Name: Quantificazione della morte cellulare indotta da citochine in organoidi del colon umano mediante microscopia a fluorescenza dal vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-02T13:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Impara a quantificare la morte cellulare indotta da citochine in organoidi del colon umano mediante microscopia a fluorescenza dal vivo. Questo metodo robusto permette di analizzare le risposte a livello di singolo organoide.

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Gli autori desiderano ringraziare i pazienti per il loro consenso informato e la partecipazione allo studio di ricerca, e il personale clinico per la loro eccellente assistenza. La Figura 1A è stata creata con BioRender.com. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Science Foundation Ireland, in particolare un premio per lo sviluppo della carriera (CDA) a K.N. (SFI-13/CDA/2171), una sovvenzione per un centro di ricerca (SFI-12/RC/2273) e un premio per i raggi del centro di ricerca (SFI-14/SP/2710) ad APC Microbiome Ireland. P.F. ha anche ricevuto finanziamenti da SFI/20/RP/9007.

Quantificazione della morte cellulare nei colonoidi umani in risposta a perturbageni citotossici

<ol><li>Patankar, J. V., Becker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+the+gut+epithelium+and+implications+for+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Cell death in the gut epithelium and implications for chronic inflammation.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 17 (9), 543-556 (2020).</li>
<li>Zeissig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+epithelial+apoptosis+and+barrier+repair+in+active+Crohn%27s+disease+by+tumour+necrosis+factor+alpha+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Downregulation of epithelial apoptosis and barrier repair in active Crohn's disease by tumour necrosis factor alpha antibody treatment.</a> Gut. 53 (9), 1295-1302 (2004).</li>
<li>Bartee, E., Mcfadden, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+synergy%3A+An+underappreciated+contributor+to+innate+anti-viral+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine%22%5BJournal%5D)">Cytokine synergy: An underappreciated contributor to innate anti-viral immunity.</a> Cytokine. 63 (3), 237-240 (2013).</li>
<li>Fish, S. M., Proujansky, R., Reenstra, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effects+of+interferon+%CE%B3+and+tumour+necrosis+factor+%CE%B1+on+T84+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Synergistic effects of interferon γ and tumour necrosis factor α on T84 cell function.</a> Gut. 45 (2), 191-198 (1999).</li>
<li>Wakisaka, Y., Sugimoto, S., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+medicine+for+Inflammatory+Bowel+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Organoid medicine for Inflammatory Bowel Disease.</a> Stem Cells. 40 (2), 123-132 (2022).</li>
<li>Flood, P., Hanrahan, N., Nally, K., Melgar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids%3A+Modeling+gastrointestinal+physiology+and+immunopathology+-+current+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids: Modeling gastrointestinal physiology and immunopathology - current applications and limitations.</a> Eur J Immunol. 54 (2), e2250248(2024).</li>
<li>Matsuzawa-Ishimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intestinal+organoid-based+platform+that+recreates+susceptibility+to+t-cell-mediated+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An intestinal organoid-based platform that recreates susceptibility to t-cell-mediated tissue injury.</a> Blood. 135 (26), 2388-2401 (2020).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+responses+to+IL-17+in+adult+stem+cell-derived+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Crohns+Colitis%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial responses to IL-17 in adult stem cell-derived human intestinal organoids.</a> J Crohns Colitis. 16 (12), 1911-1923 (2022).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+synergises+with+IFN-%CE%B3+to+induce+caspase-8-JAK1%2F2-STAT1-dependent+death+of+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">TNF-α synergises with IFN-γ to induce caspase-8-JAK1/2-STAT1-dependent death of intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 12 (10), 864(2021).</li>
<li>Flood, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sensor-associated+type+I+interferon+signaling+is+increased+in+ulcerative+colitis+and+induces+jak-dependent+inflammatory+cell+death+in+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">DNA sensor-associated type I interferon signaling is increased in ulcerative colitis and induces jak-dependent inflammatory cell death in colonic organoids.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 323 (5), G439-G460 (2022).</li>
<li>Grabinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+intestinal+crypt+organoids+as+a+model+system+for+assessing+cell+death+induction+in+intestinal+epithelial+cells+and+enteropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy.</a> Cell Death Dis. 5 (5), e1228(2014).</li>
<li>Bode, K. J., Mueller, S., Schweinlin, M., Metzger, M., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fast+and+simple+fluorometric+method+to+detect+cell+death+in+3D+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A fast and simple fluorometric method to detect cell death in 3D intestinal organoids.</a> Biotechniques. 67 (1), 23-28 (2019).</li>
<li>Mertens, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-repurposing+screen+on+patient-derived+organoids+identifies+therapy-induced+vulnerability+in+KRAS-mutant+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Drug-repurposing screen on patient-derived organoids identifies therapy-induced vulnerability in KRAS-mutant colon cancer.</a> Cell Rep. 42 (4), 112324(2023).</li>
<li>Vandussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. 64 (6), 911-920 (2015).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Woznicki, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+BCL-G+regulates+secretion+of+inflammatory+chemokines+but+is+dispensable+for+induction+of+apoptosis+by+IFN-%CE%B3+and+TNF-%CE%B1+in+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Human BCL-G regulates secretion of inflammatory chemokines but is dispensable for induction of apoptosis by IFN-γ and TNF-α in intestinal epithelial cells.</a> Cell Death Dis. 11 (1), 68(2020).</li>
<li>Edgar, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture-associated+DNA+methylation+changes+impact+on+cellular+function+of+human+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Culture-associated DNA methylation changes impact on cellular function of human intestinal organoids.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (6), 1295-1310 (2022).</li>
<li>Mubaid, F., Brown, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Less+is+more%3A+Longer+exposure+times+with+low+light+intensity+is+less+photo-toxic%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+Today%22%5BJournal%5D)">Less is more: Longer exposure times with low light intensity is less photo-toxic.</a> Microscopy Today. 25 (6), 26-35 (2017).</li>
<li>Ziegler, U., Groscurth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+features+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22News+Physiol+Sci%22%5BJournal%5D)">Morphological features of cell death.</a> News Physiol Sci. 19 (3), 124-128 (2004).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Res. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Tamura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+anticancer+agents+using+patient-derived+tumor+organoids+characteristically+similar+to+source+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Rep%22%5BJournal%5D)">Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues.</a> Oncol Rep. 40 (2), 635-646 (2018).</li>
<li>Karki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+TNF-%CE%B1+IFN-%CE%B3+triggers+inflammatory+cell+death%2C+tissue+damage%2C+and+mortality+in+SARS-CoV-2+infection+and+cytokine+shock+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergism of TNF-α IFN-γ triggers inflammatory cell death, tissue damage, and mortality in SARS-CoV-2 infection and cytokine shock syndromes.</a> Cell. 184 (1), 149-168 (2021).</li>
<li>Geary, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+synergy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Understanding synergy.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (3), E237-E253 (2013).</li>
<li>Duarte, D., Vale, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+synergism+in+drug+combinations+and+reference+models+for+future+orientations+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Res+Pharmacol+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Evaluation of synergism in drug combinations and reference models for future orientations in oncology.</a> Curr Res Pharmacol Drug Discov. 3, 100110(2022).</li>
<li>Wong, F. C., Woo, C. C., Hsu, A., Tan, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anti-cancer+activities+of+Vernonia+amygdalina+extract+in+human+breast+cancer+cell+lines+are+mediated+through+caspase-dependent+and+p53-independent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The anti-cancer activities of Vernonia amygdalina extract in human breast cancer cell lines are mediated through caspase-dependent and p53-independent pathways.</a> PLoS One. 8 (10), e78021(2013).</li>
<li>Ryall, K. A., Tan, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+approaches+for+advancing+the+discovery+of+effective+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cheminform%22%5BJournal%5D)">Systems biology approaches for advancing the discovery of effective drug combinations.</a> J Cheminform. 7, 7(2015).</li>
<li>Sukho, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+cell+seeding+density+and+inflammatory+cytokines+on+adipose+tissue-derived+stem+cells%3A+An+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Effect of cell seeding density and inflammatory cytokines on adipose tissue-derived stem cells: An in vitro study.</a> Stem Cell Rev Rep. 13 (2), 267-277 (2017).</li>
<li>Vaughan-Jackson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+dependent+regulation+of+inflammatory+responses+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Density dependent regulation of inflammatory responses in macrophages.</a> Front Immunol. 13, 895488(2022).</li>
<li>Lumibao, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+extracellular+matrix+on+the+precision+medicine+utility+of+pancreatic+cancer+patient-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The impact of extracellular matrix on the precision medicine utility of pancreatic cancer patient-derived organoids.</a> bioRxiv. , 10.1101/2023.01.26.525757 (2023).</li>
<li>Lee, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-%CE%B1+induces+LGR5%2B+stem+cell+dysfunction+in+patients+with+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">TNF-α induces LGR5+ stem cell dysfunction in patients with Crohn's disease.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 13 (3), 789-808 (2022).</li>
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K.N. ha ricevuto finanziamenti per la ricerca da AbbVie Inc. durante il periodo in cui i lavori sono stati completati. Questo finanziamento è stato effettuato nel contesto di un premio spoke di un centro di ricerca (SFI-14/SP/2710) ad APC Microbiome Ireland.

Sono stati sviluppati diversi metodi per l'analisi quantitativa della morte cellulare negli organoidi intestinali. L'esame dell'alterazione della morfologia degli organoidi intestinali mediante microscopia ottica è un approccio semplice per quantificare gli effetti delle sostanze citotossiche11. Tuttavia, i cambiamenti morfologici non sono una misura diretta della morte cellulare e il metodo è solo semiquantitativo. Un altro metodo consiste nel valutare l'attività metabolica degli organoidi utilizzando un test MTT o ATP10,11. È importante notare che questi test possono determinare solo i cambiamenti nella vitalità cellulare e devono essere convalidati con un test di morte cellulare. Sono stati riportati altri saggi fluorometrici di morte cellulare con coloranti leganti il DNA12,13. È possibile un approccio non di imaging che utilizza un lettore di micropiastre fluorescente e consente un'elevata produttività12. Tuttavia, questo metodo misura il segnale medio di un intero pozzo, rendendolo inadatto a popolazioni eterogenee. Richiede inoltre l'uso di un lettore di micropiastre con regolazione dell'altezza Z. Le tecniche basate sull'imaging fluorescente possono essere utilizzate per l'analisi di singoli organoidi e per l'acquisizione di dati cellulari/subcellulari e morfologici. I sistemi automatizzati di imaging confocale ad alto contenuto (HCI) possono generare grandi quantità di dati a un throughput elevato13. Sfortunatamente, l'HCI confocale necessita di apparecchiature specializzate, utilizza protocolli complessi, in genere richiede un software di analisi delle immagini commerciale ed è costosa.
Il nostro protocollo per l'analisi quantitativa della morte delle cellule colonoidi in più punti temporali è diretto, semplice ed economico. Tuttavia, rispetto ai sistemi automatizzati di lettura HCI e piastre, richiede molto tempo e ha una produttività ridotta. Un altro limite del nostro metodo è l'uso della microscopia a campo largo rispetto alla microscopia confocale. La microscopia confocale è più adatta per l'imaging di campioni 3D spessi come gli organoidi, in quanto riduce il segnale sfocato e può acquisire sezioni ottiche seriali (Z-stack). Tuttavia, l'imaging confocale richiede in genere tempi di acquisizione più lunghi e laser ad alta intensità che aumentano la fototossicità/fotosbiancamento. È fondamentale notare che i coloranti fluorescenti per la morte cellulare come SYTOX Green sono adatti solo per misurare forme di morte cellulare in cui vi è perdita di integrità della membrana cellulare come la necrosi, la necrosi secondaria associata all'apoptosi tardiva, la necroptosi e la piroptosi21. Esistono alcune forme di morte cellulare regolata in cui la membrana cellulare rimane impermeabile almeno durante le prime fasi della morte cellulare, come l'apoptosi caspasi-dipendente. Tuttavia, questo protocollo potrebbe essere facilmente modificato per incorporare anche l'imaging di un reporter fluorescente con attività caspasi 3/722. Ciò fornirebbe ulteriori dati per aiutare a caratterizzare la specifica modalità di morte cellulare.
Abbiamo utilizzato il nostro protocollo per dimostrare l'interazione sinergica citotossica tra le citochine IFN-γ e TNF-α (Figura 2C), che abbiamo precedentemente riportato in pazienti CD-derived organoids 9,10. La rilevanza fisiologica di questa forma di sinergismo è stata dimostrata anche in modelli murini di linfoistiocitosi emofagocitaria e sepsi23. Diversi modelli e approcci matematici di riferimento sono stati implementati per quantificare la sinergia tra combinazioni di agenti biologici 24,25. Differiscono in termini di complessità, numero di fattori che considerano e soglia per considerare sinergica un'interazione24,25. Alcuni modelli richiedono una conoscenza preliminare degli agenti biologici testati, fanno determinate ipotesi sull'attività degli agenti e possono richiedere curve dose-risposta complete per ogni trattamento singolo e combinato25. Il metodo che abbiamo scelto per misurare la sinergia è una modifica del modello del coefficiente di interazione farmacologica (CDI), che è stato precedentemente utilizzato per misurare gli effetti inibitori delle combinazioni di farmaci chemioterapici sulla proliferazione delle linee cellulari tumorali26. Il CDI è un modello di indipendenza Bliss; nel calcolare l'effetto combinato previsto di due perturbagenti, l'indipendenza di Bliss assume che essi mirino a percorsi separati e abbiano meccanismi d'azione indipendenti27. Affinché un'interazione tra perturbageni sia sinergica, l'effetto combinato effettivo deve essere maggiore dell'effetto previsto. Questo modello è appropriato per la nostra configurazione sperimentale poiché IFN-γ e TNF-α sono noti per avere recettori e componenti di segnalazione a valle diversi. Inoltre, l'indipendenza di Bliss consente il calcolo di un coefficiente di interazione per quantificare il sinergismo e non richiede set di dati dose-risposta.
Ci sono alcuni fattori chiave che devono essere considerati per garantire risultati ottimali per questo protocollo. È importante che i colonoidi siano propagati ad alta densità (Figura 1Bi), che abbiano un diametro di circa 25-50 μm e che stiano proliferando attivamente prima di tentare di seminare le cellule. L'uso di colture non ottimali di colonoidi per i saggi può comportare un numero insufficiente di cellule, un basso recupero di colonoidi ed esperimenti incoerenti. Per ottenere risultati riproducibili, è anche importante seminare la densità dei colonoidi in modo coerente tra gli esperimenti. È stato precedentemente dimostrato che la risposta in vitro alle citochine infiammatorie può essere influenzata dalla densità di semina cellulare28,29. Un altro problema comune è la formazione di bolle d'aria nella cupola BME, che possono influenzare l'imaging. Questo può essere evitato utilizzando la tecnica del pipettaggio inverso. Questa tecnica si traduce anche in una semina più coerente.
Inoltre, se si esegue l'imaging di più punti temporali, preparare una condizione di tossicità massima per ogni punto temporale. Triton-X 100, un tensioattivo non ionico, è comunemente usato come controllo positivo (condizione di massima tossicità) per i saggi di citotossicità. L'aggiunta di Triton-X 100 lisa e uccide i colonoidi, consentendo al colorante fluorescente di morte cellulare di entrare nelle cellule. L'utilizzo di una condizione di tossicità massima da un punto temporale precedente comporterà una normalizzazione imprecisa e incoerente dei dati a causa del decadimento del segnale fluorescente nel tempo.
Un ultimo punto da considerare è la scelta del BME utilizzato per la coltura colonoide. Esistono diversi produttori commerciali di BME; tuttavia, per il nostro protocollo, abbiamo testato solo il marchio incluso nella Tabella dei Materiali. Un recente studio che ha utilizzato organoidi di cancro al pancreas derivati da pazienti ha scoperto che la fonte commerciale di BME altera i tassi di proliferazione cellulare, ma non ha avuto alcun effetto significativo sulla risposta ai farmaci chemioterapici o sull'espressione genica30. Con questo in mente, ci aspettiamo che l'andamento dei risultati sia simile tra i marchi BME per il nostro protocollo, ma consigliamo di utilizzare lo stesso marchio in modo coerente.
Abbiamo dimostrato come questo protocollo possa essere utilizzato per l'analisi della morte cellulare indotta da IFN-γ e TNF-α utilizzando colonoidi derivati da pazienti con CD. Gli organoidi intestinali derivati da pazienti sono un potente strumento per studiare la MC in quanto conservano molte caratteristiche della malattia, tra cui una maggiore sensibilità agli effetti citotossici del TNF-α31. Tuttavia, il protocollo potrebbe essere facilmente modificato per studiare gli effetti citotossici di perturbageni diversi dalle citochine o stati patologici diversi dall'IBD come il cancro del colon-retto (abbiamo testato con successo il protocollo utilizzando colonoidi non-IBD). Riteniamo che questo metodo sia utile per qualsiasi area di ricerca riguardante i meccanismi di morte cellulare, la funzione della barriera epiteliale o l'immunologia della mucosa intestinale.

L'epitelio intestinale crea una barriera fisica semipermeabile tra il contenuto del lume intestinale e i tessuti sottostanti. Per mantenere efficacemente questa barriera, le cellule epiteliali intestinali (IEC) subiscono un turnover cellulare estremamente elevato, con un ciclo continuo di morte e rigenerazione cellulare. Tuttavia, durante i disturbi infiammatori, come la malattia infiammatoria intestinale (IBD), si verificano livelli più elevati di morte cellulare aberrante1. Ciò può favorire un'interruzione della funzione di barriera e dell'attivazione del sistema immunitario, innescando un'ulteriore infiammazione. Nella malattia di Crohn (CD), una forma di IBD, è stato dimostrato che la segnalazione delle citochine contribuisce all'aumento dei livelli di morte per IEC2. Studiando come la segnalazione delle citochine induce la morte cellulare delle IEC, si spera che possano essere sviluppati trattamenti migliori per i pazienti con IBD e altri disturbi infiammatori intestinali1.
In biologia e nella ricerca sulla scoperta di bersagli farmacologici, la sinergia è generalmente intesa quando un sistema biologico trattato con combinazioni di stimoli individuali mostra una risposta alla combinazione che è maggiore degli effetti additivi combinati dei singoli stimoli da soli. È stato ben documentato che le interazioni sinergiche tra citochine guidano le risposte antivirali innate3. È anche noto che le citochine inducono sinergicamente la morte cellulare, anche nelle IEC4. Tuttavia, il ruolo sinergico della segnalazione citotossica delle citochine nei disturbi infiammatori intestinali come l'IBD è poco studiato.
Gli organoidi intestinali umani sono microtessuti 3D prodotti in vitro che vengono generati da cellule staminali epiteliali intestinali. Gli organoidi intestinali possono essere coltivati da biopsie della mucosa intestinale ottenute da pazienti con IBD e conservano molte caratteristiche della malattia 5,6. Gli organoidi hanno dimostrato di essere un sistema modello ideale per lo studio della citotossicità delle citochine nel contesto dell'infiammazione intestinale 7,8. In precedenza, il nostro gruppo ha caratterizzato gli effetti di uccisione sinergica delle citochine rilevanti per le IBD IFN-γ e TNF-α in organoidi del colon derivati da pazienti con MC (colonoidi)9,10. Tuttavia, gli esatti meccanismi coinvolti nella mediazione di questa forma di morte cellulare sinergica rimangono sfuggenti. Ci sono anche potenzialmente molte altre interazioni citotossiche citotossiche non caratterizzate che sono rilevanti per i disturbi infiammatori intestinali.
Sono disponibili diversi protocolli per studiare la morte cellulare negli organoidi intestinali 10,11,12,13; Tuttavia, ognuno di essi presenta degli svantaggi. Alcune di queste tecniche misurano solo la vitalità cellulare e non misurano direttamente la morte cellulare, non sono in grado di valutare le risposte di singoli organoidi o richiedono attrezzature costose e protocolli complessi. Sono necessarie metodologie robuste e semplici per quantificare la morte cellulare degli organoidi e le interazioni perturbagene negli organoidi intestinali. Il protocollo che presentiamo è un approccio semplice ed economico per misurare le risposte di singoli organoidi alle citochine citotossiche, ma può essere utilizzato per qualsiasi tipo di stimolo o perturbageno. Dimostriamo anche come utilizzare il modello di sinergia dell'indipendenza di Bliss per calcolare un coefficiente di interazione perturbagena (CPI) che descrive le interazioni citotossiche delle citochine.

<table><tbody>Soluzione <tr><td>avanzata DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML0788</td><td></td></tr><tr><td>BioRender</td><td>Science Suite Inc.</td><td>N/A</td><td>Software di illustrazione scientifica</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma-Merck</td><td>A2058</td><td>Essenzialmente privo di IgG, a basso contenuto di endotossine</td></tr><tr><td>B27 Integratore</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>Sigma-Merck</td><td>SML1046</td><td></td></tr><tr><td>Costar Piastre a pozzetti multipli trasparenti a 48 pozzetti trattate con TC, confezionate singolarmente, sterili</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di membrana basale Cultrex, tipo 2, Pathclear</td><td>R& D Systems</td><td>3532-010-02</td><td>Estratto di membrana basale</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Sigma-Merck</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Microscopio digitale a fluorescenza invertita</td><td>Invitrogen</td><td>AMF4300</td><td>Microscopio digitale a epifluorescenza invertita</td></tr><tr><td>EVOS 40x Obiettivo, fluorite, LWD, contrasto di fase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMEP4683</td><td>Obiettivo a fluorescenza 40x a lunga distanza</td></tr><tr><td>di lavoro Fiji/ImageJ (versione Windows)</td><td>Software open source</td><td>N/A</td><td>Software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Sigma-Merck</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di gentamicina</td><td>Sigma-Merck</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di dissociazione cellulare delicata</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td>Reagente di dissociazione cellulare senza enzimi</td></tr><tr><td>GlutaMAX-1</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>Integratore di dipeptide di L-alanil-L-glutammina</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5 (versione Windows)</td><td>Dotmatics</td><td>N/A Software</td> di <td>grafica e statistica</td></tr><tr><td>dati Greiner 15 mL Provetta da centrifuga in polipropilene, sterile con fondo conico e Tappo a vite</td><td>Cruinn</td><td>188261CI</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>EGF ricombinante umano (senza animali)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteina</td><td>Sigma-Merck</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Merck</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-05</td><td>Ampia gamma reagente antimicrobico</td></tr><tr><td>Nunc Edge 96-Well, Nunclon Delta-Treatated, Micropiastra a fondo piatto</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15543115</td><td></td></tr><tr><td>N2 integratore</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Proteina IFN-gamma umana ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>285-IF</td> Resuspend in TNF-alfa umano <td>ricombinante 0,1% filtrato sterile</td></tr><tr><td></td><td> D Systems</td><td>210-TA</td><td>Resuspend in PBS/BSA filtrato sterile 0,1%</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Merck</td><td>S7067</td><td></td></tr><tr><td>Tappo a scatto Provette per microcentrifuga a bassa ritenzione</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3451</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green Nucleic Acid Stain - 5 mM Soluzione in DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td>Colorante fluorescente per la morte cellulare, protegge dalla luce</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Merck</td><td>93420</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di Trypan Blue</td><td>Sigma-Merck</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>Reagente di dissociazione enzimatica</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>MedChemExpress</td><td>HY-10071</td><td>Inibitore di ROCK-I e ROCK-II</td></tr></tbody></table>

quantificazione della morte cellulare indotta da citochine in organoidi del colon umano mediante microscopia a fluorescenza dal vivo

Quantification of Cytokine-Induced Cell Death in Human Colonic Organoids Using Live Fluorescence Microscopy

La morte delle cellule epiteliali intestinali (IEC) è aumentata nei pazienti con malattie infiammatorie intestinali (IBD) come la colite ulcerosa (UC) e il morbo di Crohn (CD). Ciò può contribuire a difetti nella funzione della barriera intestinale, esacerbazione dell'infiammazione e immunopatogenesi della malattia. Le citochine e i ligandi del recettore della morte sono parzialmente responsabili di questo aumento della morte per IEC. Le citochine rilevanti per le IBD, come il TNF-α e l'IFN-γ, sono citotossiche per le IEC sia indipendentemente che in combinazione. Questo protocollo descrive un test semplice e pratico per quantificare la citotossicità indotta da citochine in organoidi del colon derivati da pazienti con CD utilizzando un colorante fluorescente per la morte cellulare (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), microscopia a fluorescenza dal vivo e software di analisi delle immagini open source. Dimostriamo anche come utilizzare il modello matematico di indipendenza di Bliss per calcolare un coefficiente di interazione perturbagena (CPI) basato sulla citotossicità degli organoidi. Il CPI può essere utilizzato per determinare se le interazioni tra combinazioni di citochine o altri tipi di perturbageni sono antagoniste, additive o sinergiche. Questo protocollo può essere implementato per studiare l'attività citotossica di citochine e altri perturbageni utilizzando organoidi del colon derivati da pazienti.

Utilizzando questo protocollo, abbiamo dimostrato come i colonoidi dei pazienti affetti da CD possano essere utilizzati per studiare gli effetti citotossici delle citochine rilevanti per le IBD IFN-γ e TNF-α sull'epitelio primario. Abbiamo utilizzato un colorante fluorescente per la morte cellulare disponibile in commercio (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), che può entrare solo nelle cellule che hanno una membrana cellulare compromessa dove viene poi attivato legandosi agli acidi nucleici. Abbiamo co-trattato i colonoidi con citochine e il colorante fluorescente per la morte cellulare e abbiamo eseguito l'imaging di cellule vive a 8 ore e 24 ore con un microscopio a epifluorescenza invertita. Le immagini rappresentative di trasmissione/sovrapposizione fluorescente a 8 ore indicano che solo i colonoidi trattati con IFN-γ + TNF-α sono positivi per il segnale fluorescente; tuttavia, c'è solo un piccolo numero di celle fluorescenti (Figura 2A). Il blebbing cellulare, un indicatore morfologico della morte cellulare20, può essere osservato anche nella condizione IFN-γ + TNF-α. A 24 ore, i colonoidi trattati con IFN-γ + TNF-α mostrano ampie regioni positive per il segnale fluorescente (Figura 2A). C'è anche una chiara rottura nella morfologia del colonide: il lume centrale non è più visibile e la barriera epiteliale è stata completamente interrotta.
Per quantificare il segnale del colorante di morte cellulare, abbiamo utilizzato un software di analisi delle immagini open source per calcolare l'intensità fluorescente di ciascun colonoide. Abbiamo quindi normalizzato i dati esprimendo la media di ciascuna condizione come percentuale del trattamento di massima tossicità. A 8 ore, la morte cellulare omeostatica o di fondo nei colonoidi di controllo BSA era relativamente bassa (7,7% della tossicità massima) (Figura 2B). Non ci sono stati cambiamenti statisticamente significativi nei livelli di morte cellulare in questo momento; tuttavia, le condizioni trattate con TNF-α mostrato un piccolo aumento della citotossicità (Figura 2B). Dopo 24 ore, i livelli di morte cellulare erano aumentati per tutte le condizioni trattate con citochine. Tuttavia, c'è stato un cambiamento minimo nella morte cellulare per la condizione di controllo BSA tra i punti temporali (7,5% della tossicità massima a 24 ore). I colonoidi trattati con IFN-γ + TNF-α hanno avuto il maggiore aumento dei livelli di morte cellulare rispetto al controllo BSA (29,4% della tossicità massima). La differenza nei livelli di morte cellulare tra il trattamento combinato e i trattamenti con citochine singole (IFN-γ, TNF-α) è stata molto significativa. Questi risultati suggeriscono la possibilità di un'interazione sinergica citotossica tra IFN-γ e TNF-α a 24 ore.
Abbiamo utilizzato il CPI per quantificare le interazioni citotossiche tra i trattamenti con citochine e per determinare se fossero sinergiche. Le interazioni tra citochine sono considerate sinergiche quando il valore CPI è &lt;1, additive quando =1 o antagoniste quando &gt;1. Abbiamo calcolato i valori dell'IPC per punto temporale (Figura 2C). A 8 ore, il valore dell'IPC indicava un leggero sinergismo (0,99), con il valore dell'IPC che diminuiva sostanzialmente a 24 ore (0,83). Questa analisi ha confermato che l'interazione tra IFN-γ e TNF-α a 24 ore era sinergica. Inoltre, illustra come in questo contesto la sinergia tra IFN-γ e TNF-α sia dipendente dal tempo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig01v2.jpg"> Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale e risoluzione dei problemi. (A) Panoramica schematica del protocollo. (B) Immagini rappresentative. (Bi) Immagine al microscopio ottico che illustra la densità ottimale della coltura e la dimensione ottimale dei colonoidi prima del passaggio per un test. Barra della scala = 500 μm. (Bii) Immagine al microscopio ottico che illustra la dimensione ottimale dei frammenti di colonoide dopo la dissociazione; Frammenti evidenziati in rosso. Barra della scala = 100 μm. (Biii) Immagine al microscopio ottico della morfologia del colonoide necrotico dopo trattamento MT (con Triton X-100). Barra della scala = 25 μm. (Biv) Immagine al microscopio ottico di due colonoidi sovrapposti sullo stesso piano focale. Barra della scala = 25 μm. (Bv) Immagine al microscopio ottico di detriti di cellule colonoidi presenti dopo il passaggio; detriti evidenziati in rosso. Barra della scala = 25 μm. Abbreviazioni: ROI = regione di interesse; MFI = intensità media della fluorescenza; MT = Tossicità massima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig01largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66759/66759fig02v2.jpg"> Figura 2: Analisi quantitativa della morte cellulare indotta da citochine nei colonoidi umani di CD. (A) Immagini rappresentative al microscopio dal vivo di colonoidi di CD trattati con SYTOX Green Nucleic Acid Stain (colorante fluorescente per la morte cellulare) e citochine a 8 ore e 24 ore; canali di trasmissione e GFP (colore verde) sovrapposti. I colonoidi sono stati trattati come segue: 1) PBS/BSA, 2) 10 ng/mL di IFN-γ, 3) 10 ng/mL di TNF-α, 4) 10 ng/mL di IFN-γ + 10 ng/mL di TNF-α. Barre della scala = 25 μm. (B) Analisi quantitativa di colonoidi CD trattati con il colorante fluorescente a morte cellulare e citochine a 8 e 24 ore; i dati sono espressi in % della condizione MT. N = 2 linee colonoidi CD, 11-16 colonoidi per condizione. (C) CPI calcolato per punto temporale utilizzando il set di dati da B, N = 2 linee colonoidi CD. I dati sono espressi come mezzi ± SE. In B, è stata eseguita l'analisi ANOVA a due vie seguita dai post-test di Bonferroni, *P &lt; 0,05, ***P &lt; 0,001 come indicato. Abbreviazioni: CD = Morbo di Crohn; GFP = proteina fluorescente verde; CPI = coefficiente di interazione perturbagena; PBS = soluzione salina tamponata con fosfato; BSA = albumina sierica bovina; TNF-α = fattore di necrosi tumorale-alfa; IFN-γ = interferone-gamma; MT = Tossicità massima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759fig02largev2.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tabella 1: Composizione dei terreni di coltura per il protocollo. Per preparare i terreni di proliferazione degli organoidi, combinare i terreni condizionati con L-WRN e i terreni senza siero 1:1, quindi aggiungere gli integratori. I terreni di proliferazione degli organoidi devono essere utilizzati entro 2 settimane dalla preparazione. Si prega di notare che tutti i supporti completi devono essere conservati a 4 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella 2: Layout sperimentale della piastra a 96 pozzetti e trattamenti con citochine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66759/66759_Table%202%20(1).xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>

Questo protocollo descrive un metodo semplice ed economico per studiare e quantificare la morte cellulare negli organoidi del colon umano in risposta a perturbageni citotossici come le citochine. L'approccio impiega un colorante fluorescente per la morte cellulare (SYTOX Green Nucleic Acid Stain), la microscopia a fluorescenza dal vivo e un software di analisi delle immagini open source per quantificare le risposte di singoli organoidi a stimoli citotossici.

Quantificazione della morte cellulare indotta da citochine in organoidi del colon umano mediante microscopia a fluorescenza dal vivo

Intestinal epithelial cell (IEC) death is increased in patients with inflammatory bowel diseases (IBD) such as ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease ...

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Quantificazione della morte cellulare indotta da citochine in organoidi del colon umano mediante microscopia a fluorescenza dal vivo

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