase, Med. Binding, Nero</td></tr><tr><td>Termociclatore in tempo reale (CFX Connect Real-Time PCR System)</td><td>Bio-Rad</td><td>185-5201</td><td>Modello: CFX Connect Optics Module</td></tr><tr><td>Oligonucleotide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>s-gene forward RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCAC TATAGGGAGGTTTCAAAC TTTACTTGCTTTACATAGA</td></tr><tr><td>s-gene reverse RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>TCCTAGGTTGAAGA TAACCCACATAATAAG</td></tr><tr><td>n-gene forward RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTC ACTATAGGAACTTCTC CTGCTAGAATGGCTG</td></tr><tr><td>primer RPA inverso n-gene</td><td>IDT</td><td></td><td>CAGACATTTTGCTCTC AAGCTGGTTCAATC</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA per il gene s</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAAC GAAGGGGACUAAAACGCAGCA CCAGCUGUCCAACCUGAAGAAG</td></tr><tr><td>LwaCas13a-crRNA per il gene n</td><td>Synthego</td><td></td><td>GAUUUAGACUACCCCAAAAACG AAGGGGACUAAAAAAAGCAAG AGCAGCAUCACCGCCAUUGC</td></tr><tr><td>FAM-polyU-IABkFQ reporter</td><td>IDT</td><td></td><td>56-FAM/rUrUrUrUrU/3IABkFQ</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_F RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>GAAATTAATACGACTCACTA TAGGGTACGGATGAACCATA CAAAACCTTCACGCAATCG</td></tr><tr><td>O-hannah_cytb_R RPA primer</td><td>IDT</td><td></td><td>AAGATCCATAGTAGATTC CTCGTGCGATGTGGATA</td></tr><tr><td>synT7crRNA13a_ O_hannah&nbsp;</td><td>IDT</td><td></td><td>GCGCATCCATATTCTTCAT CTGCATTTAGTTTTAGTCC CCTTCGTTTTTGGGGTA GTCTAAATCCCCTATAGT GAGTCGTATTAATTTC</td></tr></tbody></table>

diagnostica point-of-care basata su crispr con reagenti premiscelati e liofilizzati

Point-of-care CRISPR-based Diagnostics with Premixed and Freeze-dried Reagents

Evidenziamo la cinetica della generazione del segnale di fluorescenza FAM dal rilevamento combinato dei geni s e n di SARS-CoV-2 e il modo in cui le informazioni sono state utilizzate per determinare le condizioni ottimali per le formulazioni di reazioni premiscelate liofilizzate. In tutti i casi, abbiamo incluso campioni con valori di Ct ben al di sotto del limite di rilevamento determinato (LoD) (Ct ~31-33), così come quelli con Ct al LoD (Ct ~35-37)7, per consentire la differenziazione dei protocolli con una migliore sensibilità.
Per l'RT-RPA liofilizzato e premiscelato, abbiamo scoperto che l'inclusione di KOAc nella reazione premiscelata ha influenzato negativamente la sensibilità della reazione (Figura 2A). Abbiamo quindi omesso KOAc dalla reazione premiscelata e l'abbiamo aggiunto con l'iniziatore di reazione, Mg(OAc)2, una volta aggiunto il campione di RNA. Abbiamo anche utilizzato saggi simili per determinare la concentrazione ottimale di un trealosio crioprotettore (Figura 2B) e gli effetti della triglicina7 nella reazione RT-RPA liofilizzata (Figura 2C). Pertanto, le reazioni RT-RPA liofilizzate e premiscelate ottimali sono state preparate con trealosio al 6%, senza KOAc (ma è stato aggiunto successivamente dopo il campione di RNA) e integrate con triglicina, come descritto nella sezione 1 del protocollo.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig02.jpg"> Figura 2: Ottimizzazione delle reazioni RT-RPA liofilizzate e premiscelate. La reazione RT-RPA è stata preparata utilizzando primer che hanno come bersaglio il gene n di SAR-CoV-2. Il Mg(OAc)2 è stato escluso da tutte le reazioni premiscelate. Sono stati valutati gli effetti di (A) KOAc, (B) trealosio e (C) triglicina aggiunti alle reazioni premiscelate. Il monitoraggio della reazione tramite fluorescenza FAM generata è stato effettuato utilizzando un termociclatore in tempo reale o un lettore di micropiastre a fluorescenza. Vengono mostrati i dati individuali delle misurazioni in triplice copia. Abbreviazioni: RT = trascrizione inversa; RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR; SAR-CoV-2 = Sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus 2; Ct = soglia del ciclo; FAM = carbossifluoresceina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Per le reazioni liofilizzate e premiscelate a base di Cas13a, abbiamo verificato l'importanza di avere il crioprotettore corretto: il 6% di trealosio o il 2% di saccarosio19 hanno funzionato bene, mentre un saccarosio inferiore all'1% o al 5% p/v PEG20000 non ha preservato l'efficienza della reazione dopo la liofilizzazione (Figura 3). MgCl2 è stato omesso da tutte le reazioni ed è stato aggiunto nella fase di reidratazione. La reazione di rilevamento ottimale basata su Cas13 liofilizzata è stata preparata con trealosio al 6%, come mostrato nella sezione 2 del protocollo.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig03.jpg"> Figura 3: Ottimizzazione delle reazioni di rilevamento basate su Cas13 liofilizzate e premiscelate. La reazione di rilevamento è stata eseguita a 37 °C utilizzando il prodotto RPA del gene SARS-CoV-2 n . I test sono stati eseguiti prima e dopo la liofilizzazione. MgCl2 è stato escluso da tutte le reazioni premiscelate. Sono state valutate le capacità di (A) trealosio, (B) PEG20000 e (C) saccarosio nel preservare l'efficienza della reazione dopo la liofilizzazione. Il monitoraggio della reazione tramite fluorescenza FAM generata è stato effettuato utilizzando un termociclatore in tempo reale. Vengono mostrati i dati individuali delle misurazioni in triplicato per le condizioni "dopo la liofilizzazione" e una replica delle condizioni "prima della liofilizzazione". La Figura 3A, B è stata presa da Patchsung et al.7. Abbreviazioni: RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; SAR-CoV-2 = sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2; FAM = carbossifluoresceina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I reagenti liofilizzati e premiscelati per le reazioni a base di RT-RPA e Cas13 sono stabili a -20 °C per almeno 8 mesi [Figura 4].
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig06.jpg"> Figura 4: Prove di stabilità di reagenti RPA liofilizzati, premiscelati e CRISPR-Cas13a a -20 °C. Test di stabilità a (A) 30 giorni, (B) 45 giorni, (C) 3 mesi, (D) 5 mesi, (E) 8 mesi. Vengono mostrati i dati individuali delle misurazioni in triplice copia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Il LoD delle reazioni liofilizzate basate su RT-RPA e Cas13 per il rilevamento dei geni s e n di SARS-CoV-2 è mostrato nella Figura 5. La cinetica di generazione del segnale può essere migliorata con il rilevamento di un doppio gene rispetto a quando viene rilevato un solo gene.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig04.jpg"> Figura 5: Sensibilità analitica della rilevazione di un singolo gene rispetto a un gene doppio. (A) Il LoD della rilevazione liofilizzata di RT-RPA a singolo plex e di Cas mirata al gene s di SAR-CoV-2. (B) Il LoD della RT-RPA a plex singolo liofilizzato e la rilevazione basata su Cas mirata al gene n di SAR-CoV-2. (C) Il LoD della RT-RPA multiplex liofilizzata e del rilevamento basato su doppio Cas mirato ai geni s e n . Il LoD è stato determinato utilizzando RNA SARS-CoV-2 diluiti in serie, i cui valori di Ct sono stati determinati utilizzando un test RT-qPCR mirato al gene n . Vengono mostrati i dati individuali di 3-6 misurazioni replicate. Abbreviazioni: LoD = limite di rilevabilità; RT = trascrizione inversa; RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR; SAR-CoV-2 = Sindrome respiratoria acuta grave Coronavirus 2; Ct = soglia del ciclo; qPCR = reazione quantitativa della polimerasi a catena. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Oltre al rilevamento del virus, presentiamo un prototipo di uno strumento di genotipizzazione POC basato sulla diagnostica CRISPR, per aiutare a identificare le specie di serpenti velenosi endemiche della Thailandia (Figura 6). Un'identificazione più rapida e accurata delle specie di serpenti attraverso campioni di DNA raccolti da ferite da morso può aiutare nella pronta somministrazione di antidoti, migliorando le possibilità di sopravvivenza del paziente. Abbiamo preso di mira le regioni all'interno del gene del citocromo b mitocondriale (cytb) di otto specie di serpenti, tra cui Ophiophagus hannah (cobra reale) (Figura 6A) e abbiamo dimostrato che il rilevamento di surrogati di DNA sintetico del gene cytb di O. hannah può raggiungere il livello di sensibilità attomolare (Figura 6B, C).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66703/66703fig05.jpg"> Figura 6: Un prototipo per il rilevamento basato su CRISPR per identificare le specie di serpenti dall'avvelenamento da morso di serpente. (A) Primer RPA e design di crRNA LwaCas13a per il rilevamento del gene cytb di Ophiophagus hannah. Il promotore T7 (sporgenza T7) è stato posizionato all'estremità 5' dell'innesco RPA in avanti. (B) Cinetica della generazione del segnale FAM in 60 minuti e (C) fluorescenza FAM endpoint dal rilevamento mediato da LwaCas13a di input sintetici di dsDNA corrispondenti ai segmenti del gene cytb di O. hannah. Sono state utilizzate diverse concentrazioni di input (0, 10-9, 10-12, 10-15 e 10-18 M). I dati sono medi ± s.d. da misure in triplice copia. Abbreviazioni: RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR; FAM = carbossifluoresceina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66703/66703fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="5">Liofilizzazione di reagenti di rivelazione premiscelati CRISPR-Cas13a</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Passo</td>
			<td>Velocità di rampa</td>
			<td>Temperatura scaffale</td>
			<td rowspan="2">Tempo (hh:mm)</td>
			<td>Vuoto</td>
		</tr><tr><td>(°C/min)</td>
			<td>(°C)</td>
			<td>(mbar)</td>
		</tr><tr><td>Congelare 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>spento</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Secco 1</td>
			<td>3</td>
			<td>-30</td>
			<td>spento</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Secco 2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>01:00</td>
			<td>0</td>
		</tr><tr><td>Secco 3</td>
			<td>3</td>
			<td>20</td>
			<td>∞</td>
			<td>0</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Impostazioni del liofilizzatore dei reagenti di rilevamento RT-RPA e CRISPR-Cas13a premiscelati. Abbreviazioni: RT = trascrizione inversa; RPA = amplificazione della polimerasi ricombinasi; CRISPR = brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente intervallate; Cas = proteina associata a CRISPR.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Parametro</td>
			<td>Impostazione</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Temperatura</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Ciclo cinetico</td>
			<td>Durata</td>
			<td>02:00 (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td>Intervallo di tempo</td>
			<td>02:30 (mm:ss)</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Tremante</td>
			<td>Durata</td>
			<td>1 secondo</td>
		</tr><tr><td>Modo</td>
			<td>Lineare</td>
		</tr><tr><td>Ampiezza</td>
			<td>1 millimetro</td>
		</tr><tr><td>Intensità della fluorescenza</td>
			<td>Lunghezza d'onda di eccitazione</td>
			<td>488 nm</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Lunghezza d'onda di emissione</td>
			<td>520 nm</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Modo</td>
			<td>In alto</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Posizione Z</td>
			<td>24470</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Guadagnare</td>
			<td>71</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Tempo di integrazione</td>
			<td>20 μs</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Numero di lampeggi</td>
			<td>25</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Programma di lettura di micropiastre a fluorescenza per la rilevazione di acidi nucleici.

Diagnostica point-of-care basata su CRISPR con reagenti premiscelati e liofilizzati

Molecular diagnostics by Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-based detection have high diagnostic accuracy and attributes ...

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