Name: Sistemi in vitro di co-coltura per riprodurre il ciclo cancro-immunità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Scopri i sistemi di co-coltura in vitro per studiare il ciclo cancro-immunità usando modelli tumor-on-a-chip e citometria a flusso. Questo metodo offre un approccio semplice ed economico per monitorare le interazioni tra cellule tumorali e immunitarie.

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Monitoraggio del ciclo cancro-immunità basato sulla citometria a flusso 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il monitoraggio della risposta immunitaria antitumorale è della massima importanza per chiarire e comprendere le intricate interazioni molecolari e cellulari che agiscono nel TME e supportano una costante battaglia per la supremazia23. Qui, descriviamo in dettaglio un semplice protocollo assistito da mFC e ToC per il monitoraggio e la caratterizzazione delle fasi che costituiscono il ciclo cancro-immunità. Con piccole variazioni, questo protocollo, basato su linee cellulari murine e cellule immunitarie derivate dal topo, può essere adattato sia alle linee tumorali umane immortalizzate che anche a quelle primarie e alle cellule immunitarie umane derivate dal sangue periferico. Inoltre, combinando l'inibizione genetica o farmacologica di specifiche vie e i loro controlli appropriati per i loro affini, questo protocollo consente l'identificazione di biomarcatori che regolano l'immunosorveglianza e, quindi, la risposta alle terapie immunogeniche e immunitarie.
La mFC consente l'analisi ad alto rendimento di diversi parametri immunitari e combina la capacità di analizzare milioni di cellule in breve tempo con la possibilità di identificare eventi rari, valutare la proliferazione e la morte cellulare, rilevare più parametri contemporaneamente in un piccolo volume di campioni e consente di eseguire analisi molecolari e funzionali a valle Selezione cellulare post-fluorescenza9. Queste caratteristiche, insieme al basso costo, hanno favorito l'accessibilità e l'ampio utilizzo delle mFC nei laboratori di ricerca e clinici. Ciononostante, permangono alcune importanti limitazioni. In primo luogo, l'analisi mFC richiede la dissociazione tissutale per ottenere sospensioni di singole cellule durante la preparazione del campione, distruggendo così le informazioni spaziali del tessuto tumorale. L'avvento delle tecnologie spaziali nell'ultimo decennio, tra cui la trascrittomica spaziale ad alto plex, la proteomica e l'epigenomica, ha ampliato la nostra capacità di profilare il TME analizzando la posizione delle cellule tumorali, immunitarie e stromali e le loro reciprocheinterazioni 24. In secondo luogo, l'mFC consente il rilevamento di un massimo di sedici (circa) parametri contemporaneamente e quindi non copre tutti i marcatori di stato di identificazione, maturazione e attivazione delle cellule in un singolo campione. Anche in questo caso, le tecnologie all'avanguardia di cui sopra consentono il rilevamento di un massimo di cento parametri contemporaneamente a risoluzione di una singola cellula e persino subcellulare, come anche prima del 25,26,27. In terzo luogo, il monitoraggio immunitario degli studi longitudinali e comparativi richiede protocolli riproducibili e la standardizzazione di ogni fase del flusso di lavoro, compresa l'acquisizione e l'analisi dei dati. Il gating manuale convenzionale può essere soggettivo e la manutenzione degli strumenti e i controlli di qualità possono variare, il che influisce sull'estrazione e sull'interpretazione dei dati. L'acquisizione automatizzata e i plug-in che implementano l'analisi dei dati aiutano a ridurre al minimo la variabilità dei dati28.
I ToC stanno guadagnando un'enorme attenzione nella ricerca sul cancro per la loro capacità di replicare da vicino diversi tratti distintivi del TME e di sostituire, almeno in alcuni contesti sperimentali, i tumori in vivo 12. Pur fornendo un modello abbastanza realistico dell'architettura del tessuto tumorale, della complessità multicellulare e dell'interazione dinamica tra i componenti cellulari del TME, i ToC non sono ancora in grado di sostituire completamente gli studi sugli animali in termini di riflessione della complessità delle risposte immunitarie sistemiche, in particolare la serie di meccanismi responsabili dell'emergere di passaggi limitanti la velocità per ciascuna delle fasi del ciclo cancro-immunità12. 29. Al di là di questo aspetto, il campo dell'onco-immunologia continuerà a trarre vantaggio dall'uso dei ToC, poiché i cicli e la velocità dell'innovazione scientifica li stanno rendendo sempre più vicini ai modelli in vivo 12.
In conclusione, il protocollo qui descritto funge da potente e semplice strumento analitico e di scoperta per svelare le complessità dinamiche del TME. Inoltre, le caratteristiche relative ai tempi e ai costi di questo protocollo, ne consentono la fattibilità su larga scala. La sfida da affrontare è quella di standardizzarlo per l'uso clinico per informare e guidare meglio le decisioni terapeutiche per i pazienti oncologici.

Negli ultimi decenni, l'immunoterapia è stata in prima linea tra le opzioni all'avanguardia per il trattamento del cancro. Lo sfruttamento del sistema immunitario con scopi antitumorali ha fornito una potente prova di concetto a beneficio del paziente in diverse neoplasie ematologiche e solide con prognosi storicamente sfavorevoli. Poiché l'immunoterapia sta offrendo un'opportunità per tumori altrimenti difficili da trattare, sta registrando un ritmo di progresso sorprendentemente rapido. Tali progressi possono essere, almeno in parte, attribuiti alla raffinata comprensione dell'interazione tra cellule tumorali e cellule immunitarie. Questa interazione assomiglia a un "motore" feed-forward che il sistema immunitario accende per distruggere le cellule tumorali, il cosiddetto ciclo cancro-immunità. Questa risposta immunitaria antitumorale progredisce attraverso tre livelli principali: riconoscimento, elaborazione e reazione. In primo luogo, nella fase di riconoscimento, gli antigeni tumorali (Ag) prodotti durante la formazione del tumore vengono rilasciati dalle cellule tumorali morenti nel microambiente tumorale (TME, fase 1) e inghiottiti dalle cellule dendritiche infiltranti il tumore (DC, fase 2). Successivamente, nella fase di elaborazione, le DC presentano gli epitopi dell'Ag tumorale catturato attraverso le molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC), esprimono sulla loro superficie livelli più elevati di molecole costimolatorie (fase 3) e si spostano verso i linfonodi drenanti il tumore (dLN) per presentare in modo incrociato il loro carico alle cellule T CD8 naive (CD8N, fase 4). Tutti questi passaggi convergono nel processo finale di reazione durante il quale le cellule T CD8 cross-primed (CD8C-P) specifiche per l'Ag vengono attivate, maturano in cellule T effettrici CD8 (CD8E) e subiscono un'espansione clonale (fase 5). Le celluleE CD8 lasciano quindi i dLN e si dirigono verso il TME attraverso il sangue (fase 6) dove riconoscono e si legano specificamente alle cellule tumorali attraverso l'interazione tra il loro recettore delle cellule T (TCR) e il loro tumore affine Ags, rilasciano molecole citotossiche [cioè interferone (IFN)-γ, perforine e granzimi (Grz)] e uccidono le cellule tumorali (fase 7)1, 2. L'uccisione delle cellule tumorali porta al rilascio di ulteriori Ag tumorali per alimentare il ciclo cancro-immunità. È un dato di fatto, attraverso tutti questi passaggi, il sistema immunitario distrugge e respinge le cellule tumorali molto più spesso di quanto si supponga. Tuttavia, nei pazienti oncologici, almeno uno di questi passaggi non funziona correttamente. Noi e altri abbiamo dimostrato che le cellule tumorali cercano di bloccare la risposta immunitaria evolvendosi in varianti più aggressive e immunoprivilegiate 3,4,5 o ostacolando l'efficacia delle cellule T 6,7.
La ricerca sul cancro e lo sviluppo di farmaci antitumorali si basano entrambi su modelli sperimentali che consentono lo studio della relazione tra cancro e cellule immunitarie, la cosiddetta onco-immunologia. Di seguito sono descritti modelli in vitro veloci, affidabili, riproducibili e a basso costo che riproducono in modo completo ogni fase del ciclo onco-immunologico e viene offerta una visione rapida e chiara delle caratteristiche fenotipiche e funzionali dell'immunosorveglianza e, infine, dell'immunoediting.
La citometria a flusso multiparametrica (mFC) è uno degli strumenti analitici a singola cellula di maggior successo nella ricerca fondamentale sul cancro, nella diagnosi e nella ricerca traslazionale negli studi clinici sul cancro. Poiché consente di catturare contemporaneamente più caratteristiche in ogni cellula, l'mFC si è guadagnata il suo posto come piattaforma di analisi gold standard in onco-immunologia. Abbina un'elevata sensibilità e specificità alla possibilità di misurare in modo rapido e riproducibile più pattern di espressione proteica e proprietà funzionali a livello di singola cellula da sospensioni cellulari eterogenee e persino eterotipiche, come quelle della TME 8,9,10. Poiché sia i pattern di espressione fenotipici che quelli funzionali sono sensibili al tempo, un'attenta attenzione alla progettazione dell'esperimento, alla selezione di pannelli, controlli e anticorpi titolati appropriati e all'elaborazione appropriata dei campioni e all'uso della strumentazione sono fondamentali per l'affidabilità, la comparabilità e la riproducibilità dei risultati e per interpretare con sicurezza l'esito dell'esperimento11.
I dispositivi microfluidici (ToC) tumor-on-a-chip modellano il TME consentendo la biomimetica in vitro su microscala del cancro e la dinamica delle cellule immunitarie e interagisce 12,13,14,15. In particolare, i ToC sono dispositivi di coltura cellulare microfluidica multicanale in grado di ospitare diversi tipi di cellule organizzate in contesti di coltura bidimensionali (2D) o tridimensionali (3D) e in grado di modellare con alta fedeltà e di controllare con elevata precisione unità strutturali e funzionali chiave come le interazioni cellulari eterotipiche e i flussi di gradienti chimici che si verificano fisiologicamente nel TME12. 13,14,15. In particolare, la chemioattrazione e le traiettorie immunitarie, nonché l'interazione delle cellule immunitarie con le cellule tumorali, possono essere monitorate in tempo reale e quantificate mediante microscopia time-lapse e analisi di tracciamento automatizzato 5,12,13,14,15,16. Inoltre, i ToC offrono la possibilità di analizzare e manipolare processi cruciali che regolano l'insorgenza e la progressione del cancro e la risposta alla terapia17.
In questo articolo, le mFC con i ToC sono combinati per studiare tutti i livelli della risposta immunitaria antitumorale che passa attraverso la fagocitosi mediata da DC degli Ag tumorali (passaggi 1-3), il cross-priming delle cellule T (passaggio 4), l'attivazione e l'espansione clonale (quest'ultima per mezzo della tecnologia 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU) e della cicloaddizione catalizzata da Cu(I), una metodologia altamente sensibile e accurata, fase 5), homing delle celluleE CD8 al TME (fase 6) e, infine, uccisione delle cellule tumorali mediata dalle celluleE CD8 (fase 7, Figura 1).
Questo lavoro contribuisce allo sforzo di stabilire protocolli standard semplici, veloci e affidabili per studiare il ciclo cancro-immunità. Il miglioramento e l'integrazione dei modelli mFC e ToC nella ricerca sul cancro, nelle dinamiche del TME e nella risposta alla terapia hanno un grande potenziale in quanto questi modelli forniscono fedeltà biologica insieme al controllo sperimentale. Pertanto, questo protocollo aiuta a ricreare, in modo graduale, il ciclo cancro-immunità, rendendo possibile caratterizzare, monitorare e manovrare tempestivamente i ruoli dei singoli attori cellulari e le loro interazioni reciproche in seguito all'immunosorveglianza naturale e acquisita. Questo in ultima analisi aiuterà a perfezionare, ridurre e sostituire gli studi sugli animali, fornendo al contempo informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e guidare l'assistenza clinica. Infine, i vantaggi e i limiti di mFC e ToC sono discussi criticamente e confrontati con le tecnologie all'avanguardia (ad esempio, analisi spaziali ad alto plex a risoluzione di singola cellula e persino sub-cellulare) per far progredire la ricerca e la terapia onco-immunologica.

<table><tbody><tr><td>Microprovette da 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>100 kV litografia a fascio elettronico</td><td>Vistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm piastre di Petri&nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>piastre a 12 pozzetti</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET3012</td><td></td></tr><tr><td>Provette da 15 e 50 mL</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352096; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; filtro cellulare m&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431750</tr><tr><td>provette in polistirolo da 5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro cellulare m&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431751</tr><tr><td>75 cm2 pallone trattato per colture cellulari</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET7076</td><td></td></tr><tr><td>Salviette adsorbenti Foglio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>di<td>allumin</td></tr><tr><td>anti-topo CD107a (LAMP-1) Anticorpo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo CD25 (7D4) Anticorpo&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo CD3 (17A2) Anticorpo</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr><td>BD Cytofix/Cytoperm Plus Kit di soluzioni di fissazione/permeabilizzazione con BD GolgiPlug</td><td>BD Biosciences</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiPlug Inibitore del trasporto della proteina (contenente Brefeldin A)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555029</tr><tr><td>BD GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoclonal Antibody (N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Monoclonal Antibody (17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Anticorpo monoclonale (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Anticorpo monoclonale (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticorpo monoclonale (30-F11)</td><td>Invitrogen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>CD69 Anticorpo monoclonale (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a Anticorpo monoclonale (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (APO-1/Fas) Anticorpo monoclonale (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per conteggio cellulare</td><td>Kova International</td><td>87144E Maschere</td><td></td></tr><tr><td>al quarzo cromo</td><td>MB W& A, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Kit di test per citometria a flusso</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso CytoFLEX</td> Kit per la rimozione delle cellule morte di <td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale Granzyme B (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Piastra</td> riscaldante Sigma Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari umificate (37&deg;, 5% CO2)Thermo</td> <td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macchina per il ghiaccio</td><td>Brema Ice Makers</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN gamma Anticorpo monoclonale (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr> Illustrator <tr><td></td> CC 2015 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Adobe Systems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institute of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte 2022A Software</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Cytotox Dye per il conteggio delle cellule morte</td> Sistema di analisi delle cellule vive <td>Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte SX5&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLi Smart Fluorescent Live Cell Imaging Microscopio</td><td>Bulldog Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banco da laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frigorifero da laboratorio (4 gradi; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armadio di sicurezza da laboratorio (Classe II)</td><td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte Aqua riparabile</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte Near-IR fissabile</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>Colonne MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201; 130-042-401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Separatori MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MCA205 linea cellulare di fibrosarcoma di topo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>Struttura per animali microbiologicamente controllata dotata di cabina</td><td></td><td></td><td></td>di sicurezza di Classe II</tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>Microsoft, Redmond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse: C57BL / 6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD8a+ T Cell Isolation Kit, topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements BR 5.30.0064-BIT</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Litografia ottica</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina G sale sodico e streptomicina solfato</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D/1</td><td></td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>&nbsp; 4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Pipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PKH67 Kit di collegamento cellulare fluorescente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH67GL-1KT</td><td>Kit di collegamento cellulare in</td></tr><tr><td>plastica</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Thermo Scientific</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>sistema di incisione ionica reattiva</td><td>Oxford plasmalab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)</td><td>EuroClone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>pipette sierologiche (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; </td><td></td>CLS4489</tr><tr><td>SL 16 Centrifuga Serie</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004031</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi, pinze chirurgiche, forbici e pinze</td><td></td><td></td><td></td>sterili</tr><tr><td>Punte sterili (1&ndash; 10 &mu; L, 20&ndash; 200 &mu; L, 1000 &mu; L)</td><td>EuroClone Spa, Milano, Italia</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; </td><td></td>ECTD01005</tr><tr><td>SU-8 serie 3000</td><td>MicroChem corp, Newton, (MA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suite di punzoni per biopsia dermica</td><td>Kai Medical, Tedpella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Anticorpo monoclonale (H57-597)</td><td>eBioscience</td><td>12-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Bagno</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>termostaticoTimer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMCS&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain (0,4%)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA con essiccatore</td> sottovuoto <td>EuroClone</td><td>ECM0920</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> rosso fenolo</tbody></table>

sistemi in vitro di co-coltura per riprodurre il ciclo cancro-immunità

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

La ricerca fondamentale sul cancro e lo sviluppo di terapie efficaci di contrattacco si basano su studi sperimentali che descrivono in dettaglio le interazioni tra cancro e cellule immunitarie, il cosiddetto ciclo cancro-immunità. I sistemi di co-coltura in vitro combinati con la citometria a flusso multiparametrica (mFC) e i dispositivi microfluidici (ToC) tumor-on-a-chip consentono un monitoraggio e una caratterizzazione semplici, rapidi e affidabili di ogni fase del ciclo cancro-immunità e portano all'identificazione dei meccanismi responsabili dell'equilibrio tra immunosorveglianza e immunoevasione del cancro. Una comprensione approfondita delle interazioni dinamiche tra cancro e cellule immunitarie fornisce informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e accelererà il ritmo della personalizzazione e dell'ottimizzazione terapeutica nei pazienti. In particolare, qui descriviamo in dettaglio un semplice protocollo assistito da mFC e ToC per svelare le complessità dinamiche di ogni fase del ciclo cancro-immunità nelle linee cellulari di cancro murino e nelle cellule immunitarie derivate dal topo e ci concentriamo sull'immunosorveglianza. Considerando le caratteristiche legate ai tempi e ai costi di questo protocollo, è certamente fattibile su larga scala. Inoltre, con piccole variazioni, questo protocollo può essere adattato sia a linee cellulari tumorali umane che a cellule immunitarie derivate da sangue periferico umano e combinato con l'inibizione genetica e/o farmacologica di percorsi specifici al fine di identificare biomarcatori della risposta immunitaria.

La capacità delle DC CD11c+, il sottogruppo di fagociti ampiamente noto specializzato per la presentazione incrociata21,22 e gated come mostrato nella Figura 2A, di inghiottire corpi apoptotici da cellule tumorali MCA205 irradiate con raggi UV che erano state precedentemente marcate con il linker cellulare fluorescente PKH67 è stata valutata mediante mFC. Come previsto, le DC CD11c+ hanno catturato in modo efficiente le cellule apoptotiche MCA205 in vitro a 37 °C ma non a 4 °C (Figura 2B, fasi 1-3 del ciclo cancro-immunità). Per caratterizzare ulteriormente la maturazione delle DC dopo l'assorbimento di Ag nel tumore, l'espressione superficiale delle molecole del ligando del checkpoint costimolatorio e immunitario è stata controllata e confrontata nelle DC pre e post-fagocitosi (DCN e DCPHAGO, rispettivamente). Le cellule DCPHAGO hanno mostrato livelli significativamente aumentati di CD86 e MHC-II, insieme a livelli ridotti di PDL1 (Figura 2C, fase 4 del ciclo cancro-immunità). Inoltre, l'espansione clonale delle cellule T CD8 una volta cross-innescate da DCPHAGO (CD8C-P) è stata valutata valutando l'incorporazione dell'analogo della timidina EdU (fase 5 del ciclo cancro-immunità). Controllando correttamente le cellule T CD3+CD8+ vive (Figura 3A), è stato riscontrato che ~20% dei CD8C-P, che rappresentano i cloni che esprimono la molecola CD95 e che portano TCR Ag-specifici per il tumore (Figura 1 supplementare), hanno subito una proliferazione rispetto alle cellule T CD8 naive (CD8N, Figura 3B). Utilizzando modelli di ToC (Figura 3C), è stata valutata la capacità del CD8C-P di percepire e reagire alla chemioattrazione da parte delle allarmine rilasciate dalle cellule tumorali, rispecchiando così l'homing delle cellule T CD8 specifiche del tumore al TME (fase 6 del ciclo cancro-immunità). In particolare, i ToC sono stati impiegati per consentire e seguire l'attrazione chimica e fisica e l'interazione tra le cellule immunitarie non aderenti, che si spostano dalla camera immunitaria alla camera tumorale e le cellule tumorali aderenti che riposano nella camera tumorale. Le microfotografie scattate in diversi momenti post-co-coltura hanno mostrato una progressiva migrazione di CD8C-P verso le cellule tumorali attraverso l'attraversamento di microcanali (Figura 3C). Di interesse è che le cellule immunitarie in avvicinamento potrebbero interagire in modo stabile ed efficiente con le cellule tumorali a 24 ore, 48 ore e 72 ore (Figura 3D). Infine, è stata analizzata la risposta di CD8C-P all'interno del TME e ri-stimolata da Ags presentati al cancro (CD8E) valutando, attraverso mFC, i livelli di espressione superficiale dei marcatori di attivazione precoci di CD69 (Figura 2A supplementare) e CD44 tardivi, CD25 (Figura 4A), nonché l'espressione di membrana dei marcatori di reattività tumorale CD137 (Figura 4B) e CD107a (Figura 2B supplementare) rispetto a CD8N e CD8C-P (fase 7 del ciclo cancro-immunità). Abbiamo anche valutato la produzione intracellulare delle molecole citotossiche Grz-B (Figura 5A) e IFN-γ (Figura 5B). È interessante notare che tutti questi livelli di marcatori sono aumentati progressivamente e significativamente e hanno raggiunto un picco di espressione a 72 ore di co-coltura, rispecchiando così un'attivazione tardiva ed efficace. Di conseguenza, le cellule MCA205 co-coltivate affini sono andate incontro a livelli significativi di morte mediata da CD8E, come rivelato da un sistema di analisi di cellule vive e da analisi mFC (Figura 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica del protocollo sperimentale per lo studio del ciclo cancro-immunità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg"> Figura 2: Assorbimento e presentazione dell'Ag nelle cellule tumorali mediate da DC. (A) Strategia di gating per l'analisi di DC mFC. Durante l'acquisizione delle mFC e l'analisi dei dati, i campioni sono stati controllati in sequenza (1) per la morfologia tracciando FSC-A e SSC-A; (2) per singoletti tracciando FSC-A e FSC-H; e (3) per la fattibilità tracciando il Near-IR e l'SSC-A. Le cellule vitali sono state infine analizzate per il marcatore specifico di superficie CD11c. (B) Analisi mFC della capacità delle DC CD11c+ di inghiottire corpi apoptotici da cellule tumorali MCA205 marcate con PKH67 e irradiate con raggi UV a 37 °C e 4 °C (fasi 1-3 del ciclo cancro-immunità). Grafici biparametrici rappresentativi e un istogramma che mostra la percentuale di cellule CD11c+PKH67+ (media ± s.e.m. con un singolo punto dati, viene mostrato un esperimento rappresentativo su tre). (C) Analisi di mFC di molecole di superficie di ligandi del checkpoint costimolatorio e immunitario su DC pre e post-fagocitosi (DCN e DCPHAGO, rispettivamente; fase 4 del ciclo cancro-immunità). Gli istogrammi rappresentano la percentuale (media ± s.e.m. e singoli punti dati, n = 3 esperimenti indipendenti) di cellule CD11c+CD86+, CD11c+MHC-II+ e CD11c+PDL1+. (B) Test t di Student a due lati non accoppiato con correzione di Welch rispetto a 4 °C. (C) Test t di Student a due lati non accoppiato rispetto a DCN.Fare <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg"> Figura 3: Proliferazione delle cellule T CD8 e traffico verso le cellule tumorali dopo cross-priming. (A) Strategia di gating per l'analisi delle cellule T CD3+CD8+ . Durante l'acquisizione delle mFC e l'analisi dei dati, i campioni sono stati controllati in sequenza (1) per la morfologia tracciando FSC-A e SSC-A; (2) per singoletti tracciando FSC-A e FSC-H; e (3) per la vitalità tracciando Aqua e SSC-A. Le cellule vitali sono state infine analizzate per la colorazione EdU di proliferazione specifica. (B) Analisi mFC dell'espansione clonale di cellule T CD8 mediante tecnologia EdU (fase 5 del ciclo cancro-immunità). Gli istogrammi monoparametrici rappresentano la percentuale (media ± s.e.m. con singolo punto dati, viene mostrato un esperimento rappresentativo su tre) di cellule T CD8 proliferanti naïve a EdU+ e cross-primed (CD8N e CD8C-P, rispettivamente). (C, D) Modello microfluidico ToC di homing delle cellule T CD8 al TME (fase 6 del ciclo cancro-immunità). (C) Planimetria schematica di un sommario. Le due camere di coltura laterali, che ospitano le cellule immunitarie e tumorali, sono collegate da canali di dimensioni micron (larghezza = 12 μm, lunghezza = 10 μm, altezza = 10 μm). Gli scomparti per colture cellulari sono larghi 1 mm, lunghi 8 mm e alti 100 μm. Le microfotografie generate durante le registrazioni time-lapse rappresentano la migrazione di CD8C-P verso le cellule tumorali in diversi punti temporali (da 0 a 72 ore; barra della scala, 100 μm). (D) Vengono mostrati i grafici che rappresentano le traiettorie dei singoli CD8C-P (n = 100 cellule per condizione) verso le cellule tumorali bersaglio (punti neri) entro 24-72 ore (barra della scala, 10 μm). (A) Test t di Student a due lati non accoppiato con correzione di Welch rispetto a CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg"> Figura 4: Reattività del tumore delle cellule T CD8 dopo restimolazione con cellule tumorali vive. (A) Analisi mFC dei livelli di espressione superficiale dei marcatori di attivazione CD44, CD25 su cellule T CD8 ri-stimolate da Ag presentati al cancro (CD8E) (fase 7 del ciclo cancro-immunità) fino a 72 ore. Grafici biparametrici rappresentativi e un istogramma che mostra la percentuale di cellule T CD44+CD25+ CD8 in CD8N, CD8C-P, CD8E a 48 ore e 72 ore (media ± s.e.m. e punti dati individuali, n = 3 esperimenti indipendenti). (B) Analisi mFC dell'espressione di membrana del marcatore di reattività tumorale CD137 su CD8E. Grafici biparametrici rappresentativi e un istogramma che mostra la percentuale di cellule T CD137+ CD8 in CD8N, CD8C-P, CD8E a 48 ore e 72 ore (media ± s.e.m. e singoli punti dati, viene mostrato un esperimento rappresentativo su tre). (A,B) Test ANOVA ordinario a una via seguito dalla correzione di Bonferroni rispetto al CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg"> Figura 5: Produzione di Grz-B e IFN-γ da parte delle cellule T CD8. (A) Analisi mFC dei livelli di espressione intracellulare di Grz-B su CD8E (fase 7 del ciclo cancro-immunità). Istogrammi rappresentativi che mostrano l'MFI delle cellule T Grz-B+ CD8 in CD8N, CD8C-P, CD8E a 48 ore e 72 ore (media ± s.e.m. e singoli punti dati, n = 3 esperimenti indipendenti). (B) Analisi mFC di IFN-γ intracellulare su CD8E. Grafici istogramma rappresentativi che mostrano la percentuale di cellule T IFN-γ+ CD8 in CD8N, CD8C-P, CD8E a 48 ore e 72 ore (media ± s.e.m. e punti dati individuali, n = 3 esperimenti indipendenti). (A,B). Test ANOVA ordinario a una via seguito dalla correzione di Bonferroni rispetto al CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg"> Figura 6: Uccisione tumorale mediata dalle cellule T CD8. (A) Analisi mFC della morte cellulare CD45 guidata da CD8E dopo 72 ore di co-coltura (fase 7 del ciclo cancro-immunità). Gli istogrammi rappresentano la percentuale (media ± s.e.m. e singoli punti dati, n = 3 esperimenti indipendenti) di cellule PI+CD45− morenti. (B) Analisi su cellule vive della morte delle cellule tumorali mediata da CD8E. Immagini rappresentative e un grafico che mostra l'incorporazione di Cytotox Red da parte di cellule tumorali morenti e morte (viene mostrato un esperimento rappresentativo su tre). (A) Test t di Student bilaterale non accoppiato rispetto alle sole cellule tumorali (CTR). (B) Test di Mann-Whitney a due code rispetto al CTR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Figura 1 supplementare: I grafici dell'istogramma rappresentano l'MFI di CD95+TCR-β+ CD8N e CD8C-P. Test t di Student bilaterale non accoppiato rispetto al CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Figura supplementare 2: Attivazione delle cellule T CD8. (A) Analisi mFC dei livelli di espressione superficiale del marcatore di attivazione precoce di CD69 su CD8E (fase 7 del ciclo cancro-immunità). Grafici biparametrici rappresentativi e un istogramma che mostra la percentuale di cellule T CD69+ CD8 in CD8N, CD8C-P, CD8E a 48 ore e 72 ore (media ± s.e.m. e singoli punti dati, un esperimento su tre). (B) Analisi mFC dell'espressione di membrana della proteina CD107a associata al lisosomiato su CD8E. Grafici biparametrici rappresentativi e un istogramma che mostra la percentuale di cellule T CD107a+ CD8 in CD8N, CD8C-P, CD8E a 48 ore e 72 ore (media ± s.e.m. e singoli punti dati, viene mostrato un esperimento rappresentativo su tre). (A,B). Test ANOVA ordinario a una via seguito dalla correzione di Bonferroni rispetto al CD8N. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
Tabella supplementare 1: Miscele di anticorpi fase 3.3.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

Qui, descriviamo in dettaglio un protocollo semplice, veloce e affidabile di citometria a flusso multiparametrica e tumor-on-a-chip per monitorare e caratterizzare le fasi che costituiscono il ciclo cancro-immunità. In effetti, una comprensione approfondita delle interazioni tra cancro e cellule immunitarie fornisce informazioni critiche per superare in astuzia i tumori e guidare l'assistenza clinica.

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Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between ...

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Qui, descriviamo un metodo di co-coltura in vitro di cellule di T del tumore targeting sfida in modo ricorsivo, che consente analisi fenotipica e funzionale di attività antitumorale delle cellule T.

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L'approccio presentato valuta simultaneamente l'invasione delle cellule tumorali nei saggi dello sferoideo 3D e nella citotossicità delle cellule T. Gli spheroidi sono generati in un cast multi-microwell senza scaffold. La co-coltura e l'incorporamento nella matrice di collagene di tipo I vengono eseguite all'interno dello stesso dispositivo che permette di monitorare l'invasione delle cellule tumorali e la citotossicità mediata a cellule T.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Nell'era dell'immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.

Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

Il presente protocollo descrive un flusso di lavoro sperimentale che consente l'analisi ex vivo della stimolazione di cellule T umane in un sistema di co-coltura allogenica con cellule tumorali pretrattate.

Analisi dell'attività delle cellule T umane in un contesto di co-coltura allogenica di cellule tumorali pretrattate

Il protocollo descrive un metodo per la creazione di un modello di organoide di cancro colorettale (CRC) derivato da pazienti co-coltivato con linfociti infiltranti il tumore (TIL) per studiarne le interazioni e il potenziale terapeutico. Questo modello fornisce una piattaforma preclinica per esplorare le risposte immunitarie nel microambiente tumorale e per prevedere l'efficacia della terapia basata su TIL per il trattamento personalizzato del CRC.

Istituzione di un sistema di co-coltura di organoidi tumorali colorettali derivati da pazienti e linfociti infiltranti il tumore (TIL)

Questo protocollo descrive la riprogrammazione in vivo di cellule tumorali di topo in cellule dendritiche di tipo 1 all'interno del microambiente tumorale attraverso l'espressione forzata dei fattori di trascrizione PU.1, IRF8 e BATF3.

Riprogrammazione trattabile in vivo di cellule tumorali in cellule dendritiche convenzionali di tipo 1

Scopri i sistemi di co-coltura in vitro per studiare il ciclo cancro-immunità usando modelli tumor-on-a-chip e citometria a flusso. Questo metodo offre un approccio semplice ed economico per monitorare le interazioni tra cellule tumorali e immunitarie.

Sistemi in vitro di co-coltura per riprodurre il ciclo cancro-immunità

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