Diagnostica point-of-care basata su CRISPR con reagenti premiscelati e liofilizzati
16 agosto 2024
Qui, presentiamo la preparazione passo dopo passo dell'amplificazione isotermica premiscelata e liofilizzata basata sulla ricombinasi e delle reazioni basate su CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), che possono essere utilizzate per il rilevamento di biomarcatori di acidi nucleici di patogeni di malattie infettive o altri marcatori genetici di interesse.
Sviluppiamo test point-of-care per rilevare questi materiali di malattie infettive. Questo test utilizza l'amplificazione isotermica dell'acido nucleico e il rilevamento basato su CRISPR. Con un'elevata precisione osmotica simile alla PCR, possono rilevare piccole differenze di sequenza, tra cui il polimorfismo a singolo nucleotide, e possono essere multipli.
CRISPR, le reazioni osmotiche contengono più componenti e passaggi e sono difficili da eseguire presso il punto di cura. Poiché gli osmotici sono altamente sensibili, c'è il rischio di contaminazione da carryover che può portare a risultati falsi. Fortunatamente, questo problema può essere mitigato se semplifichiamo le procedure delle reazioni.
Offriamo un metodo facile da usare per rilevare i nostri patogeni patogeni e marcatori genetici utilizzando l'amplificazione isotermica della ricombinasi e i reagenti basati su CRISPR. Questi reagenti sono semplici da conservare e utilizzare. Offriamo anche suggerimenti per risolvere i problemi comuni durante l'utilizzo di questi metodi e reagenti, facilitando l'uso da parte delle persone.
Il protocollo utilizza i reagenti CRISPR, che facilitano il trasporto e lo stoccaggio. I reagenti liofilizzati possono essere facilmente reidratati nei punti di utilizzo e mantengono un'elevata efficienza di amplificazione e rilevamento. Speriamo di applicare le tecnologie diagnostiche CRISPR per rilevare malattie infettive endemiche ed emergenti.
Se questo test può essere eseguito di routine e correttamente presso il punto di cura, ciò potrebbe informare le opzioni di trattamento antivirale e antibiotico, potenzialmente salvare vite umane, ridurre l'uso eccessivo di farmaci e lo sviluppo di resistenza.
Panoramica
In questo articolo viene presentato un metodo per lo sviluppo di test diagnostici point-of-care che utilizzano l'amplificazione isoterma degli acidi nucleici e il rilevamento basato su CRISPR per identificare il materiale genetico di malattie infettive. L'approccio mira a migliorare la sensibilità e l'accuratezza, affrontando al contempo sfide come i rischi di contaminazione.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Diagnostica delle malattie infettive
- Tecniche di amplificazione degli acidi nucleici
- Tecnologia CRISPR
Sfondo
- I test diagnostici al punto di cura sono fondamentali per la diagnosi rapida delle malattie infettive.
- L'amplificazione isoterma consente una rilevazione efficiente degli acidi nucleici.
- La tecnologia CRISPR offre un'elevata sensibilità per l'identificazione del materiale genetico.
- I rischi di contaminazione possono portare a risultati falsati nei saggi sensibili.
Scopo dello studio
- Sviluppare una procedura semplificata per reazioni basate su CRISPR.
- Migliorare l'accuratezza nel rilevamento di piccole variazioni genetiche.
- Ridurre i rischi di contaminazione in contesti di diagnosi al punto di cura.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di reagenti liofilizzati pre-miscelati per l'amplificazione isoterma.
- Implementazione di metodi di rilevamento basati su CRISPR.
- Valutazione della sensibilità e specificità nel rilevamento di biomarcatori acidi nucleici.
- Ottimizzazione delle condizioni di reazione per ridurre i rischi di contaminazione.
Risultati principali
- Il metodo sviluppato ha dimostrato un'elevata sensibilità nella rilevazione di marcatori genetici.
- I rischi di contaminazione sono stati significativamente ridotti grazie alla semplificazione delle procedure.
- I risultati erano paragonabili a quelli dei metodi PCR tradizionali.
- L'approccio è adatto per applicazioni point-of-care.
Conclusioni
- Questo studio presenta un metodo praticabile per il rilevamento rapido di patogeni delle malattie infettive.
- I saggi basati su CRISPR possono essere efficacemente semplificati per un uso pratico.
- I lavori futuri potrebbero concentrarsi sul miglioramento ulteriore della robustezza dei test.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Reagenti diagnostici basati su CRISPR pre-miscelati e liofilizzati consentono un rilevamento rapido e accurato dei marcatori genetici delle malattie infettive al punto di cura, affrontando colli di bottiglia operativi nei test decentralizzati. Questo approccio riduce la complessità della manipolazione manuale e il rischio di contaminazione, favorendo un'implementazione su larga scala in contesti con risorse limitate e in campo. Il metodo migliora la sicurezza predittiva per un intervento precoce e orienta in tempo reale le decisioni terapeutiche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente un'analisi rapida dei marcatori genetici dei patogeni per la validazione degli obiettivi nella ricerca sulle malattie infettive.
- Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo un rilevamento ad alta sensibilità dei polimorfismi a singolo nucleotide.
- Facilita la selezione del portafoglio distinguendo tra ceppi di patogeni strettamente correlati.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce sistemi di reagenti pronti all'uso e validati per flussi di lavoro semplificati nello sviluppo di saggi.
- Migliora la riproducibilità e la standardizzazione dei saggi attraverso formati premiscelati e liofilizzati.
- Consente lo screening su scala variabile di campioni clinici o ambientali con strumentazione minima.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea con le strategie traslazionali dei biomarcatori consentendo il rilevamento di firme di acidi nucleici rilevanti per la malattia.
- Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica fornendo diagnostici robusti e utilizzabili sul campo.
- Riduce il rischio nel progresso dei candidati diagnostici dimostrando la stabilità e l'efficienza dei reagenti.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo integra le fasi iniziali della scoperta fino alla ricerca traslazionale, sostenendo i flussi di lavoro dall'identificazione del bersaglio alla validazione preclinica delle piattaforme diagnostiche.
- Biologia della scoperta: Fornisce la rilevazione ad alta affidabilità di bersagli genetici per test di ipotesi e studi meccanicistici.
- Screening: Offre output standardizzati e quantitativi per confrontare condizioni del campione e prestazioni del saggio.
- Analisi: Permette letture basate sulla fluorescenza ad alta sensibilità per un'analisi dati robusta e supporto decisionale.
- Ricerca traslazionale: Collega applicazioni di laboratorio e di campo, sostenendo lo sviluppo diagnostico guidato da biomarcatori.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma di reagenti riutilizzabili adattabile a diversi bersagli patogeni e tipi di campione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità nel rilevamento dei patogeni.
- Valore operativo: Semplifica i flussi di lavoro, migliora la riproducibilità e supporta logistica indipendente dalla catena del freddo.
- Valore strategico: Accelera le decisioni di avanzamento o interruzione per i candidati diagnostici e riduce i rischi in fase avanzata.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata ai rischi delle risorse diagnostiche per malattie emergenti ed endemiche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'amplificazione degli acidi nucleici e nella progettazione di saggi basati su CRISPR.
- Necessita dell'accesso a un'attrezzatura per la liofilizzazione e a lettori di micropiastre a fluorescenza per l'esecuzione completa del flusso di lavoro.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per la preparazione e la manipolazione dei reagenti.
- Adattabile a diversi tipi di campioni, ma potrebbe richiedere un'ottimizzazione specifica per determinati patogeni.
- Stabilità ed efficienza validate per almeno otto mesi a -20°C, idonee per un impiego prolungato.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
