Name: Trasfezione di un clone molecolare di rDNA di Naegleria gruberi in trofozoiti di N. gruberi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Scopri la metodologia di trasfezione stabile in trofozoiti di Naegleria gruberi utilizzando elementi CERE. Questo protocollo permette di studiare la replicazione del DNA ribosomico extracromosomico circolare.

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Questi studi sono stati parzialmente finanziati da una sovvenzione del George F. Haddix Fund della Creighton University (KMD). La Figura 1 viene generata in biorender.com e la Figura 3 viene generata in benchling.com.

I dettagli delle specie, dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali. La sequenza del costrutto pGRUB di 17.004 coppie di basi è fornita nel File supplementare 1.
1. Allevamento di trofozoiti
<ol><li>Scongelare i trofozoiti di N. gruberi congelati a 37 °C per 3 min.</li>
	<li>Inoculare i trofozoiti in fiasche T25 in peptone/estratto di lievito/acido nucleico/acido folico/emina modificati con il 10% di siero fetale di vitello (PYNFH) più il 2% di tampone (fosfato disodico, fosfato monobasico di potassio).</li>
	<li>Coltivare i trofozoiti a 25 °C fino a ~80% confluenti, dove mostrano una morfologia ameboide (Figura 2A). NOTA: Quando si fa inizialmente rivivere una coltura di trofozoiti dal loro stato congelato, possono essere necessari fino a 5-7 giorni prima che un T25 diventi confluente. Decantare il supporto ogni 3-4 giorni e sostituirlo con un supporto nuovo.</li>
	<li>Posizionare i palloni confluenti sul ghiaccio per 5-10 minuti per rilasciare i trofozoiti aderiti dalla plastica. Agitare delicatamente il pallone per rimuovere le cellule aderenti rimanenti. I trofozoiti hanno ora una morfologia "arrotondata" (Figura 2B).</li>
	<li>Suddividere le colture da 1:2 a 1:4 in nuovi flaconi per colture tissutali.</li>
	<li>Rimuovere il PYNFH e sostituirlo con mezzi di incistamento sterili (120 mM di cloruro di sodio, 0,03 mM di cloruro di magnesio, 1 mM di fosfato disodico, 1 mM di fosfato monobasico di potassio, 0,03 mM di cloruro di calcio, 0,02 mM di cloruro di ferro, pH 6,8)22 per incistare il N. gruberi. NOTA: La maggior parte dei trofozoiti diventa incistata entro 72 ore (Figura 2C). L'escussione deve essere completata entro 72 ore.</li>
	<li>Rimuovere le cisti dai palloni, centrifugare a 600 x g per 10 minuti a 20 °C e risospendere le cisti in terreno PYNFH con il 10% di siero fetale di vitello per asportare le cellule. Incubare a 25 °C per 24 ore fino a quando i trofozoiti iniziano a emergere.</li>
</ol>2. Trasfezione dei trofozoiti
<ol><li>Preparare i trofozoiti in una piastra di coltura tissutale a fondo piatto a 6 pozzetti (1 mL di 1 x 106 trofozoiti/mL) e coltivare a 25 °C.</li>
	<li>Trasfettare le cellule quando raggiungono il 70%-80% di confluenza (~10,4 x 104 cellule/cm2 in cluster a 6 pozzetti). Riscaldare il reagente di trasfezione a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
	<li>Preparare la miscela di reagenti plasmidico-trasfezione come segue: 75 ng di DNA plasmidico e 0,225 μL di reagente di trasfezione in 200 μL di terreno PYNFH senza FBS. Preparare una miscela di reagenti plasmide-trasfezione sufficiente per eseguire la trasfezione in duplicato. NOTA: In questo studio è stato utilizzato un plasmide batterico contenente un clone completo di N. gruberi CERE (pGRUB). Il plasmide vuoto (pGEM) è stato utilizzato come controllo negativo (Figura 3).</li>
	<li>Incubare la miscela di reagenti plasmidi-trasfezione a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
	<li>Rimuovere ~800 μL di terreno dai monostrati di trofozoite appena prima della trasfezione.</li>
	<li>Mettere la miscela di reagenti plasmidi-trasfezione sui trofozoiti.</li>
	<li>Agitare delicatamente la lastra ogni 15 minuti per evitare che il supporto si aggreghi ai bordi della lastra.</li>
	<li>Lavare i monostrati una volta con 2 mL di terreno di crescita dopo 1 ora di incubazione a 25 °C.</li>
	<li>Trattare i monostrati con 10 U DNasi in 1 mL di tampone DNasi 10x per 15 minuti a 37 °C per rimuovere il DNA plasmidico residuo, lavare una volta con terreno di crescita, aggiungere 2 mL di terreno fresco e posizionare a 25°C. Incubare la piastra per 24-36 ore.</li>
	<li>Mettere la piastra sul ghiaccio per 10 minuti per rilasciare le cellule.</li>
	<li>Dividi un pozzo (1:2) in due nuovi pozzi.</li>
	<li>Raccogli i trofozoiti dai pozzi rimanenti per scopi sperimentali. NOTA: tutte le impostazioni cultura vengono eseguite in duplicato. Per ogni condizione, 1 pozzetto viene utilizzato per il passaggio e 1 viene utilizzato per l'isolamento CERE.</li>
</ol>3. Isolamento di CERE da Naegleria
<ol><li>Calcolare il numero di trofozoiti in ciascun pozzetto utilizzato per l'isolamento CERE mediante colorazione di esclusione con blu di tripano e un emocitometro23.</li>
	<li>Mettere i trofozoiti in una provetta da 2,0 mL.</li>
	<li>Lavare i trofozoiti una volta ogni 100 mM di cloruro di sodio (pH 7,5) mediante centrifugazione (600 x g, 10 min, 4 °C). NOTA: Il cloruro di sodio impedisce ai trofozoiti di aderire ai lati del tubo.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 100 μL di EDTA 100 mM (pH 7,5).</li>
	<li>Mettere la provetta in un blocco termico per 15 minuti a 98 °C per lisare le cellule e inattivare gli enzimi nei trofozoiti. NOTA: Questo passaggio inattiva le DNasi, che sono abbondanti nei trofozoiti di Naegleria . Le DNasi possono interferire con la capacità di rilevare il CERE nativo e il clone molecolare nella fase 4. La resa del DNA diminuisce quando vengono utilizzate oltre ~3 x 106 celle nel passaggio 3.4.</li>
	<li>Centrifugare le provette alla massima velocità (16.000 x g) a 4 °C per 10 minuti per pellettare i detriti.</li>
	<li>Trasferire i surnatanti in una nuova provetta.</li>
	<li>L'etanolo precipita i surnatanti con 0,5 volumi di acetato di ammonio 7,5 M (pH 7,5), 3 volumi di etanolo assoluto e 1 μL di glicogeno 10 mg/mL come vettore.</li>
	<li>Capovolgere la provetta più volte e posizionarla a -80 °C per almeno 1 ora o durante la notte.</li>
	<li>Riscaldare i campioni a temperatura ambiente.</li>
	<li>Centrifugare le provette a temperatura ambiente per 10 minuti a 16.000 x g.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante e lavare il pellet con etanolo al 70% mediante centrifugazione per 5 minuti a 16.000 x g (a temperatura ambiente).</li>
	<li>Rimuovere l'etanolo e asciugare il pellet all'aria per 5 minuti.</li>
	<li>Risospendere il pellet essiccato in acqua deionizzata sterile (DI). Normalizzare il volume a 10.000 trofozoiti per μL.</li>
	<li>Conservare a -80 °C fino all'uso in PCR.</li>
</ol>4. Rilevamento PCR di trofozoiti trasformati
<ol><li>Utilizzare 20.000 cellule equivalenti di DNA, primer da 600 nM (Tabella 1) e Taq polimerasi ed eseguire la PCR24. NOTA: I primer che distinguono tra CERE nativo e CERE clonato sono elencati nella Tabella 1, così come le condizioni di PCR. La Figura 3 mostra la posizione degli inneschi sui costrutti. La PCR richiederà un'ottimizzazione a seconda dei primer utilizzati e della specifica miscela PCR utilizzata.</li>
	<li>Microonde 0,8% di agarosio in 1x Tris base, acido acetico e tampone EDTA (TAE) fino a quando l'agarosio non si è sciolto.</li>
	<li>Raffreddare l'agarosio a ~50 °C a temperatura ambiente.</li>
	<li>Versare la soluzione in una vaschetta di colata di gel contenente un pettine per formare dei pozzetti.</li>
	<li>Lascia riposare il gel a temperatura ambiente fino a quando non si sarà solidificato.</li>
	<li>Posizionare il gel nell'apparecchio per elettroforesi.</li>
	<li>Decantare 1x TAE nella camera di elettroforesi fino a coprire il gel.</li>
	<li>Rimuovere il pettine.</li>
	<li>Aggiungere 6 coloranti di caricamento (0,25% blu di bromfenolo, 0,25% xilene cianolo, 30% glicerolo) ai campioni e caricare il gel. Utilizzare una scala del DNA per determinare le dimensioni del prodotto PCR.</li>
	<li>Collegare l'elettrodo, accendere l'alimentatore e far funzionare il gel a 80 V per ~1,5-2 ore.</li>
	<li>Spegnere l'alimentazione e rimuovere il gel.</li>
	<li>Colorare il gel con colorante DNA (ad es. 10 μL di 10 mg/mL di bromuro di etidio) in 100 mL di acqua deionizzata per 10 minuti.</li>
	<li>Lasciare il gel per 20 minuti in acqua deionizzata.</li>
	<li>Visualizza il gel su un sistema a luce ultravioletta (UV) e documenta i risultati.</li>
</ol>

Utilizzo di un vettore basato su CERE per la trasfezione dei trofozoiti di Naegleria gruberi

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<li>De Jonckheere, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+research+on+the+Amoeboflagellate+genus+Naegleria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Protozool%22%5BJournal%5D)">A century of research on the Amoeboflagellate genus Naegleria.</a> Acta Protozool. 41, 309-342 (2002).</li>
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</ol>

Non sono stati dichiarati conflitti di interesse finanziari.

Il protocollo qui delineato è molto semplice, anche se ogni costrutto richiederà probabilmente un certo grado di ottimizzazione, in particolare del rapporto reagente DNA-trasfezione, a seconda della natura del costrutto e della specie di Naegleria utilizzata. Abbiamo testato solo un reagente di trasfezione disponibile in commercio utilizzando questo protocollo, ma è probabile che molti altri possano essere efficaci. Dato che viene utilizzato un clone a lunghezza intera del CERE, contenente un'origine funzionale di replicazione e quindi replicante autonomamente, il costrutto possiede tutti i necessari meccanismi di replicazione eucariotica. Se un clone parziale dovesse essere inserito nel vettore pGEM, si prevede che il clone trasfettato andrà perso molto presto dopo la trasfezione se non contiene un'origine eucariotica funzionale della replicazione, simile al vettore pGEM vuoto (Figura 2B). Inoltre, questi dati dimostrano che la presenza di DNA procariotico non interferisce con la capacità del clone molecolare di essere trattenuto dal trofozoite.
Sebbene sia stato riportato un caso di trasfezione di N. gruberi trofozoiti 25, l'inserto utilizzato nel presente studio è considerevolmente più grande (~17 kbp) rispetto a quello trasfettato nello studio precedente (<1 kbp). Sebbene non sia noto quale sia la dimensione massima del plasmide che può essere tollerata dalla Naegleria, dati non pubblicati dal nostro laboratorio hanno determinato che le amebe di un altro genere (Willaertia) contengono CERE di circa 24 kbp.
Un passo fondamentale per garantire che questo protocollo rilevi il DNA all'interno del trofozoite è la fase di trattamento con DNasi (fase 2.9), che garantisce che il DNA residuo (cioè il DNA che non è stato trasfettato) venga eliminato dalle colture. Sono state eseguite un paio di procedure di controllo della qualità per garantire l'integrità del protocollo. In primo luogo, i costrutti sono stati sequenziati. In secondo luogo, i prodotti della PCR sono stati sequenziati per confermarne l'identità e garantire che non vi fosse contaminazione del test e hanno confermato che i prodotti della PCR non erano il risultato di un mispriming.
Mentre è stata dimostrata la trasfezione di successo di un plasmide con un'origine eucariotica di replicazione, è chiaro dalla Figura 4 che c'è una diminuzione del segnale PCR dopo il primo passaggio dei trofozoiti. La qPCR è stata eseguita sui trofozoiti trasfettati nel corso del tempo ed è stato determinato che il livello di pGRUB scende da circa 1.600 copie nel passaggio 1 a 35 nel passaggio 7 (dati non mostrati), indicando che il plasmide trasfettato sarà probabilmente perso entro i prossimi passaggi. Questo non è inaspettato, poiché il plasmide trasfettato è estraneo ai trofozoiti e sarebbe visto come non necessario o dannoso per la sopravvivenza dell'ameba.
C'è una fondamentale mancanza di conoscenza riguardo al CERE della Naegleria. La maggior parte delle sequenze CERE in GenBank sono sequenze parziali, con l'attenzione principale rivolta all'rDNA e alle regioni dello spaziatore trascritto interno (ITS), che vengono utilizzate per identificare il genere (ITS1) e la specie (ITS2)1,26,27. Mentre la sequenza delle subunità di rDNA è altamente conservata tra Naegleria sp., l'NRS della Naegleria sp. Varia notevolmente, sia in termini di dimensioni che di sequenza, da circa 5,5 kbp a 10 kbp 1,15,16,17,18,19,20. La funzione della NRS in Naegleria è in gran parte un territorio inesplorato, ma si presume che contenga elementi regolatori tra cui, ma non solo, un'origine di replicazione, un promotore e una sequenza di terminazione17. Sulla base delle sequenze CERE complete in GenBank, una caratteristica comune di Naegleria CERE è la presenza di regioni ripetute nella NRS che sono ricche di A-T. La funzione di queste regioni è attualmente sconosciuta.
La capacità di trasfettare i trofozoiti di Naegleria consente lo studio di diversi aspetti della biologia NRS di CERE, in particolare le dinamiche e i requisiti della replicazione di CERE. In Escherichia coli, i G-quadruplex sono stati identificati nelle regioni promotrici di alcuni geni28. Le strutture G-quadruplex sono state identificate anche nei promotori di un'ampia varietà di eucarioti, tra cui topi, ratti, esseri umani e primati non umani29. L'analisi in silico di diverse sequenze CERE a lunghezza intera dimostra che si prevede che più aree della NRS formino strutture G-quadruplex. Un'area di strutture G quadruplex previste nell'NRS di diversi Naegleria sp. è a monte dell'inizio del gene 18S. La capacità di trasfettare i trofozoiti consentirebbe di esplorare l'identificazione della regione promotrice dell'rDNA nel CERE di Naegleria mediante la cancellazione/mutazione delle sequenze a monte dell'rDNA. Allo stesso modo, studi simili potrebbero essere condotti per identificare le sequenze che terminano la trascrizione dell'rDNA.
La ritenzione del CERE a lunghezza intera nei trofozoiti per un certo numero di passaggi consentirà studi che si concentreranno sull'identificazione dell'area minima della NRS necessaria per la replicazione del CERE. Mentre una regione del CERE è stata identificata come l'origine putativa della replicazione20, non è noto se siano necessarie strutture secondarie al di fuori della regione per la replicazione del CERE o se la regione possa essere significativamente troncata e l'ori rimanga funzionale. Gli elementi ripetitivi nella NRS si trovano in tutte le Naegleria sp. sequenziate fino alla data 15,16,17,18,19,20. Lo scopo di queste sequenze è attualmente sconosciuto. Non si sa ancora se esistano come elemento regolatorio, o se vengano eliminati, se il CERE si replicherà nei trofozoiti. Le sequenze ripetitive sono specie-specifiche in Naegleria, ma non è noto se le sequenze di una specie possano funzionare in un'altra. In breve, ci sono una miriade di domande riguardanti la biologia CERE che ora possono essere affrontate utilizzando la tecnica qui descritta.

Il genere Naegleria contiene oltre 45 specie, anche se è improbabile che tutti i membri della specie siano stati identificati1. La Naegleria può esistere in diverse forme: come trofozoiti (amebe), come flagellati o, quando le risorse sono fortemente limitate, come cisti 1,2,3,4. Il genere Naegleria è noto per la sua specie particolarmente pericolosa, Naegleria fowleri, nota come "l'ameba mangia-cervello" (recensita in 1,2,3,4,5,6,7), che è la causa della meningoencefalite amebica primaria quasi universalmente fatale.
Naegleria codifica il loro rDNA sul CERE situato nel nucleolo. Il sequenziamento completo dei genomi di tre specie di Naegleria conferma l'assenza di rDNA nel genoma nucleare 8,9,10,11. Sulla base delle limitate sequenze CERE a lunghezza intera, il CERE varia da circa 10 kbp a 18 kbp di lunghezza. I CERE di ogni specie di Naegleria portano un singolo cistrone di rDNA (contenente il DNA ribosomiale 5,8, 18 e 28S) su ciascuno dei circa 4.000 CERE per cellula 12,13,14. Oltre all'rDNA, ogni CERE ha una grande sequenza non di rDNA (NRS). Le dimensioni del CERE variano da specie a specie; le differenze sono dovute principalmente alla lunghezza variabile dell'NRS, poiché le sequenze di rDNA sono altamente conservate in tutto il genere 1,15,16,17,18,19,20. La mappatura di una singola origine della replicazione del DNA all'interno di N. gruberi CERE NRS21 fornisce un forte supporto all'ipotesi che Naegleria CERE si replichi indipendentemente dal genoma nucleare.
N. gruberi è un'ameba non patogena spesso utilizzata per studiare la biologia della Naegleria . Abbiamo sviluppato una metodologia per trasformare i trofozoiti di N. gruberi con un clone di CERE della stessa specie per testare l'ipotesi che le amebe Naegleria tollerino e replichino indipendentemente il CERE all'interno dei trofozoiti. Ciò è stato ottenuto trasformando N. gruberi con un clone completo di N. gruberi CERE in trofozoiti e seguendo i destini del clone CERE donatore mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). Una panoramica generale del protocollo è illustrata nella Figura 1. I dati qui presentati dimostrano che il clone donatore può essere rilevato attraverso almeno sette passaggi in coltura tissutale, nonché essere mantenuto attraverso incistamento ed escissione. Questi studi costituiscono la base per analizzare il modo in cui CERE si replica, nonché per esplorare il suo uso come vettore per trasfettare Naegleria.

<table><tbody><tr><td>Agarosio</td><td>Bio Rad</td><td>161-3102</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A-7330</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>Fiasche per coltura di ghiaccio</td><td></td><td></td> tritato, piastra di coltura T-75 Thermo Scientific 130190<td></td></tr>, <tr><td></td> 6 pozzetti Corning 3506 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D-4527</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0,5 m</td><td>Affymetrix</td><td>15694</td><td></td></tr><tr><td>Apparecchio su gel per elettroferesi</td><td>Amersham Biosciences</td><td>80-6052-45</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf, 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo, 100%</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E-8751</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>Acido folico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7876-25G</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus Ladder</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico glaciale</td><td>Fisher Scientific</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Blocco riscaldante</td><td>Thermo Scientific</td><td>88871001</td><td></td></tr><tr><td>Ematocitometro</td><td>Hausser</td><td>Scientific 1483</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>51280</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di ferro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>372870-256</td><td></td></tr><tr><td>Ligasi</td><td>NEB</td><td>M2200S</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di Magneisum</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>MySpin 12</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>TMS</td><td></td></tr><tr><td>N. gruberi</td><td>ATCC</td><td>30224</td><td></td></tr><tr><td>Acido nucleico</td><td>Chem Impex Int' l</td><td>#01625</td><td></td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Gibco</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>pGEM</td><td>Promega</td><td>P2251</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di potassio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-500G</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Elettroforesi Unità di alimentazione</td><td>Bio Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>MCB Reagenti</td><td>SX0420</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio, bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2554</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga da tavolo</td><td>eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Tris, base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue, 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Reagente ViaFect</td><td>Promega</td><td>E4981</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia</td><td>Denver Instruments</td><td>APX-60</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Gibco</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

trasfezione di un clone molecolare di rdna di naegleria gruberi in trofozoiti di n. gruberi

Transfection of a Molecular Clone of Naegleria gruberi rDNA into N. gruberi Trophozoites

Tutti i geni ribosomiali dei trofozoiti di Naegleria sono mantenuti in un elemento circolare chiuso contenente DNA ribosomiale extracromosomico (rDNA) (CERE). Mentre si sa poco sul CERE, un'analisi completa della sequenza del genoma di tre specie di Naegleria dimostra chiaramente che non ci sono cistrroni di rDNA nel genoma nucleare. Inoltre, una singola origine di replicazione del DNA è stata mappata nel CERE di N. gruberi , supportando l'ipotesi che il CERE si replichi indipendentemente dal genoma nucleare. Questa caratteristica del CERE suggerisce che potrebbe essere possibile utilizzare il CERE ingegnerizzato per introdurre proteine estranee nei trofozoiti di Naegleria . Come primo passo nell'esplorazione dell'uso di un CERE come vettore in Naegleria, abbiamo sviluppato un protocollo per trasfettare N. gruberi con un clone molecolare di N. gruberi CERE clonato in pGEM7zf+ (pGRUB). Dopo la trasfezione, pGRUB è stato prontamente rilevato nei trofozoiti di N. gruberi per almeno sette passaggi, nonché attraverso incistamento ed escissione. Come controllo, i trofozoiti sono stati trasfettati con il vettore backbone, pGEM7zf+, senza le sequenze di N. gruberi (pGEM). Il pGEM non è stato rilevato dopo il primo passaggio successivo alla trasfezione in N. gruberi, indicando la sua incapacità di replicarsi in un organismo eucariotico. Questi studi descrivono un protocollo di trasfezione per i trofozoiti di Naegleria e dimostrano che la sequenza plasmidica batterica in pGRUB non inibisce la trasfezione e la replicazione del clone CERE trasfettato. Inoltre, questo protocollo di trasfezione sarà fondamentale per comprendere la sequenza minima del CERE che guida la sua replicazione nei trofozoiti, nonché per identificare le regioni regolatorie nella sequenza non ribosomiale (NRS).

La PCR dei trofozoiti che sono stati trasfettati con pGRUB dimostra che il CERE trasfettato viene rilevato attraverso almeno sette passaggi dei trofozoiti, nonché incistamento ed escisto (Figura 4). I primer utilizzati nella PCR ricottura sia al vettore pGEM che alla sequenza CERE, garantendo così che la PCR non rilevi il CERE nativo. La PCR dopo la trasfezione di pGEM in trofozoiti ha indicato che pGEM era negativo (Figura 4), indicando che il plasmide vuoto non era trattenuto dalle amebe. La Figura 4 dimostra che il pGEM è stato perso al primo passaggio - i passaggi successivi, l'incistamento e l'escesto erano tutti negativi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig01v3.jpg"> Figura 1: Diagramma di flusso della procedura di trasfezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig02.jpg"> Figura 2: Trofozoiti di N. gruberi (ceppo NEG-M) in coltura. (A) In condizioni di coltura standard a 25 °C, i trofozoiti di N. gruberi hanno una morfologia ameboide e aderiscono alle fiasche/piastre di coltura. La freccia indica uno pseudopode che viene utilizzato per spingere il trofozoite in modo direzionale. (B) In seguito all'incubazione della coltura di N. gruberi sul ghiaccio, i trofozoiti diventano rotondi nella morfologia e non aderenti. (C) Dopo l'incubazione in mezzi di incistamento per 24-48 ore, i trofozoiti di N. gruberi vengono incistati. Barre di scala: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig03.jpg"> Figura 3: costrutto pGRUB utilizzato per trasfettare N. gruberi (NEG-M). Il CERE a lunghezza intera di N. gruberi (ceppo EBM, 14.007 bp; rosso) è stato clonato in pGEM7Zf(+) (2.997 bp; verde), risultando in un costrutto di 17.004 bp. Le frecce su ciascun plasmide indicano la posizione dei primer PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66726/66726fig04.jpg"> Figura 4: Risultati della PCR che rilevano pGRUB e pGEM trasfettati nei trofozoiti di N. gruberi . La PCR dimostra che pGRUB viene rilevato nei trofozoiti trasfettati attraverso almeno sette passaggi, l'incistamento (En) e l'escisto (Ex). pGEM viene perso dopo il primo passaggio dei trofozoiti. P1 = passaggio 1, P7 = passaggio 7. I controlli negativi (neg) non hanno ricevuto DNA nella PCR, mentre i controlli positivi (pos) sono pGRUB o pGEM inseriti nella PCR. Le dimensioni previste del prodotto sono 656 bp (pGRUB) e 337 bp (pGEM). Le figure a sinistra del pannello A indicano la dimensione delle bande più luminose della scala del DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/66726fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Nome del primer</td>
			<td colspan="2">Sequenza - 5'-&gt;3'</td>
			<td>Tm</td>
			<td>Dimensioni del prodotto</td>
		</tr><tr><td>pGEM-forward</td>
			<td colspan="2">CTCTTCGCTATTACGCCAGC</td>
			<td>54</td>
			<td>337 barili</td>
		</tr><tr><td>pGEM-inverso</td>
			<td colspan="2">TTGTGTGGAATTGTGAGCGG</td>
			<td></td>
			<td>337 barili</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-forward</td>
			<td colspan="2">AGCCCCCGATTTAGAGCTTG</td>
			<td>60.5</td>
			<td>656 barili</td>
		</tr><tr><td>pGRUB-inverso</td>
			<td colspan="2">TCGGCTAGAAATGAAGTGAGGAC</td>
			<td></td>
			<td>656 barili</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Primer PCR e condizioni utilizzate in questi studi.
File supplementare 1: La sequenza del costrutto pGRUB di 17.004 coppie di basi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66726/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Questo protocollo descrive una metodologia per trasfettare i trofozoiti di Naegleria gruberi con un costrutto che viene mantenuto per tutta la durata del passaggio dei trofozoiti in vitro, nonché attraverso l'incistamento e l'escissione.

Trasfezione di un clone molecolare di rDNA di Naegleria gruberi in trofozoiti di N. gruberi

All ribosomal genes of Naegleria trophozoites are maintained in a closed circular extrachromosomal ribosomal DNA (rDNA) containing element (CERE). While ...

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