Name: Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Scopri metodi riproducibili per valutare l'impegno precoce delle cellule T FH specifiche per virus nei topi con infezione acuta da LCMV. Questa tecnica aiuta a ottimizzare la progettazione dei vaccini.

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (dal n. 32300785 al X.C.), del China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (n. BX20230449 a X.C.) e il National Science and Technology Major Project (n. 2021YFC2300602 a L.Y.).

Decifrare l'impegno precoce delle cellule T helper follicolari nell'infezione acuta da LCMV

<ol><li>O'shea, J. J., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+lineage+commitment+and+plasticity+of+helper+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells.</a> Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+follicular+helper+cell+biology%3A+A+decade+of+discovery+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases.</a> Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).</li>
<li>Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper t cells.</a> Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ICOS+receptor+instructs+T+follicular+helper+cell+versus+effector+cell+differentiation+via+induction+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6.</a> Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+expressing+follicular+helper+CD4+T+cells+are+fate+committed+early+and+have+the+capacity+to+form+memory%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory.</a> J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).</li>
<li>Johnston, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+and+BLIMP-1+are+reciprocal+and+antagonistic+regulators+of+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation.</a> Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).</li>
<li>Nurieva, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+mediates+the+development+of+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells.</a> Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).</li>
<li>Yu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+repressor+bcl-6+directs+T+follicular+helper+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment.</a> Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEF1+and+TCF1+orchestrate+T%28FH%29+differentiation+by+regulating+differentiation+circuits+upstream+of+the+transcriptional+repressor+bcl6%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6.</a> Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).</li>
<li>Wu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCF1+is+required+for+the+t+follicular+helper+cell+response+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection.</a> Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+TCF-1+initiates+the+differentiation+of+T%28FH%29+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection.</a> Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).</li>
<li>Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+that+control+the+expression+and+activity+of+bcl-6+in+th1+cells+to+regulate+flexibility+with+a+TFH-like+gene+profile%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile.</a> Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).</li>
<li>Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+STAT1+is+required+for+IL-6-mediated+bcl6+induction+for+early+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation.</a> J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+ezh2+primes+the+early+differentiation+of+follicular+helper+T+cells+during+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection.</a> Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezh2+programs+T%28FH%29+differentiation+by+integrating+phosphorylation-dependent+activation+of+bcl6+and+polycomb-dependent+repression+of+p19ARF%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF.</a> Nat Commun. 9 (1), 5452(2018).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((METTL3-dependent+m%286%29A+modification+programs+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation.</a> Nat Commun. 12 (1), 1333(2021).</li>
<li>Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT5+is+a+potent+negative+regulator+of+TFH+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation.</a> J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+KLF2+restrains+CD4%2B+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation.</a> Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).</li>
<li>Xiao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+e3+ubiquitin+ligase+itch+is+required+for+the+differentiation+of+follicular+helper+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells.</a> Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).</li>
<li>Baumjohann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+cluster+mir-17%7E92+promotes+TFH+cell+differentiation+and+represses+subset-inappropriate+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression.</a> Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+complex+mTORC2+promotes+the+longevity+of+virus-specific+memory+CD4%28%2B%29+T+cells+by+preventing+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis.</a> Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).</li>
<li>Hale, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+memory+CD4%2B+T+cells+with+commitment+to+T+follicular+helper-+and+T+helper+1-cell+lineages+are+generated+after+acute+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection.</a> Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenium-GPX4+axis+protects+follicular+helper+t+cells+from+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).</li>
<li>Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-specific+MHC-class+II-restricted+TCR-transgenic+mice%3A+Effects+on+humoral+and+cellular+immune+responses+after+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection.</a> Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).</li>
<li>Grosjean, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+enrichment+of+mouse+splenic+t+cells+for+ex+vivo+and+in+vivo+T+cell+receptor+stimulation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100961(2021).</li>
<li>Dowling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+bottom-up+proteomic+analysis+of+mouse+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen.</a> STAR Protoc. 1 (3), 100196(2020).</li>
<li>Choi, Y. S., Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+vector+expression+in+TCR+transgenic+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells.</a> Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).</li>
<li>Wu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+expansion+and+retroviral+transduction+of+mouse+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells.</a> J Immunol Methods. 488, 112931(2021).</li>
<li>He, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+CXCR5-+expressing+CD8%28%2B%29+T+cells+curtail+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection.</a> Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).</li>
<li>Crotty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+helper+CD4+T+cells+%28TFH%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Follicular helper CD4 T cells (TFH).</a> Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).</li>
<li>Breitfeld, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+B+helper+T+cells+express+CXC+chemokine+receptor+5%2C+localize+to+B+cell+follicles%2C+and+support+immunoglobulin+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production.</a> J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+mTORC1+promotes+the+generation+and+suppressive+function+of+follicular+regulatory+t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells.</a> Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phosphatase+pten+links+platelets+with+immune+regulatory+functions+of+mouse+T+follicular+helper+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 2762(2022).</li>
<li>Chen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+identification+of+T%28fh%2913+cells+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human.</a> J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

La ricerca nel campo delle cellule TFH è stata evidenziata sin dalla scoperta della funzione specializzata delle cellule TFH nell'aiutare le cellule B. Studi accumulati hanno indicato che la differenziazione delle cellule TFH è un processo multistadio e multifattoriale30, in cui l'impegno del destino delle cellule TFH è determinato nella fase iniziale5. Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi alla base delle cellule TFH differenziate precocemente è fondamentale per la biologia delle cellule TFH e per la progettazione razionale dei vaccini. In questo articolo, abbiamo fornito metodi per accedere all'impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche e per manipolare l'espressione genica nelle cellule TFH differenziate precocemente sfruttando il modello di infezione virale LCMV Armstrong, il topo SM transgenico TCR e la trasduzione mediata da retrovirus.
Il recettore delle chemochine CXCR5 è un importante marcatore di superficie che distingue le cellule TFH da altri sottogruppi di cellule TH CD4+ 6,7,8,31, rendendo così necessario il metodo di colorazione CXCR5 di elevata specificità e sensibilità nella ricerca sulle cellule TFH. Nello studio, è stato dimostrato un metodo di colorazione CXCR5 streptavidina-biotina in tre fasi per identificare il sottogruppo di cellule TFH (Figura 1C). Sebbene la perdita di specificità sia un problema appiccicoso per gli approcci di colorazione con anticorpi a due o tre streptococco di alta sensibilità, è stato riscontrato che il segnale di fluorescenza mediante colorazione con anticorpi CXCR5 in tre fasi si sovrapponeva quasi completamente al segnale GFP nelle cellule T SM CD4+ reporter CXCR5-GFP29 al giorno 3 dopo l'infezione (Figura 1D), suggerendo il raggiungimento sia della specificità che della sensibilità mediante il metodo di colorazione degli anticorpi CXCR5 in tre fasi. In effetti, questa strategia di colorazione CXCR5 a tre streptococco è collaudata e ha aiutato i ricercatori a studiare meglio la biologia delle cellule TFH 11,14,15,21 e altri tipi di cellule T che esprimono CXCR529,32.
Dopo l'infezione e l'immunizzazione, il destino-impegno delle cellule TFH è generalmente modellato da una differenziazione biforcata di cellule T CD4+ naive in cellule TFH o cellule T H effettrici non-TFH 2,3,30. Questo studio ha mostrato la biforcazione bilanciata delle cellule TFH e TH1 nelle cellule T CD4+ SM trasferite. Inoltre, queste cellule T SM CD4+ trasferite hanno una quantità cellulare adeguata nella fase iniziale dell'infezione, fungendo così da modello adatto per lo studio della differenziazione delle cellule TFH. Certamente, l'espressione ectopica di Bcl-6 mediata da retrovirus nelle cellule T CD4+ SM trasferite era fortemente distorta verso la differenziazione delle cellule TFH rispetto a quella delle cellule T CD4+ SM di controllo (86,6% vs. 53,8%) (Figura 3C), che è allineata con il precedente rapporto6 e dimostra ulteriormente l'accuratezza dei protocolli descritti nello studio. In alternativa, i suddetti protocolli possono essere applicati anche al knock-down mediato da retrovirus di geni interessati (ad esempio, bcl6, Tcf7) in cellule T SM CD4+ 11 attivate precocemente (dati non mostrati).
Una limitazione del protocollo è il problema della tempistica (più di 2 ore in totale) e il processo in più fasi del metodo di colorazione CXCR5 in tre fasi. In alternativa, nella ricerca sulle cellule TFH sono stati applicati anche metodi di colorazione18,33 o 4,9,34 CXCR5 in due fasi. È giustificato un confronto tra la specificità/sensibilità di questi metodi di colorazione CXCR5.
In sintesi, l'attuale studio ha fornito protocolli per accedere alle cellule TFH specifiche del virus differenziate precocemente e per studiare i geni interessati che potenzialmente regolano la differenziazione delle cellule TFH . Questi protocolli alimenteranno le indagini sull'impegno precoce del destino delle cellule TFH .

Incontrando diversi agenti patogeni o minacce, le cellule T CD4+ naive adattano le loro risposte immunitarie differenziandosi in vari sottogruppi di cellule T helper (TH) con funzioni specializzate1. Nello scenario di infezione virale acuta, gran parte delle cellule T CD4+ naive si differenziano in cellule T helper follicolari (TFH) che forniscono aiuto alle cellule B 2,3. Distinte da altri sottogruppi di cellule TH CD4+ (ad esempio, cellule TH1, TH2, TH9 e TH17), le cellule TFH esprimono un livello sostanziale di CXCR5, che è il recettore delle chemochine per la chemochina CXCL13 che indirizza le cellule B, consentendo alle cellule TFH di migrare nei follicoli delle cellule B. Nei follicoli delle cellule B, le cellule TFH aiutano le cellule B affini nell'avvio e nel mantenimento delle reazioni del centro germinale, consentendo così una rapida produzione di anticorpi ad alta affinità e una memoria umorale a lungo termine 2,3.
In caso di infezione virale acuta, l'impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche avviene entro 72 ore 4,5 ed è controllato dal repressore trascrizionale del linfoma-6 a cellule B (Bcl-6)5,6,7,8, che agisce come "regolatore principale" che governa le decisioni sul destino delle cellule T FH. Il deficit di Bcl-6 attenua gravemente la differenziazione delle cellule TFH, mentre l'espressione ectopica di Bcl-6 promuove sostanzialmente l'impegno del destino delle cellule TFH. Oltre a Bcl-6, diverse molecole sono coinvolte nell'istruire l'impegno precoce del destino delle cellule TFH. I fattori di trascrizione TCF-1 e LEF-1 avviano la differenziazione delle cellule TFH attraverso l'induzione di Bcl-6 9,10,11. L'inibizione di Blimp1, sia da parte di Bcl-6 che di TCF-1, è necessaria per l'impegno precoce del destino delle cellule TFH 11,12. STAT1 e STAT3 sono necessari anche per la differenziazione precoce delle cellule TFH 13. Inoltre, le modificazioni epigenetiche da parte dell'istone metiltransferasi EZH214,15 e della m6A metiltransferasi METTL316 aiutano a stabilizzare i programmi trascrizionali delle cellule TFH (in particolare Bcl6 e Tcf7) e quindi a innescare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH. Mentre i progressi, comprese le molecole sopra menzionate e altre, riassunte altrove3, sono stati fatti nella comprensione delle regolazioni trascrizionali ed epigenetiche dell'impegno precoce del destino delle cellule TFH, molecole precedentemente sconosciute rimangono da imparare.
Nel modello murino di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV), le cellule T CD4+ TCR-transgeniche SMARTA (SM) CD4+ congeniche trasferite in modo adottivo, che riconoscono specificamente l'epitopo della glicoproteina LCMVI-A bGP66-77, subiscono la differenziazione delle cellule TFH o TH1 durante l'infezione virale. Questo modello di differenziazione della biforcazione TFH/TH1 supporta l'avanzamento del modello di infezione SM/LCMV acuta nello studio della biologia delle cellule TFH virus-specifiche. Infatti, il modello di infezione SM/LCMV acuta è stato ampiamente utilizzato nel campo della ricerca sulle cellule TFH e ha svolto un ruolo cruciale nelle scoperte fondamentali nella biologia delle cellule TFH. Ciò include l'identificazione del già citato Bcl-6 come fattore di trascrizione che definisce il lignaggio delle cellule TFH 5,6, nonché altri importanti fattori trascrizionali (ad esempio, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 e Itch19) che guidano la differenziazione delle cellule T FH, le regolazioni post-trascrizionali ( ad esempio, METTL316 e miR-17~9220) della differenziazione delle cellule TFH, della memoria e della plasticità delle cellule TFH 21,22 e delle strategie di vaccinazione razionali mirate alle cellule TFH (ad esempio, il selenio23).
Il presente studio descrive metodi riproducibili per accedere all'impegno del destino precoce delle cellule TFH specifiche del virus, tra cui (1) la creazione di un modello murino di chimera SM acuta infettato da LCMV adatto per l'accesso alle cellule TFH differenziate precocemente, (2) l'esecuzione di colorazioni con citometria a flusso di molecole correlate alle celluleT FH differenziate precocemente e (3) l'esecuzione di manipolazioni geniche basate su vettori retrovirali in SM CD4+ Cellule T. Questi metodi saranno utili per gli studi che indagano l'impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche.

<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>4% soluzione di correzione della paraformaldeide, 4% PFA</td><td>Beyotime</td><td>P0099-500mL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtro cellulare</td><td>m Merck</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-topo TCR V&alpha; 2 (clone B20.1)</td><td>Biolegend</td><td>127812</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 anti-topo CD45.1 (clone A20)</td><td>Biolegend</td><td>110724</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>APC anti-topo CD25 (clone PC61)</td><td>Biolegend</td><td>101910</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>B6 CD45.1 (B6. SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) topo</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002014</td><td></td></tr><tr><td>BeaverBeads Streptavidin</td><td>Beaver</td><td>22321-10</td><td></td></tr><tr><td>Biotina anti-topo F4/80 Anticorpo (clone BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123106</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Biotina Rat anti-mouse CD11c (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117304</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115504</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Biotina di ratto anti-topo CD8a (clone 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100704</td><td>diluizione 1:200 Biotina</td></tr><tr><td>di ratto anti-topo NK-1.1 (clone PK136)</td><td>Biolegend</td><td>108704</td><td>diluizione 1:200 Biotina</td></tr><tr><td>di ratto anti-topo TER-119/Cellule eritroidi (clone TER-119)</td><td>Biolegend</td><td>116204</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>albumina sierica bovina, BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10)</td><td>Biolegend</td><td>644816</td><td>diluizione 1:100</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12)</td><td>Biolegend</td><td>135220</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>C57BL/6J (B6) mouse</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>CXCR5-GFP knock-in reporter mouse</td><td></td><td></td><td>In casa; la linea di topo knock-in CXCR5-GFP è stata generata dall'inserimento di un costrutto IRES-GFP dopo il frame di lettura aperto di Cxcr5.</td></tr><tr><td>DMEM 10% medio</td><td></td><td></td><td>DMEM medio contenente il 10% di FBS</td></tr><tr><td>DMEM medio</td><td>Gibco</td><td>11885092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>FACSFortesa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino, FBS</td><td>Sigma</td><td>F8318</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo (versione 10.4.0)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foxp3/Set di tamponi per colorazione con fattore di trascrizione</td><td>Invitrogen</td><td>00-5523-00</td><td>Il kit contiene tre reagenti: a. Concentrato di fissaggio/permeabilizzazione (4X); b. Diluente di fissaggio/permeabilizzazione; c. Tampone di permeabilizzazione.</td></tr><tr><td>Anticorpo IgG anti-ratto di capra (H+L),</td><td>laboratori a vettore</td> biotinilato <td>BA-9400-1.5</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System</td><td>ThermoFisher Scientific</td> Tampone di isolamento ThermoFisher Scientific <td></td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td>FACS contenente lo 0,5% di BSA e 2mM EDTA</td>LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV)Azienda cinese di peptidi <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit di colorazione per cellule morte nel vicino infrarosso fissabile LIVE/DEAD, per eccitazione a 633 o 635 nm Life</td><td>Technologies</td><td>L10199</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>MigR1</td><td>addgene</td><td>#27490</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCL-Eco</td><td>addgene</td><td>#12371</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3)</td><td>Biolegend</td><td>104508</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>PE Topo anti-Bcl-6 (clone K112-91)</td><td>BD Biosciences</td><td>561522</td><td>diluizione 1:50</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato, PBS</td><td>Gibco</td><td>10010072</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Solarbio</td><td>H8761</td><td></td></tr><tr><td>Ratto purificato Anti-Topo CXCR5 (clone 2G8)</td><td>BD Biosciences</td><td>551961</td><td>diluizione 1:50</td></tr><tr><td>PerCP anti-topo CD4 (clone RM4-5)</td><td>Biolegend</td><td>100538</td><td>diluizione 1:200</td></tr><tr><td>ricombinante murina IL-2</td><td>Gibco</td><td>212-12-1MG</td><td></td></tr><tr><td>tampone per lisi dei globuli rossi</td><td>Beyotime</td><td>C3702-500mL</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 2%</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 medio contenente il 2% di FBS</td></tr><tr><td>SMARTA (SM) TCR topo transgenico</td><td></td><td></td><td>La linea transgenica SM TCR nel nostro laboratorio è un dono del Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Inoltre, questa linea di topi può essere ottenuta anche da The Jackson Laboratory (colorazione#: 030450).</td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di colorazione <td>PBS contenente il 2% di FBS e lo 0,01% di NaN3</td></tr><tr><td>Streptavidina PE-Cianine7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td>Diluizione 1:200</td></tr><tr><td>TCF1/TCF7 (C63D9) Corpo monoclonale di coniglio (Alexa Fluor 488 Conjugate)&nbsp;</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>6444S</td><td>Diluizione 1:400</td></tr><tr><td>TFH tampone</td><td></td><td></td> di colorazione cellulare <td>Tampone FACS contenente l'1% di BSA e il 2% di siero di topo</td></tr><tr><td>Reagente TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIRUMIR2700</td><td></td></tr></tbody></table>

accesso alla differenziazione precoce della cellula t cd4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da lcmv

Accessing Early Differentiation of Virus-Specific Follicular Helper CD4+ T Cell in Acute LCMV-Infected Mice

Le cellule T helper follicolari (TFH) sono percepite come una linea di cellule T CD4+ indipendente che aiuta le cellule B affini a produrre anticorpi ad alta affinità, stabilendo così un'immunità umorale a lungo termine. Durante l'infezione virale acuta, l'impegno del destino delle cellule TFH specifiche del virus è determinato nella fase iniziale dell'infezione e le indagini sulle cellule TFH differenziate precocemente sono cruciali per comprendere l'immunità umorale dipendente dalle cellule T e ottimizzare la progettazione del vaccino. Nello studio, utilizzando un modello murino di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV) e il topo TCR-transgenico SMARTA (SM) con cellule T CD4+ che riconoscono specificamente l'epitopo della glicoproteina LCMV I-AbGP66-77, abbiamo descritto le procedure per accedere all'impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus sulla base di colorazioni con citometria a flusso. Inoltre, sfruttando la trasduzione retrovirale delle cellule T CD4+ SM, vengono forniti anche metodi per manipolare l'espressione genica nelle celluleT FH virus-specifiche differenziate precocemente. Pertanto, questi metodi aiuteranno negli studi che esplorano i meccanismi alla base dell'impegno precoce delle cellule TFH specifiche del virus.

Caratteristiche delle cellule TFH virus-specifiche differenziate precocemente durante l'infezione acuta da LCMV Per sondare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche, le cellule T CD4+ SM congeniche naive che riconoscono specificamente l'epitopo LCMV GP I-AbGP66-77 sono state trasferite adottivamente in riceventi CD45.2+ C57BL/6. Il giorno successivo, questi riceventi sono stati infettati per via endovenosa con un dosaggio elevato di LCMV Armstrong a risoluzione acuta (Figura 1A). Il giorno 3 dopo l'infezione, gli splenociti dei riceventi C57BL/6 sono stati analizzati mediante citometria a flusso e i risultati hanno indicato una grande quantità di cellule T CD45.1+ SM CD4+ trasferite (~10% del totale delle cellule T CD4+) (Figura 1B), che ha fornito un numero sufficiente di cellule T CD4+ specifiche per ulteriori indagini. Ulteriori analisi delle cellule T CD4+ SM trasferite hanno mostrato la co-espressione di CXCR5 e Bcl-6/TCF-1 e l'espressione reciproca di CXCR5 e CD25/T-bet, definendo così le linee TFH (CXCR5+Bcl-6+ o CXCR5+TCF-1+) e TH1 (CXCR5-CD25+ o CXCR5-T-bet+) (Figura 1C). Per valutare la specificità e la sensibilità della colorazione degli anticorpi CXCR5 presentata nello studio, abbiamo ulteriormente incrociato la suddetta linea di topi SM CD45.1+ con la linea di topi knock-in CXCR5-GFP, che è stata generata dall'inserimento di un costrutto IRES-GFP dopo il frame di lettura aperto di Cxcr529. Quindi, le cellule SM reporter CD45.1+ CXCR5-GFP sono state trasferite nei riceventi C57BL/6. Questi riceventi sono stati infettati con LCMV Armstrong e i loro splenociti sono stati analizzati il giorno 3 dopo l'infezione. Infatti, il segnale di fluorescenza del metodo di colorazione degli anticorpi CXCR5 nello studio si sovrapponeva finemente al segnale GFP nelle cellule T CD4+ SM CD4+ del reporter CXCR5-GFP trasferite al giorno 3 dopo l'infezione (Figura 1D), indicando l'elevata specificità del metodo di colorazione degli anticorpi CXCR5 in tre fasi.
Sovraespressione di Bcl-6 basata su retrovirus nelle cellule T CD4+ SM Bcl-6 è una delle molecole più importanti nel favorire il differenziamento delle cellule TFH 6,7,8. Per accertare l'affidabilità dell'attuale protocollo nell'accesso alle cellule TFH differenziate precocemente, le cellule T CD45.1+ SM CD4+ sono state attivate in vivo e trasdotte con surnatante retrovirale da plasmidi MigR1 o cellule 293T trasfettate con plasmidi di sovraespressione MigR1-Bcl6 (Figura 2 e Figura 3A). Le cellule T SM CD4+ trasdotte da retrovirus sono state successivamente trasferite in modo adottivo nei riceventi di C57BL/6, che sono stati poi infettati con LCMV Armstrong (Figura 3B). Il giorno 3 dopo l'infezione, abbiamo riscontrato una biforcazione bilanciata delle cellule TFH e TH1 nelle cellule T CD4+ MigR1-SM, mentre una differenziazione predominante diretta dalle cellule TFH T nelle cellule T CD4+ MigR1-Bcl6-SM (Figura 3C). Coerentemente, il livello di espressione di Bcl-6 è stato migliorato nelle cellule T CD4+ MigR1-Bcl6-SM rispetto a quello nelle cellule T CD4+ MigR1-SM (Figura 3D). Pertanto, il fenotipo che la differenziazione ectopica delle cellule TFH 6 guidata dall'espressione di Bcl-6 è stato finemente riprodotto seguendo l'attuale protocollo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig01.jpg"> Figura 1: Analisi in citometria a flusso dell'impegno precoce delle cellule SM TFH durante l'infezione da LCMV di Armstrong. (A) Disegno sperimentale. Le cellule T spleniche CD4+ sono state raccolte da topi SM CD45.1+ e poi trasferite in modo adottivo in riceventi C57BL/6 (CD45.2+). Il giorno successivo, questi destinatari sono stati infettati con LCMV Armstrong. Il giorno 3 dopo l'infezione, le cellule SM CD45.1+ trasferite dalla milza dei riceventi sono state analizzate mediante citometria a flusso. (B) Dati rappresentativi della citometria a flusso che mostrano la strategia di gating delle cellule T CD45.1+ SM CD4+ trasferite dalla milza dei riceventi al giorno 3 dopo l'infezione da LCMV Armstrong. (C) Dati rappresentativi della citometria a flusso che mostrano co-colorazioni di CXCR5 e di altre molecole associate alle cellule TFH (Bcl-6, TCF-1, CD25 e T-bet) nelle cellule SM CD45.1+ trasferite dalla milza dei riceventi al giorno 3 dopo l'infezione da LCMV Armstrong. (D) Dati rappresentativi di citometria a flusso che mostrano co-colorazioni di anticorpi coniugati a fluorescenza contro CXCR5 e segnale GFP in cellule SM reporter CD45.1+ CXCR5-GFP trasferite dalla milza dei riceventi al giorno 3 dopo l'infezione da LCMV Armstrong. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig02.jpg"> Figura 2: Trasduzione retrovirale nelle cellule T CD4+ SM. (A) Diagramma schematico della produzione di retrovirus e della trasduzione retrovirale nelle cellule T SM CD4+ . Per la produzione di retrovirus, le cellule 293T seminate in una piastra a 6 pozzetti sono state trasfettate con plasmidi di DNA bersaglio quando la densità cellulare raggiunge la confluenza dell'≥80%. Quindi, il surnatante di coltura cellulare contenente retrovirus è stato raccolto 72 ore dopo la trasfezione e immediatamente utilizzato o conservato a -80 °C. Per la trasduzione retrovirale nelle cellule T SM CD4+ , a un topo SM CD45.1+ sono stati iniettati per via endovenosa 200 μg di peptide LCMV GP61-77 . Quindi, la milza è stata sezionata da un topo SM 16-18 ore dopo l'iniezione di peptidi ed è stato rilevato lo stato di attivazione delle cellule T CD4+ spleniche. Le cellule T CD4+ SM attivate sono state trasdotte con surnatante di coltura contenente retrovirus e coltivate in vitro per 48 ore prima di accedere all'efficienza di trasduzione. (B) Imaging al microscopio a fluorescenza di GFP in cellule 293T trasfettate con DNA plasmidico. Barra della scala: 400 μm. (C) Analisi in citometria a flusso dei livelli di espressione di CD25 e CD69 in cellule T CD4+ naïve spleniche da topo naïve (naive, a sinistra) o cellule T SM CD4+ spleniche da topo SM iniettato con peptidi LCMV GP61-77 (attivato, a destra). (D) Analisi in citometria a flusso dell'espressione di GFP in cellule T SM CD4+ trasdotte da retrovirus (trasdotte, a sinistra) o in cellule T SM CD4+ non trasdotte da retrovirus (non trasdotte, a sinistra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66752/66752fig03.jpg"> Figura 3: Effetti della sovraespressione di Bcl-6 nell'impegno del destino cellulare SM TFH . (A) Mappe lineari delle dorsali retrovirali di MigR1 (pannello superiore) e del vettore MigR1 modificato con la regione CDS di Bcl6 a monte di IRES-GFP (MigR1-Bcl6) (pannello inferiore). (B) Disegno sperimentale. Le cellule T SM CD4+ trasdotte con MigR1 o MigR1-Bcl6 sono state trasferite adottivamente in riceventi C57BL/6 (CD45.2+) un giorno prima di LCMV Armstrong. Il giorno 3 dopo l'infezione, le cellule T CD45.1+ SM CD4+ trasferite dalla milza dei riceventi sono state analizzate mediante citometria a flusso. (C) Analisi in citometria a flusso di CXCR5 e CD25 in cellule T GFP+ trasdotte in MigR1 o MigR1-Bcl6 SM CD4+ . I numeri adiacenti al gate indicano le frequenze delle cellule TFH nelle cellule T SM CD4+ . (D) Analisi in citometria a flusso del livello di espressione di Bcl-6 in cellule T SM CD4+ trasdotte con MigR1 o MigR1-Bcl6. MFI, intensità media di fluorescenza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66752/66752fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

L'attuale studio mostra protocolli per valutare l'impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus e manipolare l'espressione genica in queste cellule.

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

Follicular Helper T (TFH) cells are perceived as an independent CD4+ T cell lineage that assists cognate B cells in producing high-affinity antibodies, ...

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Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV (Video) | JoVE Journal

Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4⁺ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV

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