Name: Elettroporazione combinata in vivo e reinnervazione a breve termine del muscolo scheletrico elevatore cranico Auris Longus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: Impara l'elettroporazione in vivo combinata alla denervazione del muscolo LAL nei topi per studiare la rigenerazione delle sinapsi neuromuscolari e il ruolo delle proteine muscolari nella stabilizzazione dei recettori postsinaptici.

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<meta charset="utf8"></head><body>Elettroporazione e lesione nervosa nel muscolo elevatore lungo del topo

<ol><li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+motor+nerve+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The functional organization of motor nerve terminals.</a> Prog Neurobiol. 134, 55-103 (2015).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>#5/45 Pinze Dumont&nbsp;</td><td>Strumenti di Fine Science&nbsp;</td><td>11251-35</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>anti 2H3</td><td>DSHB</td><td></td><td>Diluire 1 : 300</td></tr><tr><td>anti S100 Pronto all'uso</td><td>Dako</td><td>IR504</td><td>Diluire 1 : 5</td></tr><tr><td>anti SV2</td><td>DSHB</td><td></td><td>Diluire 1 : 50</td></tr><tr><td>Clorexidina gluconato 2%</td><td>DifenPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio per dissezione a luce fredda</td><td>Motic</td><td>Model SMZ-171</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Diluire 1 : 100</td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinze</td><td>Strumenti di Fine Science&nbsp;</td><td>11252-00</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>Dumont Mini Pinze &ndash; Stile 5</td><td>Strumenti di Fine Science&nbsp;</td><td>11200-14</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>ECM 830 elettroporatore</td><td>BTX Harvard Apparecchio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettrodi ad ago in oro&nbsp;</td><td>Genetrodes, BTX</td><td>45-0114</td> Siringa <td>Hamilton diritta da 10 mm</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>80400</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>Macchina per anestesia per inalazione</td><td>SciVerma Scientific</td><td>M3000 Table Top</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>218-082</td><td></td></tr><tr><td>Topi Instituto</td><td>de Salud Publica - Cile</td><td></td><td>Topi adulti (3-6 mesi) CF-1, di entrambi i sessi (30-45 g)&nbsp;</td></tr><tr><td>Lamette</td><td>da barba Schick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suture Glicosorb 5/0</td><td>TAGUM</td><td>GS0812. J</td><td>Filo di acido poliglicolico assorbibile&nbsp;</td></tr><tr><td>tdPlasmide di pomodoro</td><td>Addgene</td><td>54642</td><td>tdPlasmide di pomodoro sotto il controllo del promotore CMV</td></tr><tr><td>Tramadol cloridrato 5% (Triamcol)</td><td>Drag Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>91500-09</td><td>Sterilizzare prima dell'uso</td></tr><tr><td>WGA Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>W7024</td><td>Diluire</td></tr><tr><td>&alpha;-BTX Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>B13422</td><td>Diluire 1 : 500</td></tr></tbody></table>

elettroporazione combinata in vivo e reinnervazione a breve termine del muscolo scheletrico elevatore cranico auris longus

Combined In Vivo Electroporation and Short&#45;Term Reinnervation of the Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle

L'elevata resa quantica in fluorescenza della proteinatdTomato 20 la rende un tracciante appropriato per l'efficienza dell'elettroporazione. Pertanto, è stata valutata l'espressione della proteina tdTomato nei muscoli LAL mediante elettroporazione in vivo (Figura 1). I muscoli LAL sono stati sezionati 21 giorni dopo l'elettroporazione. Le preparazioni a montatura intera mostrano la sottile banda caudale (cLAL, poligono ciano) del muscolo LAL con le sue due regioni di innervazione e la spessa banda rostrale (rLAL, poligono giallo) con le sue cinque regioni di innervazione 8,10 (Figura 1B). A seconda del sito di iniezione del DNA e del posizionamento degli elettrodi, un'alta percentuale di fibre muscolari, in particolare della porzione rLAL, era positiva per l'espressione di tdTomato (Figura 1B). Le criosezioni trasversali sono state eseguite come descritto16 per valutare l'efficienza della procedura (Figura 1C). La quantificazione mostra che il 66,70% ± il 5,95% di fibre positive per l'espressione di tdTomato (Figura 1D). Quindi, per valutare il danno alle fibre muscolari, la membrana muscolare è stata marcata con WGA e i nuclei con DAPI (Figura 1C) per identificare la presenza di nuclei centrali (punte di freccia) come segno di cicli di danno/rigenerazione. Non sono state riscontrate differenze significative nella percentuale di fibre con nuclei centrali tra i muscoli LAL di controllo e quelli elettroporati (Figura 1E).
Lo schiacciamento del ramo auricolare posteriore del nervo facciale denerva il muscolo LAL6 (Figura 2A). I muscoli LAL di topi di controllo e di topi 5 giorni, 10 giorni e 60 giorni dopo la lesione nervosa sono stati sezionati, fissati e colorati utilizzando i metodi precedentemente descritti16,21. In breve, l'anticorpo SV2 marcare le vescicole sinaptiche e viene utilizzato insieme all'anticorpo 2H3 contro i neurofilamenti per rivelare l'intero dominio presinaptico 6,16,22,23,24. L'anticorpo S100B è stato utilizzato per colorare le cellule di Schwann, mentre α-BTX ha rilevato AChR postsinaptici. L'imaging al microscopio confocale ha mostrato una denervazione NMJ completa 5 giorni dopo la lesione nervosa (Figura 2B). I domini postsinaptici sembrano essere reinnervati 10 giorni dopo la lesione nervosa (Figura 2B). Dopo 60 giorni (Figura 2B), le NMJ rigenerate hanno mostrato un fenotipo simile al controllo.
Infine, è stato testato l'uso combinato di protocolli di elettroporazione in vivo e schiacciamento del nervo facciale. Per questo, i muscoli LAL sono stati elettroporati con un vettore che esprime la proteina tdTomato e, 3 giorni dopo, è stata eseguita una lesione nervosa. Dopo 9 giorni, il muscolo LAL è stato sezionato, fissato e colorato per rivelare i domini pre e postsinaptici NMJ (Figura 3A). Si può osservare l'espressione della proteina tdTomato nelle fibre muscolari, insieme alle NMJ denervate (punta di freccia verde) e reinnervate (frecce gialle) (Figura 3B). La quantificazione ha rivelato che il 58,37% ± il 4,63% delle fibre sono positive per l'espressione di tdTomato (Figura 3C, barra sinistra), mentre il 47,00% ± il 10,69% dei domini postsinaptici sono reinnervati (Figura 3C, barra destra).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig01.jpg"> Figura 1: Efficiente trasferimento genico mediato da elettroporazione in vivo dei muscoli LAL. Un plasmide codificante per la proteina tdTomato è stato espresso nei muscoli LAL mediante elettroporazione in vivo di topi adulti. La soluzione di DNA è stata iniettata sotto la fascia muscolare rLAL e gli elettrodi dorati ad ago sono stati posizionati sopra il muscolo per erogare cinque impulsi di 100 V/cm2 con una durata di 20 ms a 1 Hz (A). I muscoli interi montati sono stati sezionati 21 giorni dopo l'elettroporazione e colorati per AChR utilizzando α-BTX (bianco). Nel muscolo rLAL (B) sono state osservate fibre elettroporate che esprimono tdTomato (rosso). Il muscolo rLAL è stato sezionato trasversalmente e colorato con WGA (giallo) e DAPI (ciano) (C) per rilevare rispettivamente la membrana muscolare e i nuclei. L'efficienza della procedura è stata quantificata come percentuale di fibre che esprimono tdPomodoro (rosso in C) rispetto alle fibre totali tramite colorazione WGA (D). La proporzione di nuclei centrali (punte di freccia) è stata quantificata come parametro di danno/rigenerazione delle fibre muscolari (E). Le statistiche rappresentano la media ± SEM di N: tre animali per gruppo (di controllo ed elettroporosi). Barra graduata = 1 mm (B), 50 μm (C). ns = non significativo; test t. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig02.jpg"> Figura 2: Rigenerazione NMJ a breve termine utilizzando un protocollo di lesione da schiacciamento nervoso. Per una specifica lesione da schiacciamento nervoso, il ramo auricolare posteriore del nervo facciale (ciano) può essere esposto in modo efficiente identificando alcuni indicatori anatomici: la vena auricolare posteriore, il ventre del muscolo digastrico e il condotto uditivo cartilagineo (A). Immagini rappresentative al microscopio confocale di NMJ muscolari LAL ottenute da controllo o sezionate 5 giorni, 10 giorni e 60 giorni dopo lo schiacciamento nervoso da topi adulti. Le NMJ sono state identificate marcando gli assoni e i terminali motori (SV2 per le vescicole sinaptiche più 2H3 per i neurofilamenti; ciano), le cellule di Schwann (anti-S100 B; giallo) e gli AChR (α-BTX; magenta) (B). I pannelli inferiori mostrano separatamente gli assoni del motore (pannelli di sinistra) e i canali AChR (pannelli di destra). Sono state disegnate forme grigie per delimitare la posizione dei domini postsinaptici e valutare lo stato di innervazione. Barre di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66706/66706fig03.jpg"> Figura 3: Protocolli combinati di elettroporazione in vivo e lesioni da schiacciamento nervoso. Il muscolo LAL è stato elettroporato con un plasmide codificante per la proteina tdTomato (rosso). Il ramo auricolare posteriore del nervo facciale è stato schiacciato 3 giorni dopo l'elettroporazione. Dopo 9 giorni, il muscolo LAL è stato sezionato (A) e i componenti pre e postsinaptici sono stati identificati marcando gli assoni e i terminali motori (SV2 più anticorpi 2H3, ciano) e AChR (α-BTX; magenta) (B). Sono indicati un NMJ denervato (punta di freccia verde) e un NMJ reinnervato (freccia gialla). Quantificazione della proporzione di fibre positive per l'espressione proteica di tdTomato (barra sinistra) e della proporzione di domini postsinaptici entrati in contatto con un assone motorio rigenerato (barra destra) (C). I risultati rappresentano il SEM medio ± di N: 3 topi per gruppo. Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66706/66706fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Elettroporazione combinata in vivo e reinnervazione a breve termine del muscolo scheletrico elevatore cranico Auris Longus

The neuromuscular junction (NMJ) is the peripheral synapse controlling the contraction of skeletal muscle fibers to allow the coordinated movement of many ...

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Si descrivono le modalità di somministrazione ripetuta di inibitori di segnalazione muscarinici a lungo del muscolo elevatore dell'ano Auris (LAL), muscolo di topi adulti giovani e per immunocolorazione successive delle sue giunzioni neuromuscolari (NMJs) in wholemounts. Il muscolo LAL ha vantaggi unici per...

Somministrazione sottocutanea di antagonisti muscarinici e Triple-immunocolorazione del lungo muscolo elevatore Auris in topi

Cartilagini craniofacciali sviluppare a stretto contatto con altri tessuti e sono difficili da manipolare di animali vivi. Stiamo usando elettroporazione per fornire strumenti molecolari durante la crescita dello scheletro cranio-facciale, mentre bypassando primi effetti embrionale. Questo approccio ci permetterà di testare in modo efficiente molecole...

Elettroporazione di Mesenchima craniofacciale

Cellule ensheathing olfattive (OECs) sono cellule della cresta neurale che permettono la crescita dei neuroni olfattivi primari. Questa proprietà specifica può essere utilizzato per il trapianto cellulare. Presentiamo qui un modello di trapianto cellulare basata sull'uso di OECs in un modello di lesione del nervo laringeo.

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

L'uso del nervo masseterico come nervo donatore rappresenta un'alternativa a un solo stadio alla procedura standard a due stadi di innesto del nervo facciale incrociato e trasferimento muscolare libero nella paralisi facciale. Forniamo una descrizione dettagliata per eseguire in sicurezza questa tecnica con un trasferimento muscolare gracile e discutiamo indicazioni e limitazioni.

Single-stage dinamico Rianimazione del Sorriso in Irreversible paralisi facciale da Free Transfer Muscle funzionale

Il protocollo descritto in questo documento utilizza il muscolo di longus di levator auris (LAL) del mouse per registrare spontanea e nervo-evocata potenziali postsinaptici (corrente-clamp) e correnti (tensione-clamp) alla giunzione neuromuscolare. Utilizzo di questa tecnica può fornire spunti chiave nei meccanismi della trasmissione sinaptica in condizioni normali e malattia.

Levator Auris Longus Preparazione per l'esame della trasmissione neuromuscolare dei mammiferi sotto condizioni di morsetto di tensione

Modelli animali di impianti cocleari possono far progredire le conoscenze delle basi tecnologiche di trattare la perdita permanente dell'udito neuro-sensoriale con stimolazione elettrica. Questo studio presenta un protocollo chirurgico per assordante acuta e l'impianto cocleare di un array di elettrodi in topi come pure la valutazione funzionale con risposta uditiva del tronco cerebrale.

Chirurgia di impianto cocleare e registrazioni di risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale in topi C57BL/6

L'elettroporazione è un approccio efficace per trasportare geni degli interessi nelle cellule. Applicando questo approccio in vivo sui neuroni del ganglio di topo adulto radice dorsale (DRG), descriviamo un modello per lo studio di rigenerazione dell'assone in vivo.

Inquirenti rigenerazione dell'assone dei mammiferi: In Vivo elettroporazione del ganglio di radice dorsale del topo adulto

Questo protocollo descrive un approccio riproducibile alla chirurgia del nervo facciale nel modello del ratto, comprese le descrizioni di vari modelli inducibili di lesioni.

Chirurgia del nervo facciale nel modello di ratto per studiare l'inibizione assonale e la rigenerazione

Presentato qui è un protocollo per la produzione di un sistema impiantabile per la registrazione cronologica in vivo di potenziali elettromiografici evocati e spontanei. Il sistema viene applicato allo studio della reinnervazione dei muscoli lariangici in seguito a lesioni nervose.

Un sistema impiantabile per l'elettromiografia cronica in vivo

Le lesioni da perdita muscolare volumetrica (VML) superano la capacità rigenerativa endogena, con conseguente deficit funzionale permanente. L'attuale ricerca VML si concentra principalmente sui muscoli degli arti e del tronco. Per estendere gli studi meccanicistici della VML ai muscoli craniofacciali, questo articolo descrive un metodo in vivo per la valutazione longitudinale della funzione del muscolo massetere pre e post-lesione VML.

Valutazione funzionale in vivo del muscolo massetere del ratto dopo la creazione chirurgica di una lesione da perdita muscolare volumetrica (VML)

Impara l'elettroporazione in vivo combinata alla denervazione del muscolo LAL nei topi per studiare la rigenerazione delle sinapsi neuromuscolari e il ruolo delle proteine muscolari nella stabilizzazione dei recettori postsinaptici.

Elettroporazione combinata in vivo e reinnervazione a breve termine del muscolo scheletrico elevatore cranico Auris Longus

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