Name: Utilizzo di organoidi intestinali umani per comprendere lepitelio dellintestino tenue a livello trascrizionale di una singola cellula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-28T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 23 s
Description: Esplora l'analisi trascrittomica a singola cellula utilizzando organoidi intestinali umani. Questo metodo computazionale rivela l'eterogeneità cellulare nell'epitelio intestinale e identifica biomarcatori per malattie intestinali.

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Gli autori riconoscono le sovvenzioni U19 AI157984, U01 DK103168, U19 AI144297, P30 DK56338, P01 AI057788, U19 AI116497 e NASA Cooperative Agreement Notice/TRISH NNX16AO69A.

Integrazione della trascrittomica a singola cellula con organoidi intestinali umani

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+microphysiological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal microphysiological systems.</a> Exp Biol Med. 242 (16), 1633-1642 (2017).</li>
<li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Elmentaite, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+of+the+human+intestinal+tract+mapped+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cells of the human intestinal tract mapped across space and time.</a> Nature. 597 (7875), 250-255 (2021).</li>
<li>Hickey, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+the+human+intestine+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Organization of the human intestine at single-cell resolution.</a> Nature. 619 (7970), 572-584 (2023).</li>
<li>Burclaff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proximal-to-distal+survey+of+healthy+adult+human+small+intestine+and+colon+epithelium+by+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A proximal-to-distal survey of healthy adult human small intestine and colon epithelium by single-cell transcriptomics.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (5), 1554-1589 (2022).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> Mol Syst Biol. 17 (7), e9833(2021).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Mol Syst Biol. 17 (4), e10232(2021).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2021).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+gradient+along+the+intestinal+villus+axis+controls+zonated+enterocyte+and+goblet+cell+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">BMP gradient along the intestinal villus axis controls zonated enterocyte and goblet cell states.</a> Cell Rep. 38 (9), 110438(2022).</li>
<li>Beumer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+mRNA+and+secretome+atlas+of+human+enteroendocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells.</a> Cell. 182 (4), 1062-1064 (2020).</li>
<li>Busslinger, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gastrointestinal+epithelia+of+the+esophagus%2C+stomach%2C+and+duodenum+resolved+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution.</a> Cell Rep. 34 (10), 108819(2021).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 550-572 (2023).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Utilizzando piattaforme di genomica a singola cellula, sistemi biologici complessi, come le colture HIO derivate da tessuti che modellano l'epitelio intestinale, possono essere scomposti per produrre contributi cellulari individuali alla risposta biologica complessiva 4,5,6. È inoltre possibile identificare e interrogare l'eterogeneità cellulare e le popolazioni cellulari rare. L'input cellulare deve essere ottimizzato per massimizzare l'output utilizzando piattaforme basate sulla trascrittomica a singola cellula. Qui descriviamo i protocolli che produrranno sospensioni a singola cellula altamente vitali e di buona qualità che aumenteranno la probabilità di ottenere dati trascrittomici di alta qualità a valle. La familiarità con il protocollo è della massima importanza e si consiglia di eseguire diverse esecuzioni di esercitazione prima di procedere con la preparazione della libreria. Si consiglia di ottenere in modo riproducibile sospensioni di singole cellule vitali prima di utilizzare le cellule per la preparazione della libreria. La rapidità con cui il protocollo viene implementato è della massima importanza in quanto la velocità è direttamente proporzionale ai risultati di fattibilità. Sulla base di ciò, si consiglia di limitare il numero di campioni gestiti contemporaneamente. Si consiglia di interfacciarsi con l'entità che preparerà le librerie prima di avviare questi protocolli per assistenza nella risoluzione dei problemi.
La vitalità dell'HIO influenza direttamente la libreria di DNA inviata per il sequenziamento. La vitalità cellulare dell'HIO dipende da diverse fasi della preparazione della sospensione di una singola cellula, tra cui la dissociazione, la centrifugazione, i tamponi, il pipettaggio e l'accuratezza del conteggio. L'obiettivo della preparazione degli HIO per la piattaforma è quello di bilanciare il mantenimento della vitalità cellulare con la qualità del campione. Fondamentale per ottenere dati di alta qualità è la minimizzazione degli aggregati cellulari, delle cellule morte, degli acidi nucleici non cellulari e degli inibitori biochimici della trascrizione inversa. Le cellule morenti aumentano il rumore dell'acido nucleico e contribuiscono all'aggregazione cellulare, portando a guasti dei dati e della piattaforma 7,8,9,10,11,12. Il filtro con una dimensione del filtro appropriata può aiutare a rimuovere aggregazioni di grandi dimensioni e migliorare la qualità dei dati.
Diversi fattori devono essere considerati per ridurre al minimo la morte delle cellule HIO quando si preparano sospensioni di singole cellule. È necessario ottenere almeno l'80% di cellule vitali e l'>90% di vitalità è ancora più desiderabile. I campioni con un numero elevato di cellule non vitali possono essere migliorati utilizzando strategie per rimuovere le cellule morte, come le microsfere basate su colonna, sebbene queste richiedano più cellule iniziali e volumi di campione maggiori a causa della perdita durante la manipolazione. Gli HIO sono particolarmente sensibili ai tamponi e subiscono la morte cellulare se lasciati troppo a lungo a RT in determinati tamponi. I terreni organoidi determinano la minima perdita di cellule e la formazione di aggregati. Il pipettaggio può anche influire sulla vitalità dell'HIO durante la dissociazione. Le punte dei fori regolari possono tagliare gli organoidi, aiutandoli a dissociarsi in sospensioni a singola cellula; tuttavia, un pipettaggio troppo rapido con un puntale con foro normale può causare danni alle celle HIO a causa delle forze di taglio. Il pipettaggio lento con puntali a foro largo riduce al minimo lo stress sulle cellule HIO e migliora notevolmente il numero di cellule vitali a valle. La centrifugazione, il lavaggio e la risospensione sono altri fattori che possono influenzare la qualità delle sospensioni a singola cellula HIO. La centrifugazione a secchiello oscillante consente di pellettare più delicatamente le celle HIO, con conseguente riduzione del numero di cellule morte e riduzione al minimo della perdita di cellule. Infine, l'accuratezza del conteggio per determinare la concentrazione è essenziale per garantire che il numero massimo di cellule raggiunga la piattaforma per la sintesi della libreria. L'attenzione a questi dettagli si tradurrà nella riduzione al minimo dello stress sulle celle HIO durante il processo di isolamento e garantirà la massima probabilità di ritorno dei dati dopo l'elaborazione.
Sebbene la trascrittomica a singola cellula sia un potente strumento per sezionare i profili biologici e le risposte a livello di singola cellula 4,5,6, ci sono diverse limitazioni che devono essere considerate quando si applica la tecnologia per analizzare le colture di organoidi intestinali umani. In primo luogo, ci può essere una variazione trascrizionale significativa a causa della variabilità tecnica introdotta durante la preparazione e il sequenziamento della libreria o a causa degli effetti batch derivanti dalla preparazione del campione. Inoltre, il sequenziamento può causare un bias di copertura in presenza di una profondità di sequenziamento non uniforme tra geni o cellule. Ciò causa difficoltà nel rilevamento di geni poco espressi o nell'identificazione di popolazioni cellulari rare. In secondo luogo, l'identificazione dei tipi cellulari può essere difficile a causa dell'eterogeneità cellulare e trascrizionale delle colture di organoidi e di un profilo cellulare meno differenziato rispetto all'epitelio intestinale nativo. Anche l'accoppiamento delle risposte trascrizionali ai fenotipi funzionali è una sfida e richiede un'ulteriore convalida utilizzando altri approcci o saggi. In terzo luogo, questo approccio non include la considerazione del contesto spaziale o della dinamica temporale delle cellule. La procedura di dissociazione rimuove la capacità di dedurre le interazioni cellula-cellula dai dati trascrizionali. Fornisce solo una singola istantanea nel tempo dello stato cellulare piuttosto che un continuum biologico. Infine, gli approcci trascrizionali a singola cellula possono essere costosi e richiedere strumenti computazionali specializzati e competenze bioinformatiche. Tuttavia, questo approccio rimane ancora uno strumento all'avanguardia dominante per comprendere l'eterogeneità cellulare e identificare nuovi tipi di cellule.

L'epitelio dell'intestino tenue ha due zone distinte: la cripta che ospita la cellula staminale intestinale (ISC) e il villo, che è composto da cellule differenziate delle linee secretorie e assorbenti. A questa complessità si aggiunge la specificità regionale dell'epitelio che fornisce proprietà funzionali uniche tra le regioni dell'intestino tenue. Il lavoro pionieristico ha stabilito le condizioni di coltura in cui sia la cripta intestinale tenue umana che le zone dei villi possono essere generate ex vivo da tessuti chirurgici o biopsie tissutali1. Queste colture stanno colmando il divario tra gli studi sugli animali e gli studi clinici e stanno rivelando la biologia cellulare, la biochimica e la fisiologia del tratto gastrointestinale precedentemente non riconosciute. Le HIO vengono propagate come strutture sferiche 3D utilizzando un mezzo con fattori di crescita che promuovono la vitalità delle cellule staminali e matrici di supporto extracellulare. Queste condizioni si traducono in un modello HIO simile a una cripta che consiste principalmente di progenitori e cellule staminali. La rimozione dei fattori di crescita promuove la differenziazione delle ISC (modello simile ai villi) e la produzione di cellule epiteliali intestinali mature (calice, enteroendocrino, ciuffo, enterociti) in rapporti appropriati insieme alla proliferazione e differenziazione cellulare, alla polarizzazione, all'integrità della barriera, alle caratteristiche specifiche regionali e alle risposte fisiologiche appropriate2. Le colture HIO sono geneticamente stabili e possono essere propagate all'infinito nel loro stato simile a una cripta. Il facile accesso alla superficie apicale di queste colture è fornito dalle condizioni di coltura che consentono la crescita in un formato monostrato3. Gli HIO consentono inoltre di includere nelle analisi biologiche considerazioni sulla variabilità individuale dell'ospite, come la genetica, l'età, il sesso, l'etnia e lo stato della malattia. Gli strumenti di valutazione analitica e funzionale sono identici a quelli utilizzati negli approcci incentrati su linee cellulari trasformate e includono una varietà di tecniche molecolari come la citometria a flusso, la microscopia, la trascrittomica, la proteomica e la metabolomica.
La trascrittomica a singola cellula sta rivoluzionando la nostra comprensione della biologia e della fisiologia dell'intestino tenue, fornendo informazioni sui contributi individuali di ciascun tipo di cellula a un processo biologico. Il lavoro pionieristico che utilizza questa tecnologia ha fornito un panorama dei tipi di cellule presenti nell'intestino umano nativo 4,5,6. Le piattaforme di profilazione trascrizionale a singola cellula consentono l'esplorazione del panorama trascrizionale delle singole cellule, consentendo all'eterogeneità cellulare di essere in prima linea nell'esplorazione scientifica. In alcune piattaforme di profilazione trascrizionale di singole cellule, il partizionamento microfluidico e il barcoding vengono utilizzati per generare librerie di cDNA da mRNA poliadenilati cellulari ottenuti da un massimo di 10.000 cellule per campione. Su questa piattaforma, goccioline contenenti singole cellule, oligonucleotidi con codice a barre, reagenti di trascrizione inversa e olio formano una vescicola di reazione che si traduce in tutti i cDNA di una singola cellula con lo stesso codice a barre. I cDNA con codice a barre possono quindi essere sequenziati in modo efficiente utilizzando il sequenziamento di nuova generazione. I dati generati possono essere gestiti attraverso software e strumenti di visualizzazione, che convertono le sequenze con codice a barre in mappe di visualizzazione e profili trascrizionali a singola cellula. Le popolazioni cellulari possono essere identificate utilizzando database pubblicamente disponibili di epitelio umano dell'intestino tenue 4,5,6. Sebbene molti studi abbiano utilizzato questa piattaforma per interrogare organoidi intestinali murini a livello di singola cellula, l'analisi delle risposte trascrizionali di singole cellule di HIO è rimasta indietro rispetto a 7,8,9,10,11,12.
Qui, forniamo una guida passo passo per isolare cellule vitali da HIO intestinali tenue per l'elaborazione su piattaforme di profilazione trascrizionale a singola cellula (Figura 1). Forniamo linee guida per la coltura e la differenziazione insieme a componenti del terreno che sono stati ottimizzati per la differenziazione epiteliale. Delineiamo i metodi di recupero cellulare per tre diversi formati di coltura: colture tridimensionali (3D) e monostrato su inserti di coltura cellulare in plastica o a membrana. Forniamo dati di clustering dei campioni ottenuti utilizzando software open source per derivare geni espressi in modo differenziale in ciascun cluster.

<table><tbody><tr><td>[Leu15]-gastrina I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,4% blu di tripano</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Corning</td><td>46-034-CI</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS Ca- Mg-Corning</td><td></td> <td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>24 mm Transwell</td><td>Costar</td><td>3412</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura tissutale di superficie Nunclon delta a 24 pozzetti</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; filtro per celle m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>40 &micro; m Filtro a punta Flowmi</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0040</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m Filtro a punta Flowmi</td><td>SP Bel-Art Labware</td><td>H13680-0070</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>StemCell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>B27 supplemento</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1X</td></tr><tr><td>Cromo Next GEM Cella Singola 3' GEM, Biblioteca & Kit di perline in gel v3.1</td><td>10x Genomica</td><td>PN-1000128</td><td></td></tr><tr><td>Collagene IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5533-5MG</td><td>33 &; g/mL</td></tr><tr><td>di soluzione per il recupero delle cellule Corning&nbsp;</td><td>VWR</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Mg2-, Ca2-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-136</td><td>1X</td></tr><tr><td>GlutaMAX-I</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>L-WRN fluidi condizionati</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, senza fenolo</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>mouse EGF ricombinante</td><td>Invitrogen</td><td>PMG8043</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>integratore di N2</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>1X</td></tr><tr><td>N-Acetilcisteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td>500 &; M</td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Tecnologie delle cellule staminali</td><td>72308</td><td>10 &micro; M</td></tr></tbody></table>

utilizzo di organoidi intestinali umani per comprendere l'epitelio dell'intestino tenue a livello trascrizionale di una singola cellula

Using Human Intestinal Organoids to Understand the Small Intestine Epithelium at the Single Cell Transcriptional Level

La trascrittomica a singola cellula ha rivoluzionato la nostra comprensione della biologia cellulare del corpo umano. Le colture di organoidi intestinali tenue umani all'avanguardia forniscono sistemi modello ex vivo che colmano il divario tra i modelli animali e gli studi clinici. L'applicazione della trascrittomica a singola cellula a modelli di organoidi intestinali umani (HIO) sta rivelando la biologia, la biochimica e la fisiologia cellulare del tratto gastrointestinale precedentemente non riconosciute. Le piattaforme avanzate di trascrittomica a singola cellula utilizzano il partizionamento microfluidico e la codifica a barre per generare librerie di cDNA. Questi cDNA con codice a barre possono essere facilmente sequenziati da piattaforme di sequenziamento di nuova generazione e utilizzati da vari strumenti di visualizzazione per generare mappe. Qui, descriviamo i metodi per coltivare e differenziare gli HIO dell'intestino tenue umano in diversi formati e procedure per isolare le cellule vitali da questi formati che sono adatti per l'uso in piattaforme di profilazione trascrizionale a singola cellula. Questi protocolli e procedure facilitano l'uso di HIO intestinali tenue per ottenere una maggiore comprensione della risposta cellulare dell'epitelio intestinale umano a livello trascrizionale nel contesto di una varietà di ambienti diversi.

Le sospensioni di singole cellule sono state raggruppate da 2-3 pozzetti di inserto per colture cellulari a membrana, monostrato e HIO 3D per garantire una resa cellulare sufficiente e ridurre la variazione da pozzetto a pozzetto. Le librerie di singole cellule sono state preparate utilizzando reagenti specifici per la piattaforma di profilazione trascrizionale a singola cellula. e sequenziato con letture finali accoppiate su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione, 30.000 letture/cella. Le letture sono state mappate, contate e analizzate utilizzando strumenti analitici per la genomica a singola cellula. Sono state escluse dall'analisi le cellule di bassa qualità con più del 20% di lettura mitocondriale o meno di 200 geni contati. Per valutare la qualità delle cellule, abbiamo tracciato il numero di geni, UMI e la percentuale di letture mitocondriali per cellula (Figura 3); le cellule di alta qualità contengono circa 3500 geni, 15.000 UMI e il 10% di letture mitocondriali. Dopo il filtraggio, abbiamo ottenuto da 4000 a 9500 cellule singole a seconda del formato di crescita HIO. Il clustering non supervisionato e la riduzione delle dimensioni UMAP hanno identificato cluster distinti che rappresentano i tipi cellulari attesi, inclusi enterociti assorbenti e cellule secretorie (Figura 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig01.jpg"> Figura 1: Schema dei passaggi del protocollo. Schemi che delineano i passaggi principali della placcatura di HIO in diversi formati per il flusso di lavoro dei dati a cella singola. Questa immagine è stata creata utilizzando Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig02.jpg"> Figura 2: Immagini in campo chiaro. Gli HIO pronti per l'elaborazione sono stati ripresi utilizzando un microscopio a campo chiaro con ingrandimento 5X. A sinistra, organoidi 3D; piastra centrale a 96 pozzetti; Esatto, Transwell. Barre di scala = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig03.jpg"> Figura 3: Controllo di qualità dei dati. Esempi di metriche di singole cellule analizzate isolate da HIO digiunali cresciute come monostrati su piastre a 96 pozzetti. I grafici a violino mostrano il numero di geni (nFeature_RNA), UMI (nCount_RNA) e la percentuale di letture mitocondriali (percent.mt) per cellula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66749/66749fig04.jpg"> Figura 4: UMAP di singole cellule analizzate. (A) Un totale di 9952 singole cellule sono state isolate da HIO digiunali differenziate cresciute in piastre a 96 pozzetti. (B) Un totale di 5623 singole cellule sono state isolate da HIO digiunali differenziati cresciuti su inserti di coltura cellulare a membrana. (C) Un totale di 4402 singole cellule sono state isolate da HIO 3D ileali differenziate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66749/66749fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>WRNE Terreno di crescita</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Mezzo di differenziazione</td>
		</tr><tr><td>Componente</td>
			<td>Volume</td>
			<td>Concentrazione finale</td>
			<td>Terreno WRNE senza terreno condizionato L-WRN, nicotinamide e SB202190</td>
		</tr><tr><td>*Y-27632 (5 mM) opzionale</td>
			<td>200 μl</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>A 83-01 (500 μM)</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>500 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avanzato</td>
			<td>45 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>B27</td>
			<td>2 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF (50 μg/mL)</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>50 ng/mL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>gastrina (10 μM)</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>10 nM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>GlutaMax (100X)</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>HEPES 1 M</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>L-WRN Con- Media</td>
			<td>50 ml</td>
			<td>~50%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N2</td>
			<td>1 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>N-acetilcisteina (500 mM)</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>500 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Nicotinamide 1 M</td>
			<td>1 ml</td>
			<td>10 mM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>SB202190 (10 mM)</td>
			<td>100 μl</td>
			<td>10 μM</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Volume totale</td>
			<td>100 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CMGF- Medio</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>DMEM/F12 avanzato</td>
			<td>500 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Glutamax</td>
			<td>5 ml</td>
			<td>100X</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>1 m di peso</td>
			<td>5 ml</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Composizione dei vari media utilizzati.

Il protocollo combina la tecnologia degli organoidi intestinali umani con l'analisi trascrittomica a singola cellula per fornire informazioni significative sulla biologia intestinale precedentemente inesplorata.

Utilizzo di organoidi intestinali umani per comprendere l'epitelio dell'intestino tenue a livello trascrizionale di una singola cellula

Single cell transcriptomics has revolutionized our understanding of the cell biology of the human body. State-of-the-art human small intestinal organoid ...

using-human-intestinal-organoids-to-understand-small-intestine

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Descriviamo un metodo per stabilire enteroidi umani da cripte intestinali tenue e colonoidi da cripte del colon raccolte sia da tessuto chirurgico che da biopsie. In questo articolo metodologico, presentiamo le modalità di coltura che sono essenziali per la crescita e il mantenimento di successo di enteroidi e colonoidi umani.

Istituzione di umano epiteliali Enteroids e Colonoids dal tessuto intero e biopsia

In questo protocollo video diamo una spiegazione passo dopo passo della trasduzione lentivirale negli organoidi dell'epitelio intestinale primario e del processamento e dell'analisi a valle di queste colture mediante RT-PCR quantitativo, RNA-microarray e immunoistochimica.

Un protocollo per lentivirali trasduzione e analisi valle di intestinale organoidi

Questo protocollo descrive la misura della permeabilità della barriera epiteliale in tempo reale dopo il trattamento farmacologico in organoids intestinale umana utilizzando la microscopia a fluorescenza e microscopia cellulare di vivere.

Misura in tempo reale di permeabilità della barriera epiteliale in Organoids intestinale umana

Questo protocollo consente la differenziazione delle cellule pluripotenti umane in organoidi intestinali. Il protocollo imita il normale sviluppo umano differenziando le cellule in una popolazione di endoderma definitivo, endoderma dell'intestino posteriore e quindi epitelio intestinale. Ciò rende il protocollo adatto sia per lo studio dello sviluppo intestinale che per le applicazioni di modellizzazione delle malattie.

Generazione di organoidi intestinali derivati da hiPSC per applicazioni di modellizzazione dello sviluppo e delle malattie

Qui, descriviamo la preparazione di monostrati epiteliali intestinali derivati da organoidi umani per studiare la funzione, la permeabilità e il trasporto della barriera intestinale. Poiché gli organoidi rappresentano la risposta originale del tessuto epiteliale agli stimoli esterni, questi modelli combinano i vantaggi dell'espandibilità delle linee cellulari e la rilevanza e la complessità del tessuto primario.

Monostrato epiteliale derivato da organoidi: un modello in vitro clinicamente rilevante per la funzione di barriera intestinale

Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.

Combinazione di organoidi umani e tecnologia Organ-on-a-Chip per modellare la funzionalità specifica della regione intestinale

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi intestinali di ratto e utilizzarli in diverse applicazioni a valle. I ratti sono spesso un modello preclinico preferito e il robusto sistema di organoidi intestinali soddisfa la necessità di un sistema in vitro per accompagnare gli studi in vivo .

Generazione e manipolazione di organoidi intestinali di ratto

Questo studio delinea un protocollo per la generazione di monostrati 2D di organoidi suini derivati dall'intestino tenue e crasso. La crescita di questi monostrati è contrassegnata da valori TEER crescenti, che indicano una robusta integrità epiteliale. Inoltre, questi monostrati mostrano risposte secretorie fisiologiche negli esperimenti della camera di Ussing dopo l'applicazione della forskolina.

Organoidi intestinali suini bidimensionali che riflettono le proprietà fisiologiche dell'intestino nativo

Gli organoidi intestinali umani devono essere innervati per ricapitolare meglio la struttura e la funzione dell'intestino umano nativo. Qui, presentiamo un metodo per incorporare un sistema nervoso enterico in questi costrutti.

Innervazione di organoidi intestinali umani

Metodo per la misurazione di Cinetica fusione virale a livello di singola particella

Esplora l'analisi trascrittomica a singola cellula utilizzando organoidi intestinali umani. Questo metodo computazionale rivela l'eterogeneità cellulare nell'epitelio intestinale e identifica biomarcatori per malattie intestinali.

Utilizzo di organoidi intestinali umani per comprendere lepitelio dellintestino tenue a livello trascrizionale di una singola cellula (Video) | JoVE Journal

Utilizzo di organoidi intestinali umani per comprendere l'epitelio dell'intestino tenue a livello trascrizionale di una singola cellula

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