Diagnosi post-mortem della rabbia negli animali mediante il test di reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa in tempo reale LN34 aggiornato e multiplexato

La rabbia è fatale al cento per cento e una diagnosi rapida e accurata è necessaria per ottenere cure salvavita a chi ne ha più bisogno. Test di laboratorio affidabili sono davvero cruciali per il controllo della rabbia. Il CDC ha sviluppato un protocollo passo dopo passo per il test della rabbia tramite PCR quantitativo di trascrizione inversa o RT-PCR, utilizzando un test validato in tempo reale chiamato LN34, che consente ai laboratori di migliorare la precisione diagnostica e supportare gli sforzi di prevenzione della rabbia.

Per decenni, il test antirabbico si basava sui test diretti degli anticorpi a fluorescenza chiamati DFA o FAT. Tuttavia, molti laboratori internazionali utilizzano anche la RT-PCR per i test antirabbici grazie alla sua eccellente sensibilità e precisione. Il test DFA per la rabbia richiede microscopi specializzati, conservazione della catena fredda, formazione specializzata del personale e i reagenti hanno subito carenze negli ultimi anni; PCR e RT-PCR sono ora ampiamente utilizzati per i test dei patogeni.

Molti laboratori dispongono già di apparecchiature e competenze per PCR e RT-PCR, e i reagenti necessari sono disponibili presso fornitori commerciali. Il costo rappresenta un ostacolo importante ai test antirabbici nelle aree con il maggior numero di casi umani di rabbia. Il CDC ha sviluppato una forma multiplex del saggio LN34, che migliora i controlli di qualità e riduce il costo per campione testato.

La RT-PCR viene sempre più implementata per la diagnostica della rabbia perché è ampiamente utilizzata per testare altri patogeni e i risultati sono facili da interpretare. Ma usare un test validato è estremamente importante, e assicurarsi che il test funzioni come previsto è altrettanto fondamentale. Il nostro protocollo passo dopo passo include controlli di qualità, considerazioni di sicurezza e le migliori pratiche PCR per aiutare i laboratori a iniziare.

Per cominciare, indossa dispositivi di protezione individuale, inclusi occhiali di sicurezza, un camice chiuso davanti e due paia di guanti. Pulire e disinfettare la superficie di lavoro con un composto di ammonio quaternario o un altro disinfettante adatto per inattivare il virus della rabbia. Disponi un assorbente rivestito di plastica sul piano di lavoro, utilizzando un tessuto di raccolta pulito e monouso che rappresenta una sezione trasversale completa del tronco encefalico e del cervelletto.

Per l'omogeneizzazione e l'estrazione dell'RNA infine, tritano i tessuti necessari usando un bisturi monouso. Spalma il tessuto tritato con un tampone e trasferisci il tampone su un tubo pre-riempito con tampone di omogeneizzazione e perline. Dopo aver scartato il guanto esterno usando disinfettante QAC diluito 1:256, pulire e disinfettare la postazione di lavoro, le attrezzature e l'esterno dei tubi campione.

Omogeneizzare i campioni con un mini battitore per perline per 60 secondi. E ispeziona visivamente i tubi. Lascia riposare i campioni per cinque minuti a temperatura ambiente.

Infine, pulire e disinfettare la postazione di lavoro, le attrezzature e l'esterno dei tubi campione con disinfettante QAC prima di procedere all'estrazione dell'RNA. Per cominciare, eseguire la decontaminazione superficiale dell'armadio di sicurezza biologica utilizzando QAC diluito a 1:256. Esegui ulteriori pulizie per rimuovere polvere o altri contaminanti ambientali.

Stendi un pad assorbente foderato di plastica sulla piattaforma di lavoro. Poi, disposizionete i reagenti e i campioni nell'armadietto di biosicurezza. Disposizionete tutti i tubi di raccolta in una grigliera pulita per i tubi microcentrifughe.

Pre-riempire un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri con 300 microlitri di etanolo al 100% per ogni campione di cervello. Centrifugare i campioni di cervello omogeneizzati a 10.000-16.000 G per due minuti in una microcentrifuga da tavolo. Trasferire il supernatant rosa trasparente in un nuovo tubo sterile contenente 100% etanolo, pipettare su e giù per mescolare e trasferire 600 microlitri della miscela di sovrantantante etanolico a una colonna spin in un tubo di raccolta.

Centrifugare per un minuto finché il liquido non passa attraverso la colonna, eliminare il flusso e trasferire ogni colonna in un nuovo tubo di raccolta. Aggiungi 400 microlitri di tampone pre-lavaggio di RNA a ogni colonna. Centrifugare la miscela a 10.000-16.000 G per 30 secondi e scartare il flusso attraversato.

Riportare ogni colonna nello stesso tubo di raccolta e ripetere il passaggio di pre-lavaggio una seconda volta. Successivamente, aggiungi 700 microlitri di buffer di lavaggio RNA a ciascuna colonna. Centrifugare a 10.000-16.000 G per due minuti.

E trasferire con attenzione in un tubo senza RNasi. Scartare il flusso attraverso e il tubo di raccolta, poi rimuovere e scartare i guanti esterni. Ora aggiungi 50 microlitri di acqua senza DNasi e RNasi direttamente alla matrice della colonna e incuba per 30 secondi.

Poi centrifugare a 10.000-16.000 G per un minuto. Trasferire con cura l'RNA in un nuovo tubo microcentrifuga con appoggio a vite e con accesso piatto e etichettato per il test RT-PCR. Per cominciare, scongelare un tampone RT-PCR di un passaggio, senza controllo del modello, acqua priva di nucleasi, primer e sonde su ghiaccio, nello spazio di preparazione del master mix.

Posiziona un passo dell'enzima RT-PCR sul ghiaccio. Calcola il volume di ciascun reagente per i Master Mixes LN34 multiplexati e beta A. Designa i pozzi per ogni campione in triplicata per il saggio multiplexato LN34 utilizzando una mappa a 96 pozzi a piastra di modulo.

Dopo il vortexing e la rotazione, distribuire 23 microlitri di multiplex Master Mix LN34 in ogni pozzo LN34 assegnato. Per impostare reazioni di controllo del template negativo, aggiungere due microlitri di acqua di grado PCR in ogni pozzo di controllo del template negativo. Metti la piastra a 96 pozzi sul ghiaccio.

Pulisci la postazione con etanolo al 70%. Ora nello spazio di lavoro dell'edizione modello, campioni di RNA scongelati e aliquota monouso a controllo positivo di RNA artificiale su ghiaccio. Dopo il vortice, centrifugare brevemente i tubi contenenti campioni di RNA, pipette due microlitri di campione o RNA di controllo positivo nel pozzo corrispondente.

Dopo aver aggiunto tutti i campioni, posizionare il coperchio adesivo ottico sopra i pozzi per sigillarli completamente. Centrifuga la piastra a 500 G per un minuto a temperatura ambiente, inserisci la piastra sigillata in uno strumento PCR in tempo reale o quantitativo calibrato per die fam e VIC Hex reporter. Imposta lo strumento sui parametri di ciclo appropriati.

Dopo il completamento della corsa, imposta i valori di soglia a 0,2 per LN34 e 0,05 per beta actina. Controlla le curve di campione di controllo per eventuali problemi di qualità. Il saggio LN34 ha mostrato curve di amplificazione di successo con risultati positivi che superano la soglia a valori distinti delle soglie cicliche se osservato su scala logaritmica.

E curve di amplificazione sigmoide su scala lineare sia per LN34 che per beta actina. I risultati negativi mostravano linee piatte senza amplificazione. Sono state identificate curve di amplificazione anomale, alcune con aumenti lineari piuttosto che sigmoidali della fluorescenza, indicando risultati atipici.

I corrispondenti grafici multicomponente hanno mostrato segnali fluorescenti ondulati irregolari piuttosto che curve lisce attese. Sottolineando la necessità di analizzare i grafici di amplificazione invece di affidarsi solo ai valori delle soglie di ciclo.