Un test in vitro per studiare la migrazione piastrinica utilizzando tethers avidina-biotina funzionalizzati con RGD

Le piastrine sono fondamentali per prevenire la perdita di sangue dopo una lesione dei vasi, combattere le infezioni e mantenere l'integrità vascolare durante l'infiammazione. Mentre i tappi emostatici richiedono l'attivazione collettiva e l'aggregazione delle piastrine, il loro ruolo nella protezione dei vasi sanguigni infiammati viene svolto a livello di singola cellula. In questo contesto, studi recenti hanno scoperto che le piastrine possono migrare autonomamente, un processo che dipende dal meccanorilevamento del loro microambiente adesivo.

Questo approccio consente un controllo preciso delle proprietà adesive del substrato e funge da semplice test in vitro per studiare i meccanismi alla base della migrazione piastrinica. I risultati indicano che la migrazione delle piastrine che si lega ai ligandi delle integrine può esercitare una forza in grado di interrompere il legame avidina-biotina. Questo test fornisce un metodo semplice e affidabile per visualizzare la migrazione piastrinica.

In combinazione con l'imaging di cellule vive, ci aiuterà a comprendere meglio l'interazione e la regolazione di diversi componenti del citoscheletro in questa importante funzione piastrinica. Per iniziare, il coperchio di vetro sonicato scivola in acido nitrico al 20% per un minuto, seguito da sonicazione in isopropanolo, etanolo e acqua per un minuto ciascuno. Trattare i vetrini coprioggetti pre-puliti con plasma di ossigeno in un detergente al plasma per due minuti, quindi assemblarli con vetrini appiccicosi.

Riempire ora il canale con 2,5 microlitri di PLL-PEG-biotina diluiti in 97,5 microlitri di PLL-PEG e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte con PBS. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di neutravidina-FITC e incubare per 30 minuti al buio a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte con PBS. Infine, aggiungere 100 microlitri di biotina ciclo-RGD, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e lavare tre volte con PBS.

Dopo aver anestetizzato il topo e rimosso la pelle toracica, inserire l'ago tra la seconda e la terza costola sul lato sinistro dello sterno per prelevare il sangue dal cuore. Mescolare il sangue con un millilitro di tampone di Tyrode e centrifugare a 70 g per 20 minuti a temperatura ambiente con il freno spento, quindi prelevare la parte superiore contenente plasma ricco di piastrine. Mescolare con tre millilitri di tampone di Tyrode e aggiungere 100 nanogrammi per millilitro di prostaciclina per prevenire l'attivazione piastrinica.

Successivamente, centrifugare a 1200 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di tampone di Tyrode. Quindi, utilizzando un emocitometro, misurare la conta piastrinica.

Per iniziare, prelevare le piastrine di topo nei canali di rivestimento cRGD di biotina-neutravidina-biotina e registrare la migrazione piastrinica in tempo reale utilizzando un microscopio invertito dotato di un incubatore a tavolino. Per contare i numeri di adesione o migrazione piastrinica, fare clic con il pulsante destro del mouse sul menu a discesa dello strumento punto nella barra degli strumenti e selezionare lo strumento multipunto. Estrarre la distanza di migrazione da campioni fissati misurando la lunghezza del percorso di migrazione impressa nel rivestimento neutravidina-FITC.

Fare clic con il pulsante destro del mouse sul menu a discesa dello strumento linea retta nella barra degli strumenti e selezionare lo strumento linea della mano libera. Per quantificare la forma delle piastrine, selezionare Immagine, Regola e Soglia nella barra degli strumenti per generare maschere binarie segmentando le piastrine fluorescenti. Selezionare i descrittori di forma in Analizza e imposta misurazioni, quindi selezionare Visualizza risultati utilizzando Analizza e Analizza particelle.

Le piastrine hanno mostrato una migrazione ottimale al 2,5% di concentrazione di PLL-PEG-biotina. La migrazione è stata ridotta sia a densità di leganti più basse che più alte. Le piastrine si diffondono in modo inadeguato all'1% di densità del ligando, indicata da un'area e un perimetro bassi, suggerendo un'insufficiente attivazione delle integrine.

Al 2,5% di densità del ligando, le piastrine si diffondono efficacemente, interrompendo i ligandi cRGD e migrando. L'elevata densità dei ligandi ha causato la diffusione delle piastrine senza polarizzazione, riducendo la migrazione dovuta alla mancata rottura dei ligandi cRGD.